Dwukolorowe, stymulowane rozpraszaniem Ramana w czasie rzeczywistym mózgu myszy w celu diagnozowania tkanek

Summary

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) jest potężną, nieniszczącą i bezznacznikową techniką obrazowania. Jednym z pojawiających się zastosowań jest stymulowana histologia Ramana, w której dwukolorowe obrazowanie SRS w przejściach Ramana białek i lipidów jest wykorzystywane do generowania obrazów pseudo-hematoksyliny i eozyny. W tym miejscu demonstrujemy protokół dwukolorowego obrazowania SRS w czasie rzeczywistym w diagnostyce tkanek.

Abstract

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) stała się potężną techniką obrazowania optycznego do diagnozowania tkanek. W ostatnich latach wykazano, że dwukolorowy SRS jest w stanie zapewnić obrazy równoważne hematoksylinie i eozynie (H&E), które umożliwiają szybką i wiarygodną diagnozę raka mózgu. Takie możliwości umożliwiły ekscytujące zastosowania w śródoperacyjnej diagnostyce nowotworów. Dwukolorowe obrazowanie tkanki metodą SRS można wykonać za pomocą pikosekundowego lub femtosekundowego źródła laserowego. Lasery femtosekundowe mają tę zaletę, że umożliwiają elastyczne tryby obrazowania, w tym szybkie obrazowanie hiperspektralne i dwukolorowe obrazowanie SRS w czasie rzeczywistym. Podejście skupiające się spektralnie z ćwierkaniem impulsów laserowych jest zwykle stosowane w przypadku laserów femtosekundowych w celu osiągnięcia wysokiej rozdzielczości spektralnej.

Akwizycja dwukolorowego SRS może być realizowana z modulacją ortogonalną i wykrywaniem blokady. Złożoność ćwierkania, modulacji i charakterystyki pulsu jest wąskim gardłem dla powszechnego przyjęcia tej metody. Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół demonstrujący implementację i optymalizację spektralnego ogniskowania SRS oraz dwukolorowego obrazowania tkanki mózgowej myszy w czasie rzeczywistym w trybie epi. Protokół ten może być używany w szerokim zakresie zastosowań obrazowania SRS, które wykorzystują dużą szybkość i możliwości obrazowania spektroskopowego SRS.

Introduction

Tradycyjna diagnostyka tkanek opiera się na protokołach barwienia, po których następuje badanie pod mikroskopem optycznym. Jedną z powszechnych metod barwienia stosowanych przez patologów jest barwienie H&E: hematoksylina barwi jądra komórkowe na fioletowo-niebieski kolor, a eozyna barwi macierz zewnątrzkomórkową i cytoplazmę na różowo. To proste barwienie pozostaje złotym standardem w patologii dla wielu zadań związanych z diagnostyką tkanek, w szczególności w diagnostyce raka. Jednak histopatologia H&E, a w szczególności technika zamrożonego cięcia stosowana w warunkach śródoperacyjnych, nadal ma ograniczenia. Procedura barwienia jest pracochłonnym procesem obejmującym osadzanie tkanek, cięcie, utrwalanie i barwienie¹. Typowy czas realizacji to 20 minut lub dłużej. Wykonywanie H&E podczas sekcjonowania przez zamrożenie może czasami stać się trudniejsze, gdy przetwarzanych jest wiele sekcji jednocześnie ze względu na konieczność oceny cech komórkowych lub wzorców wzrostu w 3D w celu oceny marginesu. Ponadto śródoperacyjne techniki histologiczne wymagają wykwalifikowanych techników i klinicystów. Ograniczenie liczby certyfikowanych patologów w wielu szpitalach jest w wielu przypadkach ograniczeniem dla konsultacji śródoperacyjnych. Ograniczenia te mogą zostać złagodzone dzięki szybkiemu rozwojowi zainteresowania patologią cyfrową i diagnostyką opartą na sztucznej inteligencji². Jednak wyniki barwienia H&E są zmienne, w zależności od doświadczenia technika, co stanowi dodatkowe wyzwanie dla diagnostyki komputerowej².

