Doku Teşhisi için Fare Beyninin Gerçek Zamanlı, İki Renkli Uyarılmış Raman Saçılma Görüntülemesi

Özet

Uyarılmış Raman saçılması (SRS) mikroskobu güçlü, tahribatsız ve etiketsiz bir görüntüleme tekniğidir. Ortaya çıkan bir uygulama, protein ve lipit Raman geçişlerinde iki renkli SRS görüntülemenin psödo-hematoksilin ve eozin görüntüleri üretmek için kullanıldığı uyarılmış Raman histolojisidir. Burada, doku teşhisi için gerçek zamanlı, iki renkli SRS görüntüleme için bir protokol gösteriyoruz.

Özet

Stimulated Raman scattering (SRS) mikroskopisi, doku tanısında güçlü bir optik görüntüleme tekniği olarak ortaya çıkmıştır. Son yıllarda, iki renkli SRS'nin, beyin kanserinin hızlı ve güvenilir teşhisini sağlayan hematoksilin ve eozin (H & E) eşdeğeri görüntüler sağlayabildiği gösterilmiştir. Bu yetenek, heyecan verici intraoperatif kanser teşhisi uygulamalarını mümkün kılmıştır. Dokunun iki renkli SRS görüntülemesi pikosaniye veya femtosaniye lazer kaynağı ile yapılabilir. Femtosaniye lazerler, hızlı hiperspektral görüntüleme ve gerçek zamanlı, iki renkli SRS görüntüleme dahil olmak üzere esnek görüntüleme modları sağlama avantajına sahiptir. Cıvıl cıvıl lazer darbeleri ile spektral odaklama yaklaşımı, yüksek spektral çözünürlük elde etmek için tipik olarak femtosaniye lazerlerle kullanılır.

İki renkli SRS alımı, ortogonal modülasyon ve kilitleme algılama ile gerçekleştirilebilir. Darbe cıvıltısının, modülasyonunun ve karakterizasyonunun karmaşıklığı, bu yöntemin yaygın olarak benimsenmesi için bir darboğazdır. Bu makale, spektral odaklı SRS'nin uygulanmasını ve optimizasyonunu ve epi modda fare beyin dokusunun gerçek zamanlı, iki renkli görüntülenmesini göstermek için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Bu protokol, SRS'nin yüksek hızlı ve spektroskopik görüntüleme yeteneğinden yararlanan çok çeşitli SRS görüntüleme uygulamaları için kullanılabilir.

Giriş

Geleneksel doku teşhisi, boyama protokollerine ve ardından optik mikroskop altında incelemeye dayanır. Patologlar tarafından kullanılan yaygın boyama yöntemlerinden biri H & E boyamasıdır: hematoksilin hücre çekirdeklerini morumsu maviye boyar ve eozin hücre dışı matrisi ve sitoplazmayı pembe boyar. Bu basit boyama, başta kanser teşhisi olmak üzere birçok doku teşhisi görevi için patolojide altın standart olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, H&E histopatolojisi, özellikle intraoperatif bir ortamda kullanılan dondurulmuş kesit tekniği, hala sınırlamalara sahiptir. Boyama prosedürü, doku gömme, kesitleme, fiksasyon ve boyama^1'i içeren zahmetli bir işlemdir. Tipik geri dönüş süresi 20 dakika veya daha uzundur. Dondurulmuş kesitleme sırasında H&E gerçekleştirmek, marj değerlendirmesi için hücresel özellikleri veya büyüme modellerini 3B'de değerlendirme ihtiyacı nedeniyle aynı anda birden fazla bölüm işlendiğinde bazen daha zor hale gelebilir. Ayrıca, intraoperatif histolojik teknikler yetenekli teknisyenler ve klinisyenler gerektirir. Birçok hastanede kurul onaylı patologların sayısındaki sınırlama, birçok durumda intraoperatif konsültasyon için bir kısıtlamadır. Bu tür sınırlamalar, dijital patoloji ve yapay zeka temelli tanı^2'deki hızlı gelişme ilgileri ile hafifletilebilir. Bununla birlikte, H&E boyama sonuçları, teknisyenin deneyimine bağlı olarak değişkendir ve bu da bilgisayar tabanlı tanı için ek zorluklar ortaya çıkarır².

Bu zorluklar, etiketsiz optik görüntüleme teknikleriyle potansiyel olarak ele alınabilir. Böyle bir teknik SRS mikroskopisidir. SRS, moleküler titreşimleri yüksek verimlilikle uyarmak için senkronize darbeli lazerler (pompa ve Stokes) kullanır³. Son raporlar, proteinlerin ve lipitlerin SRS görüntülemesinin, herhangi bir doku işleme ihtiyacını atlayan, tanı için gereken süreyi önemli ölçüde kısaltan ve intraoperatif olarak uyarlanan bozulmamış taze doku ile H & E eşdeğeri görüntüler (uyarılmış Raman histolojisi veya SRH olarak da bilinir) üretebileceğini göstermiştir⁴. Ayrıca, SRS görüntüleme, 2D görüntüler yetersiz olduğunda teşhis için ek bilgi sunan 3D görüntüler sağlayabilir⁵. SRH tarafsızdır ve bilgisayar tabanlı tanılama için hazır olan dijital görüntüler üretir. Özellikle beyin kanserinde intraoperatif kanser tanısı ve tümör marj analizi için olası bir çözüm olarak hızla ortaya çıkmaktadır ^6,7,8. Daha yakın zamanlarda, dokunun kimyasal değişikliklerinin SRS görüntülemesinin, klinisyenlerin farklı kanser türlerini veya evrelerini^9'u sınıflandırmasına yardımcı olabilecek yararlı tanısal bilgiler sağladığı da önerilmiştir.

