Méthode de double coloration pour détecter la pectine dans l’interaction plante-champignon

Résumé

Ce protocole décrit une méthode microscopique pour détecter la pectine dans l’interaction café-champignon.

Résumé

Les cellules végétales utilisent différents mécanismes structurels, constitutifs ou inductibles, pour se défendre contre les infections fongiques. L’encapsulation est un mécanisme inductible efficace pour isoler l’haustoria fongique du protoplaste des cellules végétales. Inversement, la pectine, l’un des composants polymères de la paroi cellulaire, est la cible de plusieurs enzymes pectolytiques dans les interactions nécrotrophes. Ici, un protocole pour détecter la pectine et les hyphes fongiques par microscopie optique est présenté. L’encapsulation riche en pectine dans les cellules des feuilles de café infectées par le champignon de rouille Hemileia vastatrix et la modification de la paroi cellulaire mésophylle induite par Cercospora coffeicola sont étudiées . Les échantillons de feuilles lésionnées ont été fixés avec la solution de Karnovsky, déshydratés et incorporés dans du méthacrylate de glycol pendant 2 à 4 jours. Toutes les étapes ont été suivies par pompage sous vide pour éliminer l’air dans les espaces intercellulaires et améliorer le processus d’intégration. Les blocs incorporés ont été sectionnés en sections de 5 à 7 μm d’épaisseur, qui ont été déposées sur une lame de verre recouverte d’eau et ensuite chauffées à 40 ° C pendant 30 minutes. Ensuite, les lames ont été doublement colorées avec 5% de bleu de coton dans le lactophénol pour détecter le champignon et 0,05% de ruthénium rouge dans l’eau pour détecter la pectine (groupes acides d’acides polyuroniques de pectine). On a découvert que les haustoria fongiques d’Hemileia vastatrix étaient encapsulées par la pectine. Dans la cercosposporose du café, des cellules mésophylles ont présenté une dissolution des parois cellulaires, et des hyphes intercellulaires et des conidiophores ont été observés. La méthode présentée ici est efficace pour détecter une réponse associée à la pectine dans l’interaction plante-champignon.

Introduction

Les mécanismes de défense de la paroi cellulaire chez les plantes sont cruciaux pour contenir l’infection fongique. Des études ont rapporté des changements dans l’épaisseur et la composition de la paroi cellulaire depuis le^19ème siècle ^1,2. Ces changements peuvent être induits par un agent pathogène fongique qui stimule la formation d’une papille, ce qui empêche les champignons d’entrer dans la cellule ou pourrait être utilisé pour encapsuler les hyphes afin d’isoler le protoplaste de la cellule hôte de l’haustoria fongique. La production d’une barrière dynamique de la paroi cellulaire (c.-à-d. papilles et haustorium entièrement encastré) est importante pour favoriser la résistance des plantes³. Des études histopathologiques sur les maladies liées aux champignons ont étudié l’apparition de ces mécanismes et ont décrit les polymères de la paroi cellulaire, la cellulose, l’hémicellulose (arabinoxylanes) et le callose comme mécanismes de résistance à l’attaque fongique ^4,5,6,7.

La paroi cellulaire est la première barrière contre les attaques micro-organismes, altérant l’interaction plante-champignon. Les polysaccharides pectiques composent la paroi cellulaire et représentent environ 30% de la composition de la paroi cellulaire dans les cellules primaires des plantes eudicot dans lesquelles les homogalacturones sont le polymère le plus abondant (environ 60%)⁸. Le Golgi sécrète des composés complexes de pectine qui composent les chaînes d’acide galacturonique, qui peuvent ou non être méthylées ^8,9. Depuis 2012, la littérature a souligné que le degré d’estérification de la méthyle de pectine est essentiel pour déterminer la compatibilité lors de l’infection par des enzymes pectiques microbiennes 10,11,12. Ainsi, des protocoles sont nécessaires pour vérifier la présence et la distribution de composés pectiques dans les pathosystèmes plantes-champignons.