Te wyzwania mogą być potencjalnie rozwiązane za pomocą technik obrazowania optycznego bez etykiet. Jedną z takich technik jest mikroskopia SRS. SRS wykorzystuje zsynchronizowane lasery impulsowe - pompę i Stokesa - do wzbudzania drgań molekularnych z wysoką wydajnością³. Ostatnie doniesienia wykazały, że obrazowanie białek i lipidów metodą SRS może generować obrazy równoważne H&E (znane również jako stymulowana histologia Ramana lub SRH) z nienaruszoną świeżą tkanką, co omija potrzebę przetwarzania jakichkolwiek tkanek, znacznie skraca czas potrzebny na diagnozę i zostało dostosowane śródoperacyjnie⁴. Co więcej, obrazowanie SRS może dostarczać obrazy 3D, które dostarczają dodatkowych informacji do diagnozy, gdy obrazy 2D są niewystarczające⁵. SRH jest bezstronny i generuje obrazy cyfrowe, które są łatwo dostępne do diagnozy komputerowej. Szybko pojawia się jako możliwe rozwiązanie dla śródoperacyjnej diagnostyki raka i analizy marginesu guza, zwłaszcza w raku mózgu^6,7,8. Ostatnio zasugerowano również, że obrazowanie SRS zmian chemicznych w tkance dostarcza użytecznych informacji diagnostycznych, które mogą dodatkowo pomóc klinicystom w stratyfikacji różnych typów lub etapów raka⁹.

Pomimo ogromnego potencjału w zastosowaniach do diagnostyki tkanek, obrazowanie SRS jest głównie ograniczone do laboratoriów akademickich specjalizujących się w optyce, ze względu na złożoność związaną z platformą obrazowania, która obejmuje ultraszybkie lasery, laserowy mikroskop skaningowy i zaawansowaną elektronikę detekcyjną. Protokół ten zapewnia szczegółowy przepływ pracy w celu zademonstrowania wykorzystania powszechnego źródła lasera femtosekundowego do dwukolorowego obrazowania SRS w czasie rzeczywistym i generowania obrazów pseudo-H&E z tkanki mózgowej myszy. Protokół będzie obejmował następujące procedury:

Optymalizacja wyrównania i ćwierkania
Większość schematów obrazowania SRS wykorzystuje lasery pikosekundowe lub femtosekundowe jako źródło wzbudzenia. W przypadku laserów femtosekundowych szerokość pasma lasera jest znacznie większa niż szerokość linii Ramana. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, stosuje się podejście skupiające spektralne, aby ustawić lasery femtosekundowe do pikosekundowej skali czasowej w celu uzyskania wąskiej rozdzielczości spektralnej¹⁰. Optymalna rozdzielczość spektralna jest osiągana tylko wtedy, gdy czasowe ćwierkanie (znane również jako dyspersja opóźnienia grupowego lub po prostu dyspersja) jest odpowiednio dopasowane do pompy i laserów Stokesa. Procedura wyrównywania i kroki potrzebne do optymalizacji dyspersji wiązek laserowych przy użyciu wysoce dyspersyjnych prętów szklanych są pokazane tutaj.

Kalibracja częstotliwości
Zaletą ogniskowania spektralnego SRS jest to, że wzbudzenie Ramana można szybko dostroić, zmieniając opóźnienie czasowe między pompą a laserami Stokesa. Takie dostrajanie zapewnia szybkie obrazowanie i niezawodną akwizycję spektralną w porównaniu z dostrajaniem długości fal laserowych. Jednak liniowa zależność między częstotliwością wzbudzenia a opóźnieniem czasowym wymaga kalibracji zewnętrznej. Rozpuszczalniki organiczne ze znanymi pikami Ramana są używane do kalibracji częstotliwości Ramana dla ogniskowania widmowego SRS.

Obrazowanie dwukolorowe w czasie rzeczywistym<br /> Ważne jest, aby zwiększyć szybkość obrazowania w zastosowaniach do diagnostyki tkanek, aby skrócić czas potrzebny na analizę dużych próbek tkanek. Jednoczesne dwukolorowe obrazowanie SRS lipidów i białek eliminuje potrzebę dostrajania lasera lub opóźnienia czasowego, co zwiększa prędkość obrazowania ponad dwukrotnie. Osiągnięto to dzięki zastosowaniu nowatorskiej techniki modulacji ortogonalnej i dwukanałowej demodulacji ze wzmacniaczem typu lock-in¹¹. W artykule opisano protokół modulacji ortogonalnej i dwukanałowej akwizycji obrazu.

