組織診断のためのマウス脳のリアルタイム、2色刺激ラマン散乱イメージング

要約

刺激ラマン散乱(SRS)顕微鏡は、強力で非破壊的でラベルフリーのイメージング技術です。新しい用途の1つは刺激ラマン組織学であり、タンパク質および脂質ラマン遷移における2色SRSイメージングを使用して、擬似ヘマトキシリンおよびエオジン画像を生成する。ここでは、組織診断のためのリアルタイムの2色SRSイメージングのためのプロトコルを実証します。

要約

刺激ラマン散乱(SRS)顕微鏡は、組織診断のための強力な光学イメージング技術として浮上している。近年、2色SRSは、脳腫瘍の迅速かつ信頼性の高い診断を可能にするヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)と同等の画像を提供できることが示されている。このような能力により、刺激的な術中がん診断アプリケーションが可能になりました。組織の2色SRSイメージングは、ピコ秒またはフェムト秒レーザー光源のいずれかで行うことができます。フェムト秒レーザには、高速ハイパースペクトルイメージングやリアルタイムの2色SRSイメージングなど、柔軟なイメージングモードを可能にするという利点があります。チャープレーザーパルスによるスペクトル集束アプローチは、通常、高いスペクトル分解能を達成するためにフェムト秒レーザーで使用されます。

直交変調とロックイン検出により、2色SRS集録を実現できます。パルスチャーピング、変調、および特性評価の複雑さは、この方法の広範な採用のボトルネックです。この記事では、スペクトル集束SRSとエピモードでのマウス脳組織のリアルタイム2色イメージングの実装と最適化を実証するための詳細なプロトコルを提供します。このプロトコルは、SRSの高速および分光イメージング機能を活用する幅広いSRSイメージングアプリケーションに使用できます。

概要

従来の組織診断は、染色プロトコルに続いて光学顕微鏡下での検査に依存していました。病理学者によって使用される1つの一般的な染色方法はH&E染色である:ヘマトキシリンは細胞核を紫がかった青色に染色し、エオジンは細胞外マトリックスおよび細胞質をピンク色に染色する。この単純な染色は、多くの組織診断タスク、特に癌診断のための病理学におけるゴールドスタンダードのままです。しかし、H&E組織病理学、特に術中設定で使用される凍結切片化技術には、依然として限界があります。染色手順は、組織の埋め込み、切片化、固定、および染色¹を含む面倒なプロセスである。一般的な所要時間は 20 分以上です。凍結切片化中にH&Eを実行することは、マージン評価のために細胞の特徴または成長パターンを3Dで評価する必要があるため、複数の切片が一度に処理される場合、より困難になることがあります。さらに、術中の組織学的技術は、熟練した技術者および臨床医を必要とする。多くの病院における理事会認定病理学者の数の制限は、多くの場合、術中診療の制約である。このような制限は、デジタル病理学および人工知能ベースの診断²における急速な発展の関心によって緩和され得る。しかし、H&E染色の結果は技術者の経験に応じて変動するため、コンピュータベースの診断にはさらなる課題があります²。

これらの課題は、ラベルフリーの光学イメージング技術で対処できる可能性があります。そのような技術の1つはSRS顕微鏡法である。SRSは、同期パルスレーザー(ポンプとストークス)を使用して、分子振動を高効率で励起します³。最近の報告では、タンパク質および脂質のSRSイメージングが、無傷の新鮮な組織を有するH&Eと同等の画像(刺激ラマン組織学またはSRHとしても知られる)を生成することができ、これは組織処理の必要性をバイパスし、診断に必要な時間を大幅に短縮し、術中に適応させることを実証している⁴。さらに、SRS画像化は、2D画像が不十分な場合に診断のための追加情報を提供する3D画像を提供する⁵。SRHは偏りがなく、コンピュータベースの診断に容易に利用可能なデジタル画像を生成します。これは、術中のがん診断および腫瘍マージン分析、特に脳腫瘍^6,7,8における可能な解決策として急速に浮上している。より最近では、組織の化学変化のSRSイメージングは、臨床医が異なる癌タイプまたはステージ⁹を層別化するのにさらに役立つ有用な診断情報を提供することも示唆されている。