Doku teşhisi uygulamalarındaki muazzam potansiyeline rağmen, SRS görüntüleme çoğunlukla ultra hızlı lazerler, lazer tarama mikroskobu ve sofistike algılama elektroniklerini içeren görüntüleme platformuyla ilişkili karmaşıklık nedeniyle optik konusunda uzmanlaşmış akademik laboratuvarlarla sınırlıdır. Bu protokol, gerçek zamanlı, iki renkli SRS görüntüleme için ortak bir femtosaniye lazer kaynağının kullanımını ve fare beyin dokusundan sahte H&E görüntülerinin oluşturulmasını göstermek için ayrıntılı bir iş akışı sağlar. Protokol aşağıdaki prosedürleri kapsayacaktır:

Hizalama ve cıvıl cıvıl optimizasyon
Çoğu SRS görüntüleme şeması, uyarma kaynağı olarak pikosaniye veya femtosaniye lazerleri kullanır. Femtosaniye lazerlerde, lazerin bant genişliği Raman çizgi genişliğinden çok daha büyüktür. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, femtosaniye lazerleri cıvıl cıvıl cıvıl Optimum spektral çözünürlük ancak temporal cıvıltı (grup gecikme dispersiyonu veya sadece dispersiyon olarak da bilinir) pompa ve Stokes lazerleri için uygun şekilde eşleştirildiğinde elde edilir. Hizalama prosedürü ve yüksek oranda dağıtıcı cam çubuklar kullanarak lazer ışınlarının dağılımını optimize etmek için gereken adımlar burada gösterilmiştir.

Frekans kalibrasyonu
Spektral odaklama SRS'nin bir avantajı, Raman uyarımının pompa ve Stokes lazerleri arasındaki zaman gecikmesini değiştirerek hızlı bir şekilde ayarlanabilmesidir. Bu tür ayarlamalar, lazer dalga boylarının ayarlanmasına kıyasla hızlı görüntüleme ve güvenilir spektral kazanım sağlar. Bununla birlikte, uyarma frekansı ile zaman gecikmesi arasındaki doğrusal ilişki harici kalibrasyon gerektirir. Bilinen Raman tepelerine sahip organik çözücüler, spektral odaklama SRS için Raman frekansını kalibre etmek için kullanılır.

Gerçek zamanlı, iki renkli görüntüleme
Büyük doku örneklerinin analizi için gereken süreyi kısaltmak için doku tanı uygulamalarında görüntüleme hızının artırılması önemlidir. Lipitlerin ve proteinlerin eşzamanlı iki renkli SRS görüntülemesi, lazeri veya zaman gecikmesini ayarlama ihtiyacını ortadan kaldırır ve bu da görüntüleme hızını iki kattan fazla artırır. Bu, yeni bir ortogonal modülasyon tekniği ve kilitli bir amplifikatör¹¹ ile çift kanallı demodülasyon kullanılarak elde edilir. Bu yazıda ortogonal modülasyon ve çift kanallı görüntü elde etme protokolü açıklanmaktadır.

Epi-mod SRS görüntüleme
Bugüne kadar gösterilen SRS görüntülemenin çoğunluğu iletim modunda gerçekleştirilmektedir. Epi modlu görüntüleme, doku^12'den geri saçılan fotonları algılar. Patoloji uygulamaları için cerrahi örnekler oldukça büyük olabilir. İletim modu görüntüleme için, doku kesiti genellikle gereklidir, bu da istenmeyen bir şekilde ekstra zaman gerektirir. Buna karşılık, epi-mod görüntüleme bozulmamış cerrahi örneklerle çalışabilir. Aynı amaç geri saçılan ışığı toplamak için kullanıldığından, iletim görüntülemesi için gereken yüksek sayısal açıklıklı bir kondenserin hizalanmasına da gerek yoktur. Epi-mod, kemikte olduğu gibi doku kesiti zor olduğunda da tek seçenektir. Daha önce beyin dokusu için epi-mod görüntülemenin 2 mm¹³'> doku kalınlığı için üstün görüntüleme kalitesi sunduğunu göstermiştik. Bu protokol, doku tarafından depolarize edilen dağınık fotonları toplamak için polarize edici bir ışın ayırıcı (PBS) kullanır. Özelleştirilmiş dedektör düzeneğinin karmaşıklığı pahasına dairesel bir dedektörle daha fazla foton toplamak mümkündür¹². PBS yaklaşımının uygulanması daha kolaydır (floresana benzer), standart fotodiyot zaten iletim modu tespiti için kullanılmaktadır.

Pseudo-H&E görüntü oluşturma
İki renkli SRS görüntüleri toplandıktan sonra, H&E boyamasını simüle etmek için yeniden renklendirilebilirler. Bu yazıda, patoloji uygulamaları için lipid ve protein SRS görüntülerinin psödo-H&E SRS görüntülerine dönüştürülmesi prosedürü gösterilmektedir. Deneysel protokol, yüksek kaliteli SRS görüntüleri oluşturmak için gereken kritik adımları ayrıntılarıyla açıklar. Burada gösterilen prosedür sadece doku tanısına uygulanamaz, aynı zamanda ilaç görüntüleme ve metabolik görüntüleme gibi diğer birçok hiperspektral SRS görüntüleme uygulamasına da uyarlanabilir^14,15.