Epi-mode SRS imaging
Większość dotychczas pokazanych obrazowań SRS jest wykonywana w trybie transmisyjnym. Obrazowanie w trybie Epi wykrywa wstecznie rozproszone fotony z tissue¹². W przypadku zastosowań patologicznych próbki chirurgiczne mogą być dość duże. W przypadku obrazowania w trybie transmisyjnym często konieczne jest cięcie tkanek, co w niepożądany sposób wymaga dodatkowego czasu. W przeciwieństwie do tego, obrazowanie w trybie epi może działać z nienaruszonymi próbkami chirurgicznymi. Ponieważ ten sam obiektyw jest używany do zbierania światła rozproszonego wstecznie, nie ma również potrzeby ustawiania kondensora o dużej aperturze numerycznej wymaganego do obrazowania transmisyjnego. Tryb Epi jest również jedyną opcją, gdy cięcie tkanek jest trudne, na przykład w przypadku kości. Wcześniej wykazaliśmy, że w przypadku tkanki mózgowej obrazowanie w trybie epi zapewnia lepszą jakość obrazowania dla grubości tkanki > 2 mm¹³. Protokół ten wykorzystuje polaryzacyjny rozdzielacz wiązki (PBS) do zbierania rozproszonych fotonów zdepolaryzowanych przez tkankę. Możliwe jest zebranie większej ilości fotonów za pomocą detektora pierścieniowego kosztem złożoności dostosowanego zestawu detektora¹². Podejście PBS jest prostsze do wdrożenia (podobnie jak fluorescencyjne), przy czym standardowa fotodioda jest już używana do wykrywania trybu transmisji.

Generowanie obrazów pseudo-H&E
Po zebraniu dwukolorowych obrazów SRS można je ponownie pokolorować, aby symulować barwienie H&E. W artykule przedstawiono procedurę przekształcania obrazów SRS lipidów i białek w obrazy pseudo-H&E SRS do zastosowań patologicznych. Protokół eksperymentalny szczegółowo opisuje kluczowe kroki potrzebne do wygenerowania wysokiej jakości obrazów SRS. Przedstawiona tutaj procedura ma zastosowanie nie tylko w diagnostyce tkanek, ale może być również dostosowana do wielu innych zastosowań obrazowania hiperspektralnego SRS, takich jak obrazowanie leków i obrazowanie metaboliczne^14,15.

Ogólne wymagania systemowe
System laserowy dla tego protokołu musi być w stanie wyprowadzić 2 zsynchronizowane femtosekundowe wiązki laserowe. Idealnie nadaje się do wyposażenia w optyczny oscylator parametryczny (OPO) do dostrajania jednej z wiązek laserowych o szerokiej długości fali. Konfiguracja w tym protokole wykorzystuje komercyjny system laserowy Insight DS+, który wysyła dwa lasery (jeden o stałej wiązce o długości fali 1 040 nm i jedną przestrajalną wiązkę opartą na OPO, w zakresie od 680 do 1 300 nm) z częstotliwością powtarzania 80 MHz. Laserowe mikroskopy skaningowe, zarówno od głównych producentów mikroskopów, jak i zbudowane w domu, mogą być używane do obrazowania SRS. Zastosowany mikroskop to pionowy laserowy mikroskop skaningowy zbudowany na komercyjnej ramie mikroskopu pionowego. Do skanowania wiązki laserowej służy para luster galvo o średnicy 5 mm. Użytkownicy, którzy zdecydują się na domowy laserowy mikroskop skaningowy, powinni zapoznać się z wcześniej opublikowanym protokołem budowy laserowego mikroskopu skaningowego¹⁶.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

Wszystkie eksperymentalne procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone na 200 μm, stałych, podzielonych na sekcje mózgach myszy, zgodnie z protokołem (# 4395-01) zatwierdzonym przez Komitet Instytutu Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Waszyngtońskiego. Myszy typu dzikiego (szczep C57BL/6J) są poddawane eutanazji za pomocą CO₂ . Następnie wykonuje się kraniotomię w celu ekstrakcji mózgów w celu utrwalenia w 4% paraformaldehydzie w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami. Mózgi są osadzone w mieszaninie 3% agarozy i 0,3% żelatyny i podzielone na plastry o grubości 200 μm za pomocą wibratomu.

1. Początkowe wyrównanie

UWAGA: Upewnij się, że rozmiar wiązki i rozbieżność obu ramion są dopasowane dla najlepszej czułości i rozdzielczości. Skolimuj pompę i wiązki Stokesa i dostosuj ich rozmiary, zanim trafią do laserowego mikroskopu skaningowego. Aby to zrobić, użyj pary soczewek achromatycznych dla każdej wiązki przed połączeniem ich na zwierciadle dichroicznym. Zawsze noś odpowiednie gogle laserowe do wyrównania wiązki.

