用于组织诊断的小鼠脑实时双色受激拉曼散射成像

摘要

受激拉曼散射（SRS）显微镜是一种功能强大、无损且无标记的成像技术。一种新兴应用是刺激拉曼组织学，其中蛋白质和脂质拉曼转变处的双色SRS成像用于生成假苏木精和曙红图像。在这里，我们演示了用于组织诊断的实时双色SRS成像方案。

摘要

受激拉曼散射（SRS）显微镜已成为一种用于组织诊断的强大光学成像技术。近年来，双色SRS已被证明能够提供苏木精和曙红（H&E）等效的图像，从而可以快速可靠地诊断脑癌。这种能力使令人兴奋的术中癌症诊断应用成为可能。组织的双色SRS成像可以使用皮秒或飞秒激光源完成。飞秒激光器具有支持灵活成像模式的优势，包括快速高光谱成像和实时双色SRS成像。具有啁啾激光脉冲的光谱聚焦方法通常与飞秒激光器一起使用，以实现高光谱分辨率。

双色SRS采集可通过正交调制和锁相检测实现。脉冲啁啾、调制和表征的复杂性是该方法广泛采用的瓶颈。本文提供了一个详细的协议，以演示光谱聚焦SRS的实现和优化，以及在外延模式下小鼠脑组织的实时双色成像。该协议可用于广泛的SRS成像应用，这些应用利用了SRS的高速和光谱成像能力。

引言

传统的组织诊断依赖于染色方案，然后在光学显微镜下进行检查。病理学家使用的一种常见染色方法是H&E染色：苏木精将细胞核染色为紫蓝色，曙红将细胞外基质染色为粉红色。这种简单的染色仍然是许多组织诊断任务的病理学的金标准，特别是癌症诊断。然而，H&E组织病理学，特别是在术中环境中使用的冷冻切片技术，仍然存在局限性。染色过程是一个费力的过程，涉及组织包埋，切片，固定和染色¹。典型的周转时间为20分钟或更长时间。当一次处理多个切片时，在冷冻切片期间执行H&E有时会变得更具挑战性，因为需要在3D中评估细胞特征或生长模式以进行边缘评估。此外，术中组织学技术需要熟练的技术人员和临床医生。在许多情况下，许多医院董事会认证的病理学家数量的限制是术中咨询的一个限制因素。随着数字病理学和基于人工智能的诊断的快速发展兴趣，这种局限性可能会得到缓解².然而，根据技术人员的经验，H&E染色结果是可变的，这给基于计算机的诊断带来了额外的挑战²。

这些挑战可以通过无标记光学成像技术来解决。其中一种技术是SRS显微镜。SRS 使用同步脉冲激光器（泵浦和斯托克斯）以高效率激发分子振动³.最近的报告表明，蛋白质和脂质的SRS成像可以产生具有完整新鲜组织的H&E等效图像（也称为刺激拉曼组织学或SRH），这绕过了任何组织处理的需要，....

研究方案

所有实验动物程序均根据华盛顿大学动物护理和使用委员会研究所（IACUC）批准的协议（#4395-01）使用200μm，固定，切片的小鼠大脑进行。野生型小鼠（C57BL / 6J菌株）用CO₂安乐死。然后，进行开颅手术以提取他们的大脑以固定在磷酸盐缓冲盐水中的4%多聚甲醛中。将大脑嵌入3%琼脂糖和0.3%明胶混合物中，并通过振动切片机切片成200μm厚的切片。

1. 初始对齐

注：确保光束尺寸和两个臂的发散度匹配，以获得最佳灵敏度和分辨率。在泵浦和斯托克斯光束进入激光扫描显微镜之前，将其准直并调整其尺寸。为此，请先对每束光束使用一对消色差透镜，然后再将它们组合在二向色镜上。始终佩戴适当的激光护目镜进行光束对准。

1. 光束准直
   1. 为泵浦光束安装一对消色差透镜。作为起点，使用100 mm镜头和200 mm镜头将激光束尺寸放大2倍。确保两个镜头的距离约为 300 mm。通过两个透镜的中心对齐泵浦光束。
   2. 在第二个透镜后放置一面镜子，将光束朝向墙壁（>1米远）。远距离发送光束时要小心。使用红外卡跟踪从镜子到墙壁的光束，并检查光束的大小是否发生变化。如果光束的大小随距离而变化，则准直光束。
      1. 如果光束正在会聚（随着传播而减小尺寸），请将两个透镜移近。
      2. 如果光束发散（随着传播而增加尺寸），请将....

结果

优化光谱分辨率：
通过材料的色散受色散介质（长度和材料）和波长的影响。改变色散棒长度会影响光谱分辨率和信号尺寸。这是一种给予和接受的关系，可以根据应用的不同而进行不同的权衡。视杆将光束脉冲从频率宽、时间窄到频率窄、时间宽拉伸。 图7 显示了改变棒长度对光谱分辨率的影响。 图7A 显示光谱分辨率非常差;这种设?.......

讨论

该协议中介绍的双色SRS成像方案取决于单色SRS成像的正确实施。在单色SRS成像中，关键步骤是空间对准、时间对准、调制深度和相移。在空间上，两个光束的组合是通过二向色镜完成的。在将光束发送到二向色镜时，使用几个转向镜进行微调。一旦光束与二向色镜组合，就可以通过用镜子选择组合光束路径以发送到>1 m外的墙壁来确认空间对齐，同时检查组合光束以查看它是否与IR卡重叠。通过显?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-100-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm
20 MHz bandpass filter	Minicircuits	BBP-21.4+	Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 Ω
200 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-200-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm
Achromatic Half Waveplate	Union Optic	WPA2210-650-1100-M25.4	Broadband half waveplate
Achromatic Quarter Waveplate	Union Optic	WPA4210-650-1100-M25.4	Broadband quarter waveplate
Beam Sampler	THORLABS	BSN11	10:90 Plate Beamsplitter
Dichroic Mirror	THORLABS	DMSP1000	Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	472301	Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.
Electrooptic Amplitude Modulator	THORLABS	EO-AM-NR-C1	Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.
False H&E Staining Script	Matlab		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer	PRL-414B	Pulse Research Lab	1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in
Fast Photodiode	THORLABS	DET10A2	Si Detector, 1 ns Rise Time
Frequency Divider	PRL-220A	Pulse Research Lab	TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.
Highly Dispersive Glass Rods	Union Optic	CYLROD01	High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm
Insight DS+	Newport		Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz.
Lock-in Amplifier	Liquid Instruments	Moku Lab	Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.
Mirrors	THORLABS	BB05-E03-10	Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.
Motorized Delay Stage	Zaber	X-DMQ12P-DE52	Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.
Oil Immersion Condensor	Nikon	CSC1003	1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used.
Oscilloscope	Tektronix	TDS7054	Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.
Phase Shifter	SigaTek	SF50A2	For shifting the phase of the modulation frequency
Photodiode	Hamamatsu Corp	S3994-01	Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.
Polarizing Beam Splitter	Union Optic	PBS9025-620-1000	Broadband polarizing beamsplitter
Refactive Index Database			refractiveindex.info
Retro-reflector	Edmund Optics	34-408	BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.
RF Power Amplifier	Minicircuits	ZHL-1-2W+	Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors	Cambridge Technologies	6215H	We used a 5mm mirror set with silver coating
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	Laser scanning microscope control software
Shortpass Filter	THORLABS	FESH1000	25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.
Upright Microscope	Nikon	Eclipse FN1	Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.
Water Immersion Objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.