Diverses techniques ont été utilisées pour détecter l’encapsulation des papilles ou des haustoria. Les méthodes de référence utilisées sont la microscopie électronique à transmission (TEM) des tissus fixes et la microscopie optique des tissus vivants et fixes. En ce qui concerne la TEM, plusieurs études ont démontré le rôle structurel des appositions de paroi cellulaire dans la résistance fongique ^13,14,15,16, et que l’utilisation de lectines et d’anticorps est une méthode complexe pour localiser les polymères glucidiques¹⁶. Cependant, des études montrent que la microscopie optique est une approche importante et que les outils histochimiques et immunohistochimiques permettent de mieux comprendre la composition des papilles et de l’enveloppe haustorium ^6,7.

Les champignons pathogènes présentent deux principaux types de modes de vie: biotrophe et nécrotrophe. Les champignons biotrophes dépendent des cellules vivantes pour leur nutrition tandis que les champignons nécrotrophes tuent les cellules hôtes, puis vivent dans les tissus morts¹⁷. En Amérique latine, la rouille des feuilles de café, causée par le champignon Hemileia vastatrix, est une maladie importante dans les cultures de café^18,19. Hemileia vastatrix présente un comportement biotrophe et, parmi les changements structurels observés chez les espèces de café ou les cultivars résistants, une réponse d’hypersensibilité, un dépôt de callose, de cellulose et de lignine sur les parois cellulaires, ainsi qu’une hypertrophie cellulaire¹⁴ ont été rapportés. À la connaissance des auteurs, la littérature ne rapporte pas d’informations sur l’importance de la pectine dans la résistance à la rouille du café. D’autre part, les champignons nécrotrophes qui causent la cércospose ciblent la pectine via un ensemble d’enzymes associées à la dégradation de la paroi cellulaire, telles que les pectinases et la polygalacturonase²⁰. La cercosposporose dans le café, causée par le champignon Cercospora coffeicola est également une menace majeure pour les cultures de café^21,22. Ce champignon provoque des lésions nécrotiques dans les feuilles et les baies. Après pénétration, C. coffeicola colonise les tissus végétaux par les voies intracellulaires et intercellulaires 23,24,25.

Le présent protocole étudie la présence de structures fongiques et de pectine sur les parois cellulaires. Ce protocole est utile pour identifier la réponse végétale associée à la pectine (colorée avec du colorant rouge ruthénium, qui est spécifique aux groupes acides d’acides polyuroniques de pectine), induite par l’hôte dans une interaction biotrophique avec un champignon. Il aide également à vérifier l’effet des champignons nécrotrophes sur la dégradation des parois cellulaires pectiques. Les résultats actuels indiquent que la méthode de double coloration est efficace pour discriminer les structures et la phase de reproduction des champignons.

Protocole

1. Préparation de la solution tampon et des réactifs

1. Préparer un tampon de cacodylate de 2 M en ajoutant 4,28 g de cacodylate de sodium à 100 mL d’eau distillée et ajuster le pH à 7,25 avec 0,2 N HCl.
2. Préparer 100 mL de la solution fixative de Karnovsky en mélangeant 10 mL de glutaraldéhyde aqueux à 25 %, 10 mL de formaldéhyde aqueux à 10 %, 25 mL de tampon cacodylate 2 M et 0,5 mL de CaCl_{2 26} à ^0,5 M. Porter le volume à 100 mL avec de l’eau distillée.
   REMARQUE: La solution peut être conservée au réfrigérateur pendant 6 mois.
   ATTENTION : La solution tampon de cacodylate est toxique; par conséquent, manipulez la solution fixatrice dans une hotte ou dans un espace ouvert. Évitez d’inhaler les vapeurs de la solution et portez des gants lors de la manipulation.
3. Préparer la solution nutritive aqueuse hoagland en mélangeant les éléments suivants :₃ mM Ca(NO 3_)2,4H2 O, 2 mM NH₄H₂PO₄, 5 mM KH₂PO₄, 2 mM MgSO 4,7H₂O, 9,07 mM MnSO₄, 0,765 mM ZnSO_{4,7H 2}O, 46,4 mM H₃BO₃, 0,09 mM Na₂MoO₄. _H2O, 0,01 mM CuSO₄ et 36 mM FeSO_{4,7H 2}O sous forme de fer-EDTA (acide éthylènediamine tétraacétique)²⁷.

2. Échantillons de plantes et inoculation de champignons

REMARQUE: Pour les expériences sur les feuilles affectées par la rouille du café, cinq plants de café arabica cv âgés de 2 mois. Les catuaí ont été cultivés et conservés dans une serre au Centre de l’énergie nucléaire dans l’agriculture (CENA) de l’Université de São Paulo, Piracicaba, État de São Paulo, Brésil.