1. Kolimacja wiązki
   1. Zamontuj parę soczewek achromatycznych do belki pompy. Jako punkt wyjścia użyj soczewki 100 mm i soczewki 200 mm, aby powiększyć rozmiar wiązki laserowej 2-krotnie. Upewnij się, że odległość między dwoma soczewkami wynosi około 300 mm. Ustaw belkę pompy przez środek obu soczewek.
   2. Umieść lustro za drugą soczewką, aby skierować wiązkę w kierunku ściany (w odległości >1 m). Zachowaj ostrożność podczas wysyłania wiązki na duże odległości. Śledź wiązkę od lustra do ściany za pomocą karty IR i sprawdź, czy wiązka zmienia swój rozmiar. Skolimuj wiązkę, jeśli belka zmienia swój rozmiar w funkcji odległości.
      1. Jeśli wiązka jest zbieżna (zmniejszając rozmiar wraz z propagacją), przesuń obie soczewki bliżej.
      2. Jeśli wiązka rozchodzi się (zwiększa rozmiar wraz z propagacją), odsuń obie soczewki od siebie. Dostosuj odległość, aż wiązka zostanie skolimowana.
   3. Powtórz kroki 1.1.1 i 1.1.2 dla belki Stokesa, aby skolimować wiązkę.
2. Regulacja rozmiaru wiązki
   1. Jeśli dostępny jest profilometr belki, zmierz rozmiar skolimowanej belki dla każdej belki. Alternatywnie można oszacować rozmiar wiązki za pomocą karty IR i linijki, aby uzyskać średnicę wiązki 4-5 mm.
   2. Jeśli rozmiar wiązki jest za mały lub za duży, zmień parę soczewek używaną w kroku 1.1. Wyreguluj parę soczewek, aż obie wiązki będą miały średnicę 4-5 mm.
      UWAGA: Powiększenie wiązki to stosunek ogniskowej drugiego obiektywu do pierwszego obiektywu (f₂/f₁).
3. Nakładanie się przestrzenne
   UWAGA: Obrazowanie SRS wymaga, aby obie wiązki laserowe były połączone w przestrzeni i czasie, aby wzbudzić drgania molekularne. Schemat obrazowania SRS z ogniskowaniem spektralnym jest pokazany na Rysunek 1.
   1. Połącz dwie wiązki laserowe, instalując lusterko dichroiczne z kilkoma lusterkami kierowniczymi do regulacji. Zoptymalizuj przestrzenne nakładanie się pompy i Stokesa, monitorując wiązki za zwierciadłem dichroicznym w dwóch różnych miejscach oddalonych od siebie (~1 m). Iteracyjnie wyreguluj lusterko kierownicze przed lusterkiem dichroicznym i lusterkiem dichroicznym, aby wyrównać belkę Stokesa z belką pompy.
      UWAGA: Jeśli dwie belki nakładają się przestrzennie w obu położeniach, są one wystarczająco zachodzące na siebie.
   2. Upewnij się, że połączone wiązki są wysyłane do środka lusterek skanujących laserowego mikroskopu skaningowego, regulując parę lusterek sterujących, gdy lusterka skanujące znajdują się w pozycji zaparkowanej. Upewnij się, że obie wiązki przechodzą przez środek obiektywu mikroskopu i kondensatora.
   3. Po kondensatorze użyj kolejnej pary soczewek o ogniskowych odpowiednio 100 mm i 30 mm, aby przekazać transmitowaną wiązkę na fotodiodę. Upewnij się, że obie wiązki są zawarte w fotodiodzie i zainstaluj dwa filtry dolnoprzepustowe, aby zablokować modulowaną wiązkę Stokesa.