組織診断アプリケーションにおけるその途方もない可能性にもかかわらず、SRSイメージングは、超高速レーザー、レーザー走査顕微鏡、および洗練された検出エレクトロニクスを含むイメージングプラットフォームに関連する複雑さのために、光学に特化した学術研究室にほとんど限られています。このプロトコルは、リアルタイムの2色SRSイメージングとマウス脳組織からの疑似H&E画像の生成のための一般的なフェムト秒レーザー光源の使用を実証する詳細なワークフローを提供します。プロトコルでは、次の手順について説明します。

アライメントとチャープの最適化
ほとんどのSRSイメージング方式では、励起源としてピコ秒レーザまたはフェムト秒レーザを使用します。フェムト秒レーザでは、レーザの帯域幅はラマン線幅よりもはるかに大きくなります。この制限を克服するために、スペクトル集束アプローチを用いて、フェムト秒レーザをピコ秒タイムスケールにチャープして、狭いスペクトル分解能¹⁰を達成する。最適なスペクトル分解能は、時間的チャープ(グループ遅延分散または単に分散とも呼ばれる)がポンプとストークスレーザに対して適切に一致している場合にのみ達成されます。ここでは、高分散ガラス棒を使用してレーザービームの分散を最適化するために必要なアライメント手順と手順を示します。

周波数校正
スペクトル集束SRSの利点は、ポンプとストークスレーザの間の時間遅延を変更することによって、ラマン励起を迅速に調整できることです。このような同調は、レーザー波長の同調と比較して、高速イメージングと信頼性の高いスペクトル取得を可能にします。ただし、励起周波数と時間遅延の線形関係には外部較正が必要です。既知のラマンピークを有する有機溶媒は、スペクトル集束SRSのためのラマン周波数を較正するために使用される。

リアルタイム、2 色イメージング
組織診断アプリケーションでは、大きな組織標本の解析に必要な時間を短縮するために、イメージング速度を上げることが重要です。脂質とタンパク質の同時2色SRSイメージングにより、レーザーや時間遅延を調整する必要がなくなり、イメージング速度が2倍以上向上します。これは、ロックインアンプ¹¹による新規な直交変調技術およびデュアルチャネル復調を使用することによって達成される。このホワイトペーパーでは、直交変調とデュアルチャンネル画像集録のプロトコルについて説明します。

エピモードSRSイメージング
現在までに示されたSRS撮像の大部分は、伝送モードで行われている。エピモードイメージングは、組織¹²から後方散乱光子を検出する。病理学的用途では、外科標本は非常に大きくなり得る。透過モードイメージングの場合、組織切片化がしばしば必要であり、これは望ましくないことに余分な時間を必要とする。対照的に、エピモードイメージングは、無傷の外科標本で作業することができます。後方散乱光の収集にも同じ対物レンズを使用するため、透過イメージングに必要な高数値開口コンデンサーを揃える必要もありません。エピモードは、骨など、組織切片化が困難な場合の唯一の選択肢でもあります。これまで、脳組織の場合、エピモードイメージングは^2mm13>の組織厚さに対して優れたイメージング品質を提供することを実証しました。このプロトコルは、偏光ビームスプリッタ(PBS)を使用して、組織によって偏光解除された散乱光子を収集します。カスタマイズされた検出器アセンブリ¹²の複雑さを犠牲にして、環状検出器を用いてより多くの光子を収集することができる。PBSアプローチは実装が簡単で(蛍光に似ています)、標準フォトダイオードはすでに伝送モード検出に使用されています。

擬似H&E画像生成
2色のSRS画像が収集されたら、H&E染色をシミュレートするために色を変更することができます。この論文は、病理学アプリケーションのために脂質およびタンパク質SRS画像を疑似H&E SRS画像に変換する手順を実証する。実験プロトコルは、高品質のSRS画像を生成するために必要な重要なステップを詳述しています。ここに示される手順は、組織診断に適用可能であるだけでなく、薬物画像化および代謝画像化^14,15などの他の多くのハイパースペクトルSRS画像化用途にも適合させることができる。