1. Cultivez des plants de café dans des pots en plastique de 500 mL remplis de solution nutritive aqueuse Hoagland (pH d’environ 5,5) pendant 4 mois dans une chambre de croissance maintenue à 27 ± 3 °C avec une photopériode de 12 h créée par des lampes LED au flux de photons de 250 photons μmol ^{s-1 m-2}. Remplacez la solution nutritive Hoagland chaque semaine pendant 4 mois.
2. Inoculer quatre feuilles expansées de cinq plantes sur leurs surfaces abaxiales avec 1 x 10³ H. vastatrix uredospores selon la méthode décrite à la référence²⁸. Après l’inoculation, gardez les plantes pendant 48 h dans l’obscurité en les recouvrant d’un sac en plastique noir. Récoltez les lésions 30 jours après l’inoculation.
3. Lésions caractéristiques de la récolte causées par Cercospora coffeicola de Coffea arabica cv. Plantes d’Obatã situées (coordonnées: -22.906506126269942, -47.015075902025266) à l’Institut biologique, Campinas, État de São Paulo, Brésil. Avant de traiter l’échantillon, analysez les lésions dans un stéréomicroscope pour vérifier la présence de C . coffeicola conidia de café. Ensuite, montez quelques diapositives avec les conidies pour confirmer l’étiologie de la maladie²².

3. Récolte, fixation et déshydratation des échantillons

1. À l’aide d’un scalpel et d’une pince à épiler, prélever un échantillon d’environ 10 mm² feuilles dans la région médiane de la lésion (taches jaunes; Graphique 1) et l’immerger dans 30 mL de solution fixatrice de Karnovsky (Figure 1 et Figure 2A). L’étape de fixation peut avoir lieu dans un réfrigérateur pendant 48 h.
2. Pendant au moins quatre fois, soumettre l’échantillon de feuilles à un vide faible (500-600 mBar) à l’aide d’une pompe à huile pendant 15 minutes chacune pour augmenter la perméabilité de la solution fixatrice dans le tissu foliaire. Effectuez cette étape avec rotation de l’échantillon (Figure 1).
3. Après fixation, laver l’échantillon de feuilles trois fois dans un tampon cacodylate de 0,5 M (pH 7,2) dilué dans de l’eau distillée pendant 5 min chacun, puis le transférer dans une série éthanolique graduée (30 %, 50 %, 70 %, 90 % (2x) et 100 % (2x)) pendant 15 min à chaque concentration d’éthanol (figure 1 et figure 2B).

4. Procédure d’intégration d’Historesin

1. Transférer progressivement les échantillons en méthacrylate de glycol (GMA) en trois étapes, en suivant les instructions du fabricant. Tout d’abord, faites la solution A en mélangeant la poudre de GMA (1 g) avec 100 mL de résine de base (kit d’historésine; Tableau des matériaux) sous agitation magnétique, puis suivez les étapes ci-dessous.
   1. Immerger les échantillons dans la Solution A 1:2 : 100% éthanol pendant 3 h.
   2. Immerger les échantillons dans la Solution A 1:1 : 100 % d’éthanol pendant 3 h.
   3. Immergez les échantillons dans une résine de base pure pendant 2 à 4 jours. Au cours de cette étape, soumettez les échantillons à un vide faible au moins quatre fois par jour pendant 15 minutes, suivi d’une rotation.

5. Polymérisation

REMARQUE: Le processus de polymérisation nécessite des moules en plastique de 1,2 mL, de la résine de base et un durcisseur (voir le tableau des matériaux pour les détails du kit commercial).