2. Detekcja sygnału SRS

1. Modulacja elektrooptyczna (EOM)
   UWAGA: EOM 20 MHz służy do modulacji amplitudy Stokesa. Jak omówiono później, EOM wywodzi się z ciągu impulsów laserowych 80 MHz, który jest wymagany do modulacji ortogonalnej. Inne częstotliwości modulacji mogą być używane, jeśli wykonywany jest tylko jednokolorowy lub hiperspektralny SRS. W takim przypadku synchronizacja częstotliwości modulacji z częstotliwością lasera nie jest konieczna. Do sterowania EOM można użyć generatora częstotliwości ze wzmacniaczem mocy RF. W rezultacie kroki 2.1.1-2.1.4 można pominąć.
   1. Umieść próbnik wiązki na ścieżce wiązki Stokesa, aby wychwycić 10% wiązki i wysłać ją do szybkiej fotodiody w celu wykrycia ciągu impulsów 80 MHz.
      UWAGA: Sygnał fotodiody jest wysyłany do dzielnika częstotliwości w celu wygenerowania wyjścia TTL 20 MHz. To wyjście jest następnie wysyłane do bufora fanout w celu replikacji wyjścia do czterech identycznych wyjść 20 MHz. Jedno z wyjść służy do wyzwalania oscyloskopu.
   2. Weź jedno z wyjść bufora fanout i przefiltruj je filtrem pasmowoprzepustowym, aby uzyskać falę sinusoidalną 20 MHz. Użyj tłumika RF, aby dostosować napięcie wyjściowe między szczytami do ~500 mV.
   3. Wyślij wynikowe wyjście do przesuwnika fazowego, który umożliwia precyzyjną regulację fazy RF za pomocą źródła napięcia. Wyślij to wyjście do wzmacniacza mocy RF i podłącz wyjście amplifier do EOM.
   4. Odblokuj wiązkę Stokesa i zoptymalizuj głębokość modulacji EOM1, umieszczając fotodiodę na ścieżce wiązki. Dostosuj napięcie EOM i płytkę ćwierćfalową, aż głębokość modulacji (stosunek doliny do szczytu) będzie zadowalająca.
      UWAGA: Przy modulacji 20 MHz (1/4 częstotliwości powtarzania lasera) spodziewane są dwa impulsy co 50 ns.
2. Nakładanie się czasowe
   UWAGA: Czasowe nakładanie się pompy i Stokesa osiąga się poprzez opóźnienie jednego z dwóch ciągów impulsów laserowych za pomocą retroreflektora zamontowanego na stopniu opóźniającym (Rysunek 1 pokazuje opóźnienie Stokesa). Zgrubne nakładanie się jest monitorowane za pomocą oscyloskopu, a dokładne nakładanie jest monitorowane przez sygnał SRS. Dokładne nakładanie się czasowe można również osiągnąć za pomocą autokorelatora, jeśli jest dostępny.
   1. Umieść fotodiodę za lustrem dichroicznym, aby wykryć wiązkę laserową. Najpierw zablokuj belkę Stokesa. Powiększ jeden ze szczytów impulsów pompy na oscyloskopie. Umieść pionowy kursor, aby zaznaczyć czasowe położenie tego piku za pomocą oscyloskopu.
   2. Zablokuj belkę pompy i odblokuj belkę Stokesa. Przetłumacz opóźnienie stage, aby czasowo dopasować pozycję szczytową na oscyloskopie do zaznaczonej pozycji w poprzednim kroku. Zobacz Rysunek 2 pokazuje czasowe nakładanie się dwóch wiązek.
      1. (OPCJONALNIE) Jeśli translacja stopnia opóźniającego jest niewystarczająca do czasowego dopasowania dwóch wiązek, przesuń stopień opóźniający do środka jego zakresu ruchu.
      2. Oblicz odległość opóźnienia wymaganą do dopasowania dwóch wiązek, biorąc różnicę czasową między dwiema wiązkami i mnożąc różnicę przez prędkość światła, aby znaleźć odległość potrzebną do czasowego dopasowania dwóch wiązek.
      3. Wydłuż tor wiązki szybszej wiązki lub skróć tor wiązki wolniejszej wiązki, aby z grubsza dopasować odpowiednio opóźnienie czasowe.
   3. Przygotuj próbkę szkiełka mikroskopowego z DMSO i taśmą dwustronną jako przekładką do przytrzymania próbki między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym.
   4. Umieść próbkę na mikroskopie stroną z szkiełkiem nakrywkowym skierowaną w stronę obiektywu mikroskopu. Zmień mikroskop na oświetlenie jasnego pola i obserwuj próbkę z okularu. Znajdź punkt skupienia próbki, znajdując najpierw punkt skupienia zarówno na górnej, jak i dolnej warstwie pęcherzyków powietrza na styku taśmy szklanej, a następnie przesuń fokus tak, aby znajdował się między dwiema warstwami taśmy.
      UWAGA: Upewnij się, że wiązki laserowe są zablokowane przed spojrzeniem w okular.
   5. Ustaw moc wyjściową wiązki przestrajalnej na 798 nm. W oparciu o przepustowość optyczną kondensatora, dostosuj moc optyczną na ~40 mW dla pompy i wiązek Stokesa na ognisku obiektywu.
   6. Otwórz ScanImage w MATLAB (lub innym oprogramowaniu do skanowania, które steruje mikroskopem) i kliknij przycisk oznaczony FOCUS, aby rozpocząć skanowanie.
      UWAGA: Wiązki laserowe zostaną zeskanowane rastrowo przez próbkę w celu wygenerowania obrazu. Sygnał wyjściowy niskiej częstotliwości z fotodiody (<100 kHz) jest przesyłany bezpośrednio do kanału 1 karty akwizycji danych (określanego jako kanał