一般的なシステム要件
このプロトコルのレーザシステムは、2本の同期フェムト秒レーザビームを出力できなければなりません。システムは理想的には、レーザービームの1つの広い波長チューニングのための光学パラメトリック発振器(OPO)を備えています。このプロトコルのセットアップでは、2つのレーザー(1,040 nmの固定ビーム1つと、680 ~ 1,300 nmの範囲のOPOベースの調整可能なビーム)を80 MHzの繰り返しレートで出力する市販のレーザーシステムInsight DS+を使用します。SRSイメージングには、大手顕微鏡メーカーまたは自家製のレーザー走査顕微鏡を使用できます。利用される顕微鏡は、市販の直立顕微鏡フレームの上に構築された直立レーザー走査顕微鏡です。レーザービームをスキャンするために、5mmガルボミラーのペアが使用されます。自家製のレーザー走査顕微鏡を採用することを選択したユーザについては、レーザ走査顕微鏡¹⁶の構築のために以前に公開されたプロトコルを参照されたい。

プロトコル

すべての実験動物の手順は、ワシントン大学の動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されたプロトコル(#4395-01)に従って、200μmの固定された切片化されたマウス脳を用いて実施した。野生型マウス(C57BL/6J株)を_CO2で安楽死させる。次に、開頭術を行い、リン酸緩衝生理食塩水中の4%パラホルムアルデヒド中で固定するために脳を抽出する。脳を3%アガロースと0.3%ゼラチン混合物に埋め込み、ビブラートームによって厚さ200μmのスライスに切断する。

1. 初期アライメント

メモ: 最適な感度と解像度が得られるように、両アームのビームサイズと発散が一致していることを確認してください。ポンプとストークスビームをコリメートし、レーザー走査顕微鏡に入る前にサイズを調整します。これを行うには、ダイクロイックミラーでそれらを結合する前に、各ビームに一対の無彩色レンズを使用します。ビームアライメントのために、常に適切なレーザーゴーグルを着用してください。

1. ビームコリメーション
   1. ポンプビーム用の無彩色レンズのペアを取り付けます。出発点として、100mmレンズと200mmレンズを使用して、レーザービームサイズを2倍に拡大します。2 つのレンズの距離が約 300 mm であることを確認します。ポンプビームを両方のレンズの中心に合わせます。
   2. 2 番目のレンズの後に鏡を配置して、ビームを壁 (>1 m 離れた場所) に送ります。ビームを長距離に送るときは注意してください。IRカードで鏡から壁までのビームをトレースし、ビームのサイズが変化するかどうかを確認します。ビームのサイズが距離の関数として変化する場合は、ビームをコリメートします。
      1. ビームが収束している場合(伝搬に伴ってサイズが小さくなる場合)、2 つのレンズを近づけます。
      2. ビームが発散している場合(伝搬に伴ってサイズが大きくなる場合)、2つのレンズをさらに離します。ビームが平行になるまでの距離を調整します。
   3. ストークスビームに対して手順 1.1.1 と 1.1.2 を繰り返して、ビームを平行にします。
2. ビームサイズ調整
   1. ビームプロファイラが使用可能な場合は、各ビームのコリメートビームサイズを測定します。あるいは、IRカードと定規を使用してビームサイズを推定し、4〜5mmのビーム直径を得る。
   2. ビームサイズが小さすぎたり大きすぎたりする場合は、手順 1.1 で使用するレンズペアを変更します。両方のビームの直径が 4 ~ 5 mm になるまでレンズペアを調整します。
      注:ビームの倍率は、第2レンズと第1レンズの焦点距離の比(_f2/_f1)である。
3. 空間オーバーラップ
   注:SRSイメージングでは、分子振動を励起するために、両方のレーザービームを空間と時間で組み合わせる必要があります。スペクトル集束SRSイメージングの概略を 図1に示す。
   1. 調整のためにいくつかのステアリングミラーとダイクロイックミラーを取り付けることによって、2つのレーザービームを結合する。ポンプとストークスの空間的オーバーラップを最適化するには、ダイクロイックミラーの後のビームを遠く離れた2つの異なる位置(〜1 m)で監視します。ダイクロイックとダイクロイックミラーの前にステアリングミラーを繰り返し調整して、ストークスビームをポンプビームに合わせます。
      メモ: 2 つのビームが両方の位置で空間的に重なっている場合、それらは十分に重なっています。
   2. スキャンミラーが駐車位置にあるときにステアリングミラーのペアを調整して、結合ビームがレーザー走査顕微鏡のスキャンミラーの中央に送られることを確認します。両方のビームが顕微鏡対物レンズとコンデンサーの中心を通過することを確認します。
   3. 集光器の後、焦点距離がそれぞれ100mmと30mmの別のレンズペアを使用して、透過ビームをフォトダイオードに中継します。両方のビームがフォトダイオード内に含まれていることを確認し、変調されたストークスビームを遮断するために2つのローパスフィルタを取り付けます。