1. Mélanger 15 mL de solution A (étape 4.1) avec 1 mL du durcisseur dans un bécher avec rotation pendant 2 min pour produire la solution de polymérisation (solution B).
2. Mettre 1,2 mL de la solution de polymérisation (Solution B) dans des moules en plastique. À l’aide d’un pic en bois, transférer les échantillons de feuilles lésionnées de la résine de base pure à la solution B (figure 2C). Évitez d’utiliser une pince à épiler car elles peuvent provoquer un écrasement des tissus.
3. Assurez-vous d’orienter rapidement les échantillons de feuilles perpendiculairement aux moules en plastique car la solution B devient rapidement visqueuse en 5 minutes. Plus d’un échantillon de feuilles sectionnées peut être placé dans un seul moule.
   REMARQUE: Il est recommandé de pratiquer l’étape ci-dessus plusieurs fois avant de demander de nombreux échantillons. Lorsqu’il y a beaucoup d’échantillons, le temps de polymérisation est différent entre les moules et l’orientation perpendiculaire des échantillons de feuilles peut être difficile à réaliser.
4. Lorsque l’orientation perpendiculaire des échantillons de feuilles est atteinte, attendez 30 minutes, puis transférez le moule en plastique dans une chambre en plastique ou en verre contenant du gel de silice pour éviter l’humidité. Attendez 2-3 h pour la polymérisation.
5. Une fois que la résine et l’échantillon de feuille sont polymérisés après la période de 2-3 h, détachez le bloc résultant du moule en plastique en ponçant la base du bloc avec une lime de ponçage. Ensuite, collez le bloc sur un morceau de bois (Figure 2D).

6. Sectionnement

1. À l’aide d’un microtome rotatif équipé de lames en acier de 8 cm (Figure 2E), coupez le bloc en sections de 5 μm d’épaisseur. Placez les sections sur des lames de verre recouvertes d’eau distillée. Transférer les lames avec les sections flottant au-dessus de l’eau sur une plaque chauffante à 40 °C pour sécher et favoriser l’adhérence des sections aux lames de verre.
2. Après séchage (Figure 2F), étiquetez les lames de verre avec le nom de référence du bloc et le numéro de la diapositive.

7. Processus de double coloration

1. Couvrir les sections avec 2 mL de bleu de coton à 5 % de lactophénol (40 % de glycérol, 20 % de phénol et 20 % d’acide lactique dans de l’eau) et les chauffer sur une plaque chauffante à 45 °C pendant 5 min (Figure 3A).
2. Enlevez l’excès de colorant en lavant la lame trois fois dans un bécher rempli d’eau distillée (Figure 3B-D).
3. Tacher avec 2 mL de 0,01 % de ruthénium rouge dans l’eau pendant 1 min (Figure 3E).
4. Enlevez l’excès de colorant en lavant la lame trois fois dans un bécher rempli d’eau distillée (Figure 3F,G).
5. Placez une goutte d’eau distillée sur les sections et couvrez les sections avec un couvercle de 24 mm x 60 mm pour effectuer une analyse par microscopie optique.

Résultats

La coloration au lactophénol bleu coton sur la section incorporée au GMA a révélé la présence de plusieurs structures fongiques entre et à l’intérieur des cellules mésophylles du café dans les interactions fongiques biotrophes et nécrotrophes.

Dans le pathosystème biotrophique, lorsqu’il est coloré à l’aide de la méthode de double coloration, les hyphes d’Hemileia vastatrix contenant des parois cellulaires et la teneur dense en protoplastes apparaissent en bleu ...

Discussion

Le présent travail introduit un test histochimique alternatif à double coloration pour étudier la composition en pectine des parois cellulaires qui encapsule l’haustoria dans un pathosystème biotrophique. L’objectif est également de démontrer l’efficacité de la méthode pour détecter les champignons nécrotrophes et les changements de paroi cellulaire induits par celui-ci. Ici, la pectine des parois cellulaires du parenchyme du café peut encapsuler à la fois le cou et l’haustorium du champignon de rouil...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blades DB80 HS	Leica	14035838383	Sectioning
Cacodylate buffer	EMS	# 11652	Fixation
Cotton Blue Lactophenol	Metaquímica	70SOLSIG024629	Staining
Formaldehyde	EMS	#15712	Fixation
Glutaraldehyde	EMS	#16216	Fixation
Historesin Kit	Technovit /EMS	#14653	Historesin for embedding
Hot plate	Dubesser	SSCD25X30-110V	Staining
Microscopy	Zeiss	#490040-0030-000	Image capture
Microtome (Leica RM 2540)	Leica	149BIO000C1 14050238005	Sectioning
Plastic molding cup tray	EMS	10176-30	Staining
Ruthenium red	LABHouse	#006004	Staining
Software Axion Vision	Zeiss	#410130-0909-000	Image capture
Vaccum pump	Prismatec	131 TIPO 2 V.C.	Fixation