Genel sistem gereksinimleri
Bu protokol için lazer sistemi 2 senkronize femtosaniye lazer ışını üretebilmelidir. Sistemler, lazer ışınlarından birinin geniş dalga boyu ayarı için ideal olarak bir Optik Parametrik Osilatör (OPO) içerir. Bu protokoldeki kurulum, 80 MHz tekrarlama hızına sahip iki lazer (1.040 nm'de bir sabit ışın ve 680 ila 1.300 nm arasında değişen bir OPO tabanlı ayarlanabilir ışın) üreten ticari bir lazer sistemi Insight DS + kullanır. Kullanılan mikroskop, ticari bir dik mikroskop çerçevesinin üzerine inşa edilmiş dik bir lazer tarama mikroskobudur. Lazer ışınını taramak için bir çift 5 mm galvo ayna kullanılır. Ev yapımı bir lazer tarama mikroskobu benimsemeyi seçen kullanıcılar için, lazer tarama mikroskobunun yapımı için daha önce yayınlanmış bir protokole bakın¹⁶.

Protokol

Tüm deneysel hayvan prosedürleri, Washington Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Enstitüsü (IACUC) tarafından onaylanan protokole (# 4395-01) uygun olarak 200 μm, sabit, kesitli fare beyinleri ile gerçekleştirilmiştir. Vahşi tip fareler (C57BL / 6J suşu) CO₂ ile ötenazi yapılır. Daha sonra, fosfat tamponlu salinde %4 paraformaldehit içinde fiksasyon için beyinlerini çıkarmak için bir kraniyotomi yapılır. Beyinler% 3'lük bir agaroz ve% 0.3'lük bir jelatin karışımına gömülür ve bir vibratom tarafından 200 μm kalınlığında dilimler halinde bölünür.

1. İlk hizalama

NOT: En iyi hassasiyet ve çözünürlük için her iki kolun ışın boyutunun ve ayrışmasının eşleştiğinden emin olun. Pompayı ve Stokes ışınlarını kolimasyon yapın ve lazer tarama mikroskobuna girmeden önce boyutlarını ayarlayın. Bunu yapmak için, dikroik aynada birleştirmeden önce her ışın için bir çift akromatik lens kullanın. Işın hizalaması için her zaman uygun lazer gözlükleri takın.

1. Kiriş kolimasyonu
   1. Pompa ışını için bir çift akromatik lens takın. Başlangıç noktası olarak, lazer ışını boyutunu 2 kat büyütmek için 100 mm lens ve 200 mm lens kullanın. İki lensin mesafesinin kabaca 300 mm olduğundan emin olun. Pompa ışını her iki lensin ortasından hizalayın.
   2. Işını bir duvara doğru göndermek için ikinci lensten sonra bir ayna yerleştirin (>1 m uzaklıkta). Kirişi uzun mesafelere gönderirken dikkatli olun. Kirişi aynadan duvara bir IR kartı ile izleyin ve ışının boyutunun değişip değişmediğini kontrol edin. Kiriş, mesafenin bir fonksiyonu olarak boyut olarak değişirse kirişi kolimasyona alın.
      1. Işın yakınsıyorsa (yayılma ile boyut azalıyorsa), iki lensi daha yakına getirin.
      2. Işın uzaklaşıyorsa (yayılma ile boyut artıyorsa), iki lensi birbirinden daha da uzaklaştırın. Kiriş harmanlanana kadar mesafeyi ayarlayın.
   3. Stokes ışınının kirişi harmanlaması için 1.1.1 ve 1.1.2 numaralı adımları yineleyin.
2. Işın boyutu ayarı
   1. Bir kiriş profil oluşturucu varsa, her kiriş için harmanlanmış kiriş boyutunu ölçün. Alternatif olarak, 4-5 mm'lik bir ışın çapı elde etmek için IR kartı ve bir cetvel kullanarak ışın boyutunu tahmin edin.
   2. Işın boyutu çok küçük veya çok büyükse, adım 1.1'de kullanılan lens çiftini değiştirin. Lens çiftini, her iki ışının çapı 4-5 mm olana kadar ayarlayın.
      NOT: Işının büyütülmesi, ikinci lensin odak uzaklığı ile birinci lens arasındaki orandır (f₂/f₁).
3. Uzamsal örtüşme
   NOT: SRS görüntüleme, moleküler titreşimleri uyarmak için her iki lazer ışınının da uzay ve zamanda birleştirilmesini gerektirir. Spektral odaklamalı SRS görüntülemenin bir şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
   1. Ayarlama için birkaç direksiyon aynası ile dikroik bir ayna takarak iki lazer ışınını birleştirin. Dikroik aynadan sonraki kirişleri birbirinden uzak iki farklı konumda (~ 1 m) izleyerek pompanın ve Stokes'un uzamsal örtüşmesini optimize edin. Stokes kirişini pompa kirişiyle hizalamak için dikroik ve dikroik aynadan önce direksiyon aynasını yinelemeli olarak ayarlayın.
      NOT: İki kiriş her iki konumda da uzamsal olarak üst üste biniyorsa, yeterince üst üste binerler.
   2. Tarama aynaları park edilmiş konumdayken bir çift direksiyon aynasını ayarlayarak kombine ışınların lazer tarama mikroskobunun tarama aynalarının merkezine gönderildiğinden emin olun. Her iki ışının da mikroskop hedefinin ve kondenserin merkezinden geçtiğinden emin olun.
   3. Kondenserden sonra, iletilen ışını fotodiyota iletmek için sırasıyla 100 mm ve 30 mm odak uzaklığına sahip başka bir lens çifti kullanın. Her iki kirişin de fotodiyot içinde bulunduğundan emin olun ve modüle edilmiş Stokes ışınını engellemek için iki alçak geçirgen filtre takın.