2. SRS信号検出

1. 電気光学変調(EOM)
   メモ: 20 MHz の EOM は、ストークス振幅の変調に使用されます。後述するように、EOMは直交変調に必要な80MHzのレーザパルス列から導出されます。他の変調周波数は、単色またはハイパースペクトルSRSのみを実行する場合に使用できます。その場合、変調周波数とレーザ周波数の同期は不要である。RFパワーアンプを備えた周波数発生器を使用してEOMを駆動することができます。その結果、ステップ 2.1.1 から 2.1.4 をスキップできます。
   1. ストークスビーム経路にビームサンプラーを配置してビームの10%をピックアップし、高速フォトダイオードに送信して80MHzパルス列を検出します。
      メモ:フォトダイオード信号は分周器に送られ、20MHzのTTL出力を生成します。この出力はさらにファンアウトバッファに送られ、出力を4つの同一の20MHz出力に複製します。出力の1つは、オシロスコープをトリガするために使用されます。
   2. ファンアウトバッファの出力の1つを取得し、バンドパスフィルタでフィルタリングして20MHzの正弦波を取得します。RFアッテネータを使用して、出力ピークツーピーク電圧を約500mVに調整します。
   3. 得られた出力を移相器に送信すると、電圧源でRF位相を微調整できます。この出力をRFパワーアンプに送信し、アンプの出力をEOMに接続します。
   4. ストークスビームのブロックを解除し、ビーム経路にフォトダイオードを配置してEOM1の変調深さを最適化します。変調深さ(谷間対ピーク比)が満足のいくものに見えるまでEOM電圧と1/4波長板を調整します。
      メモ: 20 MHz 変調(レーザ繰り返しレートの 1/4)では、50 ns ごとに 2 つのパルスが予想されます。
2. 時間的オーバーラップ
   注:ポンプとストークスの時間的なオーバーラップは、遅延ステージに取り付けられたレトロリフレクタで2つのレーザーパルス列の1つを遅らせることによって達成されます(図1 はストークスが遅延していることを示しています)。粗いオーバーラップはオシロスコープで監視され、細かいオーバーラップはSRS信号で監視されます。細かい時間的オーバーラップは、利用可能な場合、自己相関器を使用しても達成することができる。
   1. ダイクロイックミラーの後にフォトダイオードを配置し、レーザー光を検出します。最初にストークスビームをブロックします。オシロスコープのポンプパルスピークの1つを拡大します。垂直カーソルを置いて、このピークの時間的位置をオシロスコープでマークします。
   2. ポンプビームをブロックし、ストークスビームのブロックを解除します。遅延段を平行移動させて、オシロスコープのピーク位置を前のステップのマーク位置に時間的に一致させます。2 つのビームの時間的重なりの表示については、 図 2 を参照してください。
      1. (オプション)遅延段の平行移動が 2 つのビームを時間的に一致させるには不十分な場合は、遅延段を移動範囲の中央に移動します。
      2. 2 つのビームの時間差を測り、その差に光速を掛けて、2 つのビームを時間的に一致させるのに必要な距離を求めることで、2 つのビームを一致させるのに必要な遅延距離を計算します。
      3. 速いビームのビーム経路を長くするか、遅いビームのビーム経路を短くして、それに応じて時間的遅延をほぼ一致させる。
   3. DMSOと両面テープをスペーサーとして顕微鏡スライドサンプルを用意し、スライドとカバースリップの間にサンプルを保持する。
   4. カバースリップ側が顕微鏡対物レンズに面して顕微鏡上に試料を置きます。顕微鏡を明視野照明に変更し、接眼レンズからサンプルを観察します。サンプルの焦点を見つけるには、まずガラステープ界面の気泡の最上層と最下層の両方に焦点を見つけ、次にテープの2つの層の間に焦点を移動します。
      メモ:接眼レンズを覗き込む前に、レーザービームがブロックされていることを確認してください。
   5. 同調可能なビーム出力を798nmに設定します。コンデンサーの光スループットに基づいて、対物レンズの焦点でポンプとストークスビームに対してそれぞれ約40mWになるように光パワーを調整します。
   6. MATLAB(または顕微鏡を制御する他のスキャンソフトウェア)で ScanImage を開き、 FOCUS というラベルの付いたボタンをクリックしてスキャンを開始します。
      注: レーザービームはサンプルを通してラスタースキャンされ、画像が生成されます。フォトダイオードから出力される低周波信号(<100kHz)は、データ集録カードのチャネル1(DCチャネルと呼ばれる)に直接送られます。フォトダイオードからの高周波出力(>100kHz)はロックインアンプに送られ、ロックインアンプ信号のX出力はデータ収集カードのチャンネル2(ACチャンネルと呼ばれます)に送られます。
   7. ガルボスキャナの前にあるステアリングミラーを調整して、DC信号をチャンネル1ディスプレイの中央に配置します。電動遅延段を動かし、チャンネル2(ACチャンネル)ディスプレイに表示されるロックイン出力を注意深く観察します。
      メモ:ポンプとストークスが時間内に一致すると、ACチャンネルに信号が表示されます。ACチャンネルのカラースケールを調整して、小さな強度変化を表示すると便利です。
   8. 時間遅れを微調整してAC信号強度を最大化します。ダイクロイックミラーを調整して、SRS信号をACチャンネルの中央に配置します(DCチャンネルを中央に保ちます)。ロックインアンプの位相を調整して、信号を最大化します。満足のいく信号については、 図3 を参照してください。

3. スペクトル分解能の最適化

注:サンプルに到達するポンプビームとストークスビームは、スペクトル分解能を最大化するために同じ量のグループ遅延分散(GDD)を持つ必要があります。分散は実験設定に大きく依存します。ここで説明する実験セットアップでは、それぞれ1,040 nmと800 nmのフェムト秒パルスをストークスとポンプとして利用しています。パルス延伸媒体としては、緻密なフリントガラス棒(H-ZF52A)が使用されています。

1. 48 cmの高分散ガラス棒(H-ZF52Aまたは同等の高密度フリントガラス)を800nmのビーム経路に挿入します。式(1)を使用してGDDを推定します。
   (1)
   注:異なる波長の様々なガラス材料のGVDは、屈折率データベースリソースから見つけることができます。たとえば、H-ZF52A の GVD は 800 nm で 220.40 fs²/mm です。合計 GDD は fs^{2 105792です}。
2. ポンプのGDDと一致するように、1,040nmのビーム経路に追加するために必要な分散ガラス棒の数cmを計算します。適切な長さの分散型ガラス棒を 1,040 nm ビーム経路に挿入して、800 nm ビームの GDD にほぼ一致させます。なお、ガラス棒を追加すると、2本の梁の経時的な重なりが変わり、遅延の調整が必要になる場合があります。
3. スペクトル分解能のキャリブレーション
   1. DMSOで顕微鏡スライドサンプルを作ります。スライドを顕微鏡の上に置き、顕微鏡コンデンサーから出てくるビームの力を確認します。それに応じて、サンプルフォーカスでそれぞれ約40mWになるように電力を調整します。
   2. MATLAB から ScanImage を開きます。DMSOの2,913cm-1ラマンピークに対応する遅延段を走査して、最大のSRS信号を求めます。ロッドの挿入により光路長が長くなった前のステージ位置に基づいてステージ位置を推定する。ガラス棒を追加するときのビームの偏差が小さいため、ビーム空間オーバーラップを再調整します。
   3. 電動ステージを動かしながら一連のSRS画像を順番に撮影して、ハイパースペクトルSRSスキャンを保存します。
      メモ: 遅延スキャン範囲は、DMSO の 2,913 ^cm-1 および 2,994 ^cm-1 ラマンピークに対応する 2 つのラマンピークをカバーします。これら2つの遷移は、800nmのポンプと1,040nmのストークスレーザーを利用すると観察されます。
   4. DMSO溶液のSRSスペクトルをImageJまたはMATLABのいずれかを使用してプロットします。大きな DMSO 2,913 ^cm-1 ピークを MATLAB のガウス関数またはローレンツ関数に当てはめて、ピークの半値全幅 (FWHM) を計算します。
      注:代表的な結果を 図4に示す。ブロードなピークが1つしか存在しない場合は、スペクトル分解能が貧弱すぎて2つのピークを区別できず、より多くのガラス棒が必要か、スキャン範囲が小さすぎて2番目のピークを検出できないことを意味します。典型的には、許容可能なスペクトル分解能DMSOは、長さ>60cmのガラス棒が使用される場合〜20〜25cm⁻¹ である。より低い分解能は、より短いパルスでより高い信号と引き換えに組織イメージングに使用されることが多い¹⁷。
4. (オプション)自己相関器またはFROG(周波数分解光学ゲーティング)を使用して各アームのパルス持続時間を決定し、GDDの量とポンプとストークス間のGDDを一致させるために必要なロッドの長さを正確に計算します。
5. ストークスビームのロッドの長さが異なるため、手順3.3.2~3.3.4を繰り返して最適なスペクトル分解能を求めます。これは、最適なGDD一致が実験的に見つかったことを意味します。最適なスペクトル分解能を達成するために、長さの異なる複数のガラス棒のセットを使用してください。

4. 信号対雑音(SNR)特性評価

1. 手順 4.2 が、空間的および時間的なアライメントの完了後に実行されることを確認します。
2. DMSOの2,913cm-1ラマンピークに対応するSRS画像を取得する。ImageJ で画像を開き、フレームの中央にある小さな領域を選択します。メジャー関数を使用して、選択した領域の値の平均と標準偏差を計算します。
3. 選択した領域の平均値を標準偏差で除算して、式(2)のようにSNR値を求めます。
   (2)
   メモ: DMSO を 40 mw/40 mw で両アームのフォーカスで使用した場合のシステム(ロックイン時定数 4 μs)の良好な SNR は >800 です。データ集録カードのビット深度が限られている場合、低濃度のDMSOまたは低電力を使用して、SNRをより正確に推定できます。
4. SNR が低すぎる場合は、レーザー パルスを再調整して、空間オーバーラップ、時間オーバーラップ、ビーム サイズ/コリメーション マッチング、および/または分散マッチングを最適化します。収差補正カラー付きの対物レンズの場合は、補正カラーを調整して信号を最適化します。

5. 周波数軸校正

メモ: このステップは、遅延ステージの位置をスキャンされたラマン遷移に関連付けるために実行されます。適切な「ラマン定規」を生成するには、溶媒の慎重な選択が必要です。DMSOは、2,913cm-1および2,994cm-1に2つの鋭いラマンピークを有するため、CH結合に有効な溶媒^である。

1. DMSOの2,913 ^cm-1 および2,994 ^cm-1 ラマンピークをカバーする遅延段範囲でハイパースペクトルスキャンを保存します。ハイパースペクトルデータセットに対応するステージ位置を保存します。
   注: スペクトルのグローバル最大ピークは DMSO 2,913 ^cm-1 ラマンシフトに対応し、2 番目の最大ピークは DMSO 2,994 ^cm-1 ラマンシフトに対応します。
2. ステージ位置に対して線形回帰を実行し、ラマンシフトを 2,913 ^cm-1 と 2,994 ^{cm-1 で行います}。ステージ位置をラマンシフトに関連付ける線形回帰式を使用して、遅延位置を対応するラマン周波数に変換します。

6. 直交変調と2色イメージング

メモ: 直交変調ステップは、リアルタイムの 2 色イメージングが必要な場合にのみ必要です。このスキームの概略を 図5に示します。直交変調は、レーザ周波数の4分の1(80MHzレーザの場合は20MHz)で駆動される一対のEOMを使用し、2つの間に90°の位相シフトがあります。この直交変調ステップは、単色SRSイメージングまたはハイパースペクトルSRSイメージングではスキップできます。

1. EOM1変調
   1. PBS(PBS2)、1/4波長板(QWP2)、および第2のEOM(EOM2)を第1のEOMの後のストークスビーム経路に取り付けます。EOM2に入力されている信号を取り外します。EOM1に入力された信号を接続して電源を入れます。
   2. ストークスビーム(1,040 nmで固定)を20MHz(f₀/4)で変調するには、ビームを最初のEOMに送ってください。EOM1の傾きと位置を調整して、ビームがEOMクリスタルを通ってまっすぐに当たるようにします。
   3. PBS1から出てくる両方の偏光を2つのフォトダイオードで観察し、その変調をオシロスコープに表示して、変調深度を監視します。
   4. QWP1、EOM1、および20MHz入力の位相を(移相器を使用して)調整して、透過ビームの変調深度を100%に近づけるように最適化します。良好な変調深度の図については、 図2B を参照してください。
2. EOM2変調
   1. EOM1 を取り外し、EOM2 を差し込みます。
   2. 20MHzの2番目のアンプの高電圧出力をEOM2に送信します。EOM2の傾きと位置を調整して、ビームがEOMクリスタルを通ってまっすぐに当たるようにします。
   3. もう一度、PBS2から出てくる両方の偏光をオシロスコープで見て、変調深度を監視します。必要に応じてQWP2、EOM2電圧、および移相器を調整して、両方の分極でほぼ100%の変調を実現します。
   4. パルス列変調が最初の変調から90°位相シフトしていることを確認してください。
      メモ: 2 つのポンプパルス列が 90° 直交していない場合、2 つのチャンネル間のクロストークが問題になります。
   5. 変調の直交性をテストするには、EOM1 と EOM2 の両方をオンにして差し込みます。PBS2によって分割されている両方の偏光をオシロスコープで監視します。2番目のPBS後のパルス列が 図2Cに似ていない場合は、EOM1とEOM2を個別に再最適化します。
   6. EOM2 の下流に 20 mm 複屈折水晶 (BRC) と HWP を取り付けます。両方のEOMを一度に接続し、 図2Dのようにパルス列を監視します。
      注: この実験で使用したチャープの場合、20 mm BRC は 80 ^cm-1 ラマン シフトに対応する時間遅延を誘発します。異なるチャープを使用する場合は、異なる BRC 長が必要になることがあります。
3. キャリブレーション
   1. ロックインアンプのXおよびYチャンネル出力(データ集録カードのチャンネル2と3に送信)からの信号を検出して、DMSOを使用してシステムを較正します。
   2. 2,913 ^cm-1 ピークによって生成される信号が、高速偏波と低速偏波からの信号が、ロックインアンプの位相が 90° に近くなっているかどうかを確認します。そうでない場合は、2つの信号の位相が90°近くになるまでEOMアライメントを調整します。
   3. キャリブレーションが完了したら、直交ビームの1つについて2,930 ^cm-1 でタンパク質遷移をプローブする遅延位置を見つけます。他方の分極プローブが2,850cm⁻¹の脂質転移をプローブすることを確認する。

7. エピモードSRSイメージング

注:透過モードイメージング方式では、対物レンズがレーザーをサンプルに集束させ、コンデンサレンズが透過ビームをフォトダイオードに導き、ロックイン検出を行います。エピモードイメージング方式では、サンプルによって後方散乱および偏光解除された光は、集束対物レンズによって回収され、偏光ビームスプリッタを使用して分離される。絶縁された光子と後方散乱された光子は、ロックイン検出のために一対のリレーレンズを介してフォトダイオードに送られます。 図6は 、エピモードイメージング方式を描いている。

1. ビームが顕微鏡に入る前にHWPを設置して、顕微鏡に入るビームの偏光を変更します。PBSを対物レンズの上に配置して、偏光解除された逆反射ビームが検出器に到達できるようにします。
2. 75mmアクロマットレンズと30mm非球面レンズからなる一対のレンズを使用して、対物レンズの背面開口部から後方散乱光子を光検出器に中継する。検出器を取り付けて、PBSが指向する後方散乱光を収集します。変調ビームが検出器に入るのを阻止するフィルターを取り付けます。
3. 組織サンプルを対物レンズの下に置きます。コンデンサーはエピモードイメージングには不要ですので、スペースが必要な場合は取り外してください。
4. イメージング
   1. シャッターでビームを遮断する。白い光源を側面からサンプルに照らす。明視野を使用して客観的な焦点を見つけます。
   2. 両方のビームのブロックを解除し、事前に較正された遅延位置を使用して、ロックインアンプの2つの出力から組織から脂質およびタンパク質SRS画像を取得します。
   3. ロックインゲインとピクセルビン係数を調整して、高品質の画像を取得します。

8. 偽色染色

1. ImageJ でイメージ スタックを開きます。
2. 脂質(2,850 ^cm-1)とタンパク質(2,930 ^cm-1)の種に対応する2つの画像を右クリックして、[ 複製]をクリックして取り出します。
3. 脂質イメージの名前を脂質に、 タンパク質 イメージの名前を タンパク質に変更します。
4. プロセス|に移動画像計算機とタンパク質は、脂質を差し引く実行します。
5. 画像|に移動して画像を結合するカラー|チャネルをマージし、脂質を緑色に、タンパク質を青色に設定します。画像チャンネルツールを開く(画像|カラー|チャンネルツール)と明るさとコントラストを調整します(画像||を調整する明るさ/コントラスト)。
6. チャンネルツールを使用して、各チャンネルの明るさとコントラストを調整します。脂質チャネルの場合、細胞の特徴が暗く見えるまでコントラストを調整します。タンパク質チャネルの場合、細胞の特徴が青色に見えるまでコントラストを調整します。マージされたチャンネルの緑/青の画像をRGB画像に変換するには、[画像]|タイプ |RGBカラー。この画像をファイル|でエクスポートする|として保存ティフ。
   注:偽H&E染色の場合、配色はピンク色の細胞質を示し、核は濃い青紫色である。
7. 材料表の偽のH&E染色スクリプトリソースからHE.m MATLABスクリプトをダウンロードしてください。
8. MATLAB で HE.m スクリプトを実行します。前の手順で書き出したRGB画像を選択して、人工的にH&E染色された画像を生成します。
9. (オプション)視野の広いイメージングでは、画像が中心よりも周辺で暗く表示されるため、画像強度を正規化します。
   1. 画像のフィールド正規化を実行するには、できるだけ多くの画像を平均化します。次に、ImageJ (プロセス|で強度フィーチャを削除します。フィルター|ガウスぼかし|半径 = 50)。
   2. ぼやけた画像の最大強度を測定します(Ctrl + M)。ぼやけた画像を最大強度で割る(処理|数学|分割)。生のSRS画像をぼやけた画像で除算する(処理|画像|電卓)。

結果

スペクトル分解能の最適化:
材料を介した分散は、分散媒(長さおよび材料)および波長によって影響を受ける。分散ロッドの長さを変更すると、スペクトル分解能と信号サイズに影響します。これはギブアンドテイクの関係であり、アプリケーションに応じて異なる重み付けが可能です。ロッドは、ビームパルスを周波数が広く、時間が狭いことから、周波数が狭く、時間が広?...

ディスカッション

このプロトコルで提示される2色SRSイメージング方式は、1色SRSイメージングの適切な実装にかかっています。単色SRSイメージングでは、重要なステップは空間アライメント、時間アライメント、変調深度、位相シフトです。2つのビームを空間的に結合することは、ダイクロイックミラーによって達成される。ビームをダイクロイックミラーに送る際の微調整には、いくつかのステアリングミ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-100-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm
20 MHz bandpass filter	Minicircuits	BBP-21.4+	Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 Ω
200 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-200-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm
Achromatic Half Waveplate	Union Optic	WPA2210-650-1100-M25.4	Broadband half waveplate
Achromatic Quarter Waveplate	Union Optic	WPA4210-650-1100-M25.4	Broadband quarter waveplate
Beam Sampler	THORLABS	BSN11	10:90 Plate Beamsplitter
Dichroic Mirror	THORLABS	DMSP1000	Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	472301	Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.
Electrooptic Amplitude Modulator	THORLABS	EO-AM-NR-C1	Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.
False H&E Staining Script	Matlab		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer	PRL-414B	Pulse Research Lab	1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in
Fast Photodiode	THORLABS	DET10A2	Si Detector, 1 ns Rise Time
Frequency Divider	PRL-220A	Pulse Research Lab	TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.
Highly Dispersive Glass Rods	Union Optic	CYLROD01	High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm
Insight DS+	Newport		Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz.
Lock-in Amplifier	Liquid Instruments	Moku Lab	Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.
Mirrors	THORLABS	BB05-E03-10	Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.
Motorized Delay Stage	Zaber	X-DMQ12P-DE52	Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.
Oil Immersion Condensor	Nikon	CSC1003	1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used.
Oscilloscope	Tektronix	TDS7054	Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.
Phase Shifter	SigaTek	SF50A2	For shifting the phase of the modulation frequency
Photodiode	Hamamatsu Corp	S3994-01	Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.
Polarizing Beam Splitter	Union Optic	PBS9025-620-1000	Broadband polarizing beamsplitter
Refactive Index Database			refractiveindex.info
Retro-reflector	Edmund Optics	34-408	BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.
RF Power Amplifier	Minicircuits	ZHL-1-2W+	Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors	Cambridge Technologies	6215H	We used a 5mm mirror set with silver coating
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	Laser scanning microscope control software
Shortpass Filter	THORLABS	FESH1000	25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.
Upright Microscope	Nikon	Eclipse FN1	Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.
Water Immersion Objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.