Echtzeit-, zweifarbige stimulierte Raman-Streubildgebung des Mausgehirns für die Gewebediagnose

Zusammenfassung

Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) ist eine leistungsstarke, zerstörungsfreie und markierungsfreie Bildgebungstechnik. Eine aufkommende Anwendung ist die stimulierte Raman-Histologie, bei der die zweifarbige SRS-Bildgebung an den Protein- und Lipid-Raman-Übergängen verwendet wird, um Pseudo-Hämatoxylin- und Eosin-Bilder zu erzeugen. Hier demonstrieren wir ein Protokoll für die zweifarbige SRS-Bildgebung in Echtzeit für die Gewebediagnose.

Zusammenfassung

Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) hat sich zu einem leistungsstarken optischen Bildgebungsverfahren für die Gewebediagnose entwickelt. In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass zweifarbiges SRS in der Lage ist, Hämatoxylin und Eosin (H & E) -äquivalente Bilder zu liefern, die eine schnelle und zuverlässige Diagnose von Hirntumoren ermöglichen. Diese Fähigkeit hat aufregende intraoperative Krebsdiagnoseanwendungen ermöglicht. Die zweifarbige SRS-Bildgebung von Gewebe kann entweder mit einer Pikosekunden- oder Femtosekunden-Laserquelle durchgeführt werden. Femtosekundenlaser haben den Vorteil, dass sie flexible Bildgebungsmodi ermöglichen, einschließlich schneller hyperspektraler Bildgebung und zweifarbiger SRS-Bildgebung in Echtzeit. Ein spektraler Fokussierungsansatz mit chirped Laserpulsen wird typischerweise mit Femtosekundenlasern verwendet, um eine hohe spektrale Auflösung zu erreichen.

Die Zwei-Farben-SRS-Erfassung kann mit orthogonaler Modulation und Lock-in-Erkennung realisiert werden. Die Komplexität des Pulschirpens, der Modulation und der Charakterisierung ist ein Engpass für die weit verbreitete Einführung dieser Methode. Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll, um die Implementierung und Optimierung von spektral fokussierendem SRS und der zweifarbigen Echtzeitbildgebung von Hirngewebe der Maus im Epi-Modus zu demonstrieren. Dieses Protokoll kann für eine breite Palette von SRS-Bildgebungsanwendungen verwendet werden, die die Hochgeschwindigkeits- und spektroskopische Bildgebungsfähigkeit von SRS nutzen.

Einleitung

Die traditionelle Gewebediagnostik stützt sich auf Färbeprotokolle, gefolgt von einer Untersuchung unter einem optischen Mikroskop. Eine gängige Färbemethode, die von Pathologen verwendet wird, ist die H & E-Färbung: Hämatoxylin färbt Zellkerne in einem violetten Blau und Eosin färbt die extrazelluläre Matrix und das Zytoplasma rosa. Diese einfache Färbung bleibt der Goldstandard in der Pathologie für viele Aufgaben der Gewebediagnose, insbesondere für die Krebsdiagnose. Die H & E-Histopathologie, insbesondere die gefrorene Schnitttechnik, die in einer intraoperativen Umgebung verwendet wird, hat jedoch immer noch Einschränkungen. Das Färbeverfahren ist ein mühsamer P....

Protokoll

Alle experimentellen Tierverfahren wurden mit 200 μm, festsitzenden, geschnittenen Mäusegehirnen gemäß dem Protokoll (# 4395-01) durchgeführt, das vom Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Washington genehmigt wurde. Wildtyp-Mäuse (C57BL/6J-Stamm) werden mit CO₂ eingeschläfert. Dann wird eine Kraniotomie durchgeführt, um ihr Gehirn zur Fixierung in 4% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung zu extrahieren. Die Gehirne sind in eine Mischung aus 3% Agarose und 0,3% Gelatine eingebettet und durch ein Vibratom in 200 μm dicke Scheiben geschnitten.

1. Anfängliche Ausrichtung<....

Ergebnisse

Optimierung der spektralen Auflösung:
Die Ausbreitung durch ein Material wird durch das dispersive Medium (Länge und Material) und die Wellenlänge beeinflusst. Eine Änderung der Dispersionsstablänge wirkt sich auf die spektrale Auflösung und die Signalgröße aus. Es handelt sich um eine Geben-Nehmen-Beziehung, die je nach Anwendung unterschiedlich abgewogen werden kann. Die Stäbe strecken den Strahlpuls von breit in der Frequenz und schmal in der Zeit zu eng in der Frequenz und breit in der Ze.......

Diskussion

Das in diesem Protokoll vorgestellte zweifarbige SRS-Bildgebungsschema hängt von der ordnungsgemäßen Implementierung der einfarbigen SRS-Bildgebung ab. Bei der einfarbigen SRS-Bildgebung sind die kritischen Schritte die räumliche Ausrichtung, die zeitliche Ausrichtung, die Modulationstiefe und die Phasenverschiebung. Die räumliche Kombination der beiden Balken wird durch einen dichroitischen Spiegel erreicht. Mehrere Lenkspiegel werden zur Feineinstellung verwendet, wenn die Strahlen zum dichroitischen Spiegel gesch.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-100-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm
20 MHz bandpass filter	Minicircuits	BBP-21.4+	Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 Ω
200 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-200-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm
Achromatic Half Waveplate	Union Optic	WPA2210-650-1100-M25.4	Broadband half waveplate
Achromatic Quarter Waveplate	Union Optic	WPA4210-650-1100-M25.4	Broadband quarter waveplate
Beam Sampler	THORLABS	BSN11	10:90 Plate Beamsplitter
Dichroic Mirror	THORLABS	DMSP1000	Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	472301	Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.
Electrooptic Amplitude Modulator	THORLABS	EO-AM-NR-C1	Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.
False H&E Staining Script	Matlab		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer	PRL-414B	Pulse Research Lab	1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in
Fast Photodiode	THORLABS	DET10A2	Si Detector, 1 ns Rise Time
Frequency Divider	PRL-220A	Pulse Research Lab	TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.
Highly Dispersive Glass Rods	Union Optic	CYLROD01	High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm
Insight DS+	Newport		Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz.
Lock-in Amplifier	Liquid Instruments	Moku Lab	Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.
Mirrors	THORLABS	BB05-E03-10	Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.
Motorized Delay Stage	Zaber	X-DMQ12P-DE52	Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.
Oil Immersion Condensor	Nikon	CSC1003	1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used.
Oscilloscope	Tektronix	TDS7054	Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.
Phase Shifter	SigaTek	SF50A2	For shifting the phase of the modulation frequency
Photodiode	Hamamatsu Corp	S3994-01	Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.
Polarizing Beam Splitter	Union Optic	PBS9025-620-1000	Broadband polarizing beamsplitter
Refactive Index Database			refractiveindex.info
Retro-reflector	Edmund Optics	34-408	BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.
RF Power Amplifier	Minicircuits	ZHL-1-2W+	Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors	Cambridge Technologies	6215H	We used a 5mm mirror set with silver coating
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	Laser scanning microscope control software
Shortpass Filter	THORLABS	FESH1000	25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.
Upright Microscope	Nikon	Eclipse FN1	Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.
Water Immersion Objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.