2. SRS sinyal algılama

1. Elektrooptik modülasyon (EOM)
   NOT: Stokes genliğini modüle etmek için 20 MHz'lik EOM kullanılır. Daha sonra tartışıldığı gibi, EOM, ortogonal modülasyon için gerekli olan 80 MHz lazer darbe treninden türetilmiştir. Diğer modülasyon frekansları, yalnızca tek renkli veya hiperspektral SRS gerçekleştirilirse kullanılabilir. Bu durumda, modülasyon frekansının lazer frekansına senkronizasyonu gereksizdir. EOM'yi çalıştırmak için RF güç amplifikatörlü bir frekans üreteci kullanılabilir. Sonuç olarak, 2.1.1-2.1.4 adımları atlanabilir.
   1. Işının% 10'unu almak için Stokes ışın yoluna bir ışın örnekleyici yerleştirin ve 80 MHz darbe trenini algılamak için hızlı bir fotodiyota gönderin.
      NOT: Fotodiyot sinyali, 20 MHz TTL çıkışı oluşturmak için bir frekans bölücüye gönderilir. Bu çıkış, çıkışı dört özdeş 20 MHz çıkışa çoğaltmak için bir yayma arabelleğine gönderilir. Çıkışlardan biri osiloskobu tetiklemek için kullanılır.
   2. Yayma tamponunun çıkışlarından birini alın ve 20 MHz'lik bir sinüzoidal dalga elde etmek için bir bandpass filtresi ile filtreleyin. Çıkış tepeden tepeye voltajını ~500 mV'ye ayarlamak için bir RF zayıflatıcı kullanın.
   3. Elde edilen çıkışı, RF fazının bir voltaj kaynağıyla hassas bir şekilde ayarlanmasını sağlayan bir faz değiştiriciye gönderin. Bu çıkışı bir RF güç amplifikatörüne gönderin ve amplifikatörün çıkışını EOM'ye bağlayın.
   4. Stokes ışınının engelini kaldırın ve ışın yoluna bir fotodiyot yerleştirerek EOM1'in modülasyon derinliğini optimize edin. Modülasyon derinliği (vadi-tepe oranı) tatmin edici görünene kadar EOM voltajını ve çeyrek dalga plakasını ayarlayın.
      NOT: 20 MHz modülasyonunda (lazer tekrarlama hızının 1/4'ü), her 50 ns'de iki darbe beklenir.
2. Zamansal örtüşme
   NOT: Pompa ve Stokes'un zamansal örtüşmesi, iki lazer darbe treninden birinin gecikme aşamasına monte edilmiş bir reflektörle geciktirilmesiyle sağlanır (Şekil 1, Stokes'un geciktiğini göstermektedir). Osiloskop ile kaba örtüşme izlenir ve ince örtüşme SRS sinyali ile izlenir. İnce zamansal örtüşme, varsa bir otokorelatör ile de elde edilebilir.
   1. Lazer ışınını algılamak için dikroik aynadan sonra bir fotodiyot yerleştirin. Önce Stokes ışınını engelleyin. Osiloskop üzerindeki pompa darbe piklerinden birini yakınlaştırın. Osiloskop ile bu zirvenin zamansal konumunu işaretlemek için dikey bir imleç yerleştirin.
   2. Pompa kirişini bloke edin ve Stokes kirişinin blokajını kaldırın. Osiloskop üzerindeki tepe konumunu önceki adımda işaretlenmiş konumla geçici olarak eşleştirmek için gecikme aşamasını çevirin. İki kirişin zamansal örtüşmesinin bir gösterimi için Şekil 2'ye bakınız.
      1. (İSTEĞE BAĞLI) Gecikme aşamasının çevirisi iki kirişi geçici olarak eşleştirmek için yetersizse, gecikme aşamasını hareket aralığının ortasına taşıyın.
      2. İki ışın arasındaki zamansal farkı alarak ve iki ışınla geçici olarak eşleşmek için gereken mesafe miktarını bulmak için farkı ışık hızıyla çarparak iki ışınla eşleşmek için gereken gecikme mesafesini hesaplayın.
      3. Daha hızlı kirişin ışın yolunu uzatın veya daha yavaş kirişin ışın yolunu, zamansal gecikmeyi kabaca buna göre eşleştirmek için kısaltın.
   3. Numuneyi slayt ve kapak kayması arasında tutmak için DMSO ve çift taraflı bant ile bir ara parça olarak mikroskop slayt örneği hazırlayın.
   4. Numuneyi, kapak kayması tarafı mikroskop hedefine bakacak şekilde mikroskop üzerine yerleştirin. Mikroskopu parlak alan aydınlatmasına değiştirin ve numuneyi göz merceğinden gözlemleyin. Önce cam-bant arabirimindeki hava kabarcıklarının hem üst hem de alt katmanındaki odağı bularak numunenin odağını bulun ve ardından odağı iki bant katmanı arasında olacak şekilde hareket ettirin.
      NOT: Göz merceğine bakmadan önce lazer ışınlarının tıkandığından emin olun.
   5. Ayarlanabilir ışın çıkışını 798 nm olarak ayarlayın. Kondenserin optik çıkışına bağlı olarak, optik gücü pompa ve objektif odaktaki Stokes ışınları için her biri ~ 40 mW olacak şekilde ayarlayın.
   6. ScanImage'ı MATLAB'da (veya mikroskobu kontrol eden başka bir tarama yazılımında) açın ve taramaya başlamak için FOCUS etiketli düğmeye tıklayın.
      NOT: Lazer ışınları, bir görüntü oluşturmak için numune boyunca raster-taranacaktır. Fotodiyottan (<100 kHz) gelen düşük frekanslı sinyal çıkışı doğrudan veri toplama kartının (DC kanalı olarak adlandırılır) 1. kanalına gönderilir. Fotodiyottan gelen yüksek frekanslı çıkış (>100 kHz) kilitli amplifikatöre gönderilir ve kilitli amplifikatör sinyalinin X çıkışı veri toplama kartının (AC kanalı olarak adlandırılır) kanal 2'sine gönderilir.
   7. DC sinyalini kanal 1 ekranında ortalamak için galvo tarayıcıdan önce direksiyon aynasını ayarlayın. Motorlu gecikme aşamasını hareket ettirin ve kanal 2 (yani AC kanalı) ekranında gösterilen kilitleme çıkışını yakından izleyin.
      NOT: Pompa ve Stokes zamanında çakıştığında, AC kanalında bir sinyal görünecektir. Küçük yoğunluk değişimini görüntülemek için AC kanalının renk ölçeğini ayarlamak yararlıdır.
   8. Zaman gecikmesini hassas bir şekilde ayarlayarak AC sinyal yoğunluğunu en üst düzeye çıkarın. Dikroik aynayı, SRS sinyalini AC kanalında ortalayacak şekilde ayarlayın (DC kanalı ortada tutarken). Sinyali en üst düzeye çıkarmak için kilitli amplifikatörün fazını ayarlayın. Tatmin edici bir sinyal için Şekil 3'e bakın.

3. Spektral çözünürlük optimizasyonu

NOT: Numuneye ulaşan pompa ve Stokes kirişleri, spektral çözünürlüğü en üst düzeye çıkarmak için aynı miktarda grup gecikme dağılımına (GDD) sahip olmalıdır. Dağılım büyük ölçüde deney düzeneğine bağlıdır. Burada açıklanan deney düzeneği, sırasıyla Stokes ve pompa olarak 1.040 nm ve 800 nm'de femtosaniye darbeleri kullanır. Yoğun çakmaktaşı cam çubuklar (H-ZF52A) darbe germe ortamı olarak kullanılır.

1. 800 nm ışın yoluna 48 cm'lik yüksek dispersif bir cam çubuk (H-ZF52A veya eşdeğer yoğun çakmaktaşı cam) yerleştirin. GDD'yi Eq (1) kullanarak tahmin edin:
   (1)
   NOT: Farklı dalga boylarındaki çeşitli cam malzemelerin GVD'si kırılma indisi veritabanı kaynağından bulunabilir. Örneğin, H-ZF52A, 800 nm'de 220,40 fs²/mm'lik bir GVD'ye sahiptir. Toplam GDD 105792 fs^2'dir.
2. Pompanın GDD'sine uyacak şekilde 1.040 nm ışın yoluna eklemek için dağıtıcı cam çubuğun kaç cm eklenmesi gerektiğini hesaplayın. 800 nm ışının GDD'sine kabaca uyması için 1.040 nm ışın yoluna uygun uzunlukta dispersif cam çubuklar yerleştirin. Cam çubukların eklenmesinin iki kirişin zamansal örtüşmesini değiştireceğini ve gecikmenin ayarlanmasının gerekli olabileceğini unutmayın.
3. Spektral çözünürlüğün kalibrasyonu
   1. DMSO ile mikroskop slayt örneği yapın. Slaytı mikroskop üzerine yerleştirin ve mikroskop kondenserinden çıkan ışınların gücünü kontrol edin. Gücü, örnek odağında her biri ~ 40 mW olacak şekilde ayarlayın.
   2. ScanImage'ı MATLAB'dan açın. DMSO'nun 2.913 ^cm-1 Raman zirvesine karşılık gelen gecikme aşamasını tarayarak maksimum SRS sinyalini bulun. Çubukların takılması nedeniyle artan optik yol uzunluğu ile önceki aşama konumuna göre sahne alanı konumunu tahmin edin. Cam çubuklar eklendiğinde kirişin küçük sapması nedeniyle kiriş uzamsal örtüşmesini yeniden hizalayın.
   3. Motorlu sahneyi hareket ettirirken sırayla bir dizi SRS görüntüsü çekerek hiperspektral SRS taramasını kaydedin.
      NOT: Gecikmeli tarama aralığı, DMSO'nun sırasıyla 2.913 ^cm-1 ve 2.994 ^cm-1 Raman tepelerine karşılık gelen iki Raman tepe noktasını kapsar. Bu iki geçiş, 800 nm pompa ve 1.040 nm Stokes lazer kullanıldığında gözlenir.
   4. DMSO çözümünün SRS spektrumlarını ImageJ veya MATLAB kullanarak çizin. Büyük DMSO 2.913 ^cm-1 tepe noktasını, tepenin Yarım Maksimumunda (FWHM) Tam Genişliği hesaplamak için MATLAB'daki bir Gauss veya Lorentzian fonksiyonuna takın.
      NOT: Temsili sonuçlar Şekil 4'te gösterilmiştir. Yalnızca bir geniş tepe noktası varsa, bu ya spektral çözünürlüğün iki tepeyi ayırt etmek için çok zayıf olduğu ve daha fazla cam çubuk gerektiği veya taranan aralığın ikinci zirveyi tespit etmek için çok küçük olduğu anlamına gelir. Tipik olarak, kabul edilebilir bir spektral çözünürlük DMSO, >60 cm uzunluğundaki cam çubuklar kullanıldığında ~ ^{20-25 cm-1'dir} . Daha düşük bir çözünürlük genellikle doku görüntülemede daha kısa darbelerle daha yüksek sinyaller için ticaret yapmak için kullanılır¹⁷.
4. (İSTEĞE BAĞLI) GDD miktarını ve pompa ile Stokes arasındaki GDD'yi eşleştirmek için gereken çubukların uzunluğunu tam olarak hesaplamak üzere her bir kolun darbe süresini belirlemek için bir otokorelatör veya bir FROG (Frekans Çözümlü Optik Geçit) kullanın.
5. En uygun spektral çözünürlüğü bulmak için Stokes ışınındaki farklı çubuk uzunlukları için 3.3.2-3.3.4 adımlarını tekrarlayın, bu da deneysel olarak en iyi GDD eşleşmesinin bulunduğu anlamına gelir. Optimum spektral çözünürlük elde etmek için uzunlukları farklı olan birden fazla cam çubuk seti kullanın.

4. Gürültüye sinyal (SNR) karakterizasyonu

1. Adım 4.2'nin tam uzamsal ve zamansal hizalamadan sonra gerçekleştirildiğinden emin olun.
2. DMSO'nun 2.913 ^cm-1 Raman zirvesine karşılık gelen bir SRS görüntüsü elde edin. Görüntüyü ImageJ'de açın ve çerçevenin ortasında küçük bir alan seçin. Seçilen alandaki değerlerin ortalama ve standart sapmasını hesaplamak için hesaplama işlevini kullanın.
3. SNR değerini bulmak için seçilen alanın ortalama değerini, Eq (2)'de olduğu gibi standart sapmaya bölün.
   (2)
   NOT: Her iki kol için odakta 40 mw/40 mw'de DMSO kullanan sistem için iyi bir SNR (4 μs kilitleme süresi sabiti ile) >800'dür. Veri toplama kartının sınırlı bir bit derinliği varsa, SNR'nin daha doğru bir şekilde tahmin edilmesi için daha düşük DMSO konsantrasyonları veya daha düşük güç kullanılabilir.
4. SNR çok düşükse, uzamsal örtüşmeyi, zamansal örtüşmeyi, ışın boyutu/kolimasyon eşleşmesini ve/veya dağılım eşleşmesini optimize etmek için lazer darbelerini yeniden hizalayın. Sapma düzeltme tasması olan bir hedef için, düzeltme tasmasını ayarlayarak sinyali optimize edin.

5. Frekans ekseni kalibrasyonu

NOT: Bu adım, gecikme aşaması konumunu taranan Raman geçişiyle ilişkilendirmek için gerçekleştirilir. Uygun bir "Raman Cetveli" oluşturmak için çözücülerin dikkatli bir şekilde seçilmesi gerekir. DMSO, CH bağları için etkili bir çözücüdür, çünkü 2.913 ^cm-1 ve 2.994 ^cm-1'de iki keskin Raman zirvesine sahiptir.

1. DMSO'nun 2.913 cm-1 ve 2.994 ^cm-1 Raman zirvelerini kapsayan gecikme aşaması aralığı ile hiperspektral taramadan tasarruf edin. Hiperspektral veri kümesine karşılık gelen sahne alanı konumlarını kaydedin.
   NOT: Spektrumun global maksimum tepe noktası DMSO 2.913 ^cm-1 Raman kaymasına karşılık gelir ve ikinci maksimum tepe DMSO 2.994 ^cm-1 Raman kaymasına karşılık gelir.
2. Sahne pozisyonları için doğrusal regresyon gerçekleştirin ve Raman 2.913 ^cm-1 ve 2.994 ^cm-1'de kayıyor. Sahne pozisyonunu Raman kaymasıyla ilişkilendiren doğrusal regresyon denklemini kullanarak, gecikme pozisyonlarını karşılık gelen Raman frekanslarına dönüştürün.

6. Ortogonal modülasyon ve iki renkli görüntüleme

NOT: Ortogonal modülasyon adımı yalnızca gerçek zamanlı iki renkli görüntüleme gerektiğinde gereklidir. Bu şemanın bir şeması Şekil 5'te gösterilmiştir. Ortogonal modülasyon, ikisi arasında 90 ° faz kayması ile lazer frekansının dörtte birinde (80 MHz lazer için 20 MHz) tahrik edilen bir çift EOS kullanır. Bu ortogonal modülasyon adımı, tek renkli SRS görüntüleme veya hiperspektral SRS görüntüleme için atlanabilir.

1. EOM1 modülasyonu
   1. İlk EOM'den sonra Stokes ışın yoluna bir PBS (PBS2), bir çeyrek dalga plakası (QWP2) ve ikinci bir EOM (EOM2) takın. Sinyal girişini EOM2'ye çıkarın. Sinyal girişini EOM1'e takın ve açın.
   2. Stokes ışınını (1.040 nm'de sabitlenmiş) 20 MHz'de (f₀/4) modüle ederek ışını ilk EOM'dan geçirerek modüle edin. Işının EOM kristali boyunca düz ve ortalanmış olduğundan emin olmak için EOM1'in eğimini ve konumunu ayarlayın.
   3. PBS1'den çıkan her iki polarizasyonu iki fotodiyot ile gözlemleyerek ve modülasyonu bir osiloskop üzerinde görüntüleyerek modülasyon derinliğini izleyin.
   4. İletilen ışının modülasyon derinliğini %100'e yakın olacak şekilde optimize etmek için QWP1, EOM1 voltajını ve 20 MHz girişin fazını (bir faz değiştirici kullanarak) ayarlayın. İyi modülasyon derinliğinin bir örneği için Şekil 2B'ye bakın.
2. EOM2 modülasyonu
   1. EOM1'i çıkarın ve EOM2'yi takın.
   2. İkinci amplifikatörün yüksek voltaj çıkışını 20 MHz'de EOM2'ye gönderin. Işının EOM kristali boyunca düz ve ortalanmış olduğundan emin olmak için EOM2'nin eğimini ve konumunu ayarlayın.
   3. Bir kez daha, PBS2'den çıkan her iki polarizasyona bir osiloskop ile bakarak modülasyon derinliğini izleyin. QWP2, EOM2 voltajı ve faz değiştiriciyi her iki polarizasyon için% 100'e yakın modülasyon elde etmek üzere gerektiği gibi ayarlayın.
   4. Darbe treni modülasyonunun ilk modülasyondan 90° faz kaymasına sahip olduğundan emin olun.
      NOT: İki pompa darbe treni 90 ° ortogonal değilse, iki kanal arasındaki çapraz konuşma bir sorun olacaktır.
   5. Hem EOM1 hem de EOM2'yi açıp takarak modülasyonun ortogonalitesini test edin. Bir osiloskop ile PBS2 tarafından bölünen her iki polarizasyonu da izleyin. İkinci PBS'den sonraki darbe treni Şekil 2C'ye benzemiyorsa, EOM1 ve EOM2'yi ayrı ayrı yeniden optimize edin.
   6. EOM2'nin 20 mm'lik çift kırıcı kuvars kristali (BRC) ve HWP çıkış akımını takın. Her iki EOM'yi aynı anda takın ve darbe trenini Şekil 2D'ye benzeyecek şekilde izleyin.
      NOT: Bu deneyde kullanılan cıvıltı için, 20 mm BRC, 80 ^cm-1 Raman kaymasına karşılık gelen bir zaman gecikmesine neden olur. Farklı bir cıvıltı kullanılıyorsa farklı bir BRC uzunluğu gerekebilir.
3. Kalibrasyon
   1. Kilitli amplifikatör X ve Y kanal çıkışından (veri toplama kartının kanal 2 ve 3. kanallarına gönderilen) gelen sinyalleri algılayarak DMSO'yu kullanarak sistemi kalibre edin.
   2. 2.913 ^cm-1 tepe noktası tarafından daha hızlı polarizasyondan ve daha yavaş polarizasyondan üretilen sinyallerin, kilitleme amplifikatöründe 90 ° faz dışına yakın olup olmadığını kontrol edin. Durum böyle değilse, iki sinyal 90° faz dışına yakın olana kadar EOM hizalamasını ayarlayın.
   3. Kalibrasyon tamamlandıktan sonra, ortogonal ışınlardan biri için protein geçişini 2.930 ^cm-1'de araştıran gecikme pozisyonunu bulun. Diğer polarizasyonun 2.850 ^cm-1'lik lipit geçişini araştırdığından emin olun.

7. Epi mod SRS görüntüleme

NOT: İletim modu görüntüleme şemasında, amaç lazeri numuneye odaklar ve ardından bir kondenser lens, iletilen ışını kilitlenme algılaması için bir fotodiyota yönlendirir. Epi-mod görüntüleme şemasında, numune tarafından geri saçılan ve depolarize edilen ışık, odaklama hedefi tarafından hatırlanır ve polarize edici bir ışın ayırıcı kullanılarak izole edilir. İzole edilmiş ve geri saçılan fotonlar, kilitlenme algılaması için bir çift röle lensi aracılığıyla bir fotodiyota gönderilir. Şekil 6'da epi-mod görüntüleme şeması gösterilmektedir.

1. Mikroskopa giden ışının polarizasyonunu değiştirmek için ışın mikroskopa girmeden önce bir HWP takın. Depolarize edilmiş geri yansıyan ışının dedektöre ulaşmasına izin vermek için hedefin üzerine bir PBS yerleştirin.
2. Geriye saçılan fotonları hedefin arka diyafram açıklığından fotodetektöre aktarmak için 75 mm achromat lens ve 30 mm asferik lensten oluşan bir çift lens kullanın. PBS tarafından yönlendirilen geri saçılan ışığı toplamak için dedektörü takın. Modüle edilmiş ışının dedektöre girmesini engellemek için bir filtre takın.
3. Doku örneğini hedefin altına yerleştirin. Epi-mod görüntüleme için kondenser gereksiz olduğundan, daha fazla alan gerekiyorsa çıkarın.
4. Görüntüleme
   1. Kirişi bir deklanşörle engelleyin; numuneye yandan beyaz bir ışık kaynağı parlaklaştırın; ve objektif odağı bulmak için brightfield'ı kullanın.
   2. Her iki ışının da engelini kaldırın ve kilitli amplifikatörün iki çıkışından dokudan lipit ve protein SRS görüntüleri elde etmek için önceden kalibre edilmiş gecikme konumlarını kullanın.
   3. İyi kalitede görüntüler elde etmek için kilitleme kazancını ve piksel bölmesi faktörünü ayarlayın.

8. Yanlış renk boyama

1. Görüntü yığınını ImageJ ile açın.
2. Lipit (2.850 ^cm-1) ve protein (2.930 ^cm-1) türlerine karşılık gelen iki resmi, resme sağ tıklayıp Çoğalt'a tıklayarak çıkarın.
3. Lipid görüntüsünü lipitlere, protein görüntüsünü proteinlere yeniden adlandırın.
4. İşlem |'na gidin Görüntü Hesaplayıcısı ve proteinler lipitleri çıkarmak gerçekleştirmek.
5. Görüntü |'na giderek görüntüleri birleştirin Renk | Kanalları birleştirin, lipitleri yeşile ve proteinleri maviye ayarlayın. Görüntü kanalları aracını açma (Görüntü | Renk | Kanallar Aracı) ve parlaklığı ve kontrastı ayarlayın (Görüntü | | ayarlama Parlaklık/Kontrast).
6. Kanallar aracını kullanarak her kanalın parlaklığını ve kontrastını ayarlayın. Lipit kanalı için, hücresel özellikler karanlık görünene kadar kontrastı ayarlayın. Protein kanalı için, hücresel özellikler mavi görünene kadar kontrastı ayarlayın. Görüntü |'na giderek birleştirilmiş kanal yeşil/mavi görüntüsünü RGB görüntüsüne dönüştürün Tip | RGB Rengi. Bu görüntüyü Dosya | Farklı Kaydet | Sert.
   NOT: Yanlış H&E boyama için, renk şeması pembe sitoplazmayı gösterirken, çekirdekler koyu mavi-mordur.
7. HE.m MATLAB komut dosyasını, Malzeme Tablosu'ndaki sahte H&E boyama komut dosyası kaynağından indirin.
8. HE.m betiğini MATLAB'da çalıştırın. Yapay olarak H&E lekeli görüntü oluşturmak için önceki adımdan dışa aktarılan RGB görüntüsünü seçin.
9. (İSTEĞE BAĞLI) Geniş görüş alanı görüntülemesi için görüntü yoğunluğunu normalleştirin, çünkü görüntü çevrede merkezden daha koyu görünür.
   1. Görüntülerin alan normalleştirmesini gerçekleştirmek için, mümkün olduğunca çok görüntünün ortalamasını alın. Ardından, yoğunluk özelliklerini ImageJ (İşlem | Filtreler | Gauss Bulanıklığı | Yarıçap=50).
   2. Bulanık görüntünün maksimum yoğunluğunu ölçün (Ctrl+M). Bulanık görüntüyü maksimum yoğunluğa bölün (İşlem | Matematik | Böl). Ham SRS görüntüsünü bulanık görüntüye bölün (İşlem | Resim | Hesap Makinesi).

Sonuçlar

Spektral çözünürlüğü optimize etme:
Bir malzeme boyunca dağılım, dağıtıcı ortamdan (uzunluk ve malzeme) ve dalga boyundan etkilenir. Dağılım çubuğu uzunluğunun değiştirilmesi spektral çözünürlüğü ve sinyal boyutunu etkiler. Uygulamaya bağlı olarak farklı şekilde tartılabilen bir al-ver ilişkisidir. Çubuklar, ışın darbesini frekansta geniş ve zamanda dar olmaktan, frekansta dar ve zaman içinde geniş olmaya kadar uzatır. Şekil 7 ,...

Tartışmalar

Bu protokolde sunulan iki renkli SRS görüntüleme şeması, tek renkli SRS görüntülemenin doğru şekilde uygulanmasına bağlıdır. Tek renkli SRS görüntülemede kritik adımlar uzamsal hizalama, zamansal hizalama, modülasyon derinliği ve faz kaymasıdır. İki kirişin mekansal olarak birleştirilmesi, dikroik bir ayna ile gerçekleştirilir. Kirişleri dikroik aynaya gönderirken ince ayar için birkaç direksiyon aynası kullanılır. Kirişler dikroik ayna ile birleştirildikten sonra, bir IR kartı ile ö...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-100-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm
20 MHz bandpass filter	Minicircuits	BBP-21.4+	Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 Ω
200 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-200-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm
Achromatic Half Waveplate	Union Optic	WPA2210-650-1100-M25.4	Broadband half waveplate
Achromatic Quarter Waveplate	Union Optic	WPA4210-650-1100-M25.4	Broadband quarter waveplate
Beam Sampler	THORLABS	BSN11	10:90 Plate Beamsplitter
Dichroic Mirror	THORLABS	DMSP1000	Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	472301	Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.
Electrooptic Amplitude Modulator	THORLABS	EO-AM-NR-C1	Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.
False H&E Staining Script	Matlab		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer	PRL-414B	Pulse Research Lab	1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in
Fast Photodiode	THORLABS	DET10A2	Si Detector, 1 ns Rise Time
Frequency Divider	PRL-220A	Pulse Research Lab	TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.
Highly Dispersive Glass Rods	Union Optic	CYLROD01	High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm
Insight DS+	Newport		Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz.
Lock-in Amplifier	Liquid Instruments	Moku Lab	Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.
Mirrors	THORLABS	BB05-E03-10	Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.
Motorized Delay Stage	Zaber	X-DMQ12P-DE52	Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.
Oil Immersion Condensor	Nikon	CSC1003	1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used.
Oscilloscope	Tektronix	TDS7054	Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.
Phase Shifter	SigaTek	SF50A2	For shifting the phase of the modulation frequency
Photodiode	Hamamatsu Corp	S3994-01	Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.
Polarizing Beam Splitter	Union Optic	PBS9025-620-1000	Broadband polarizing beamsplitter
Refactive Index Database			refractiveindex.info
Retro-reflector	Edmund Optics	34-408	BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.
RF Power Amplifier	Minicircuits	ZHL-1-2W+	Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors	Cambridge Technologies	6215H	We used a 5mm mirror set with silver coating
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	Laser scanning microscope control software
Shortpass Filter	THORLABS	FESH1000	25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.
Upright Microscope	Nikon	Eclipse FN1	Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.
Water Immersion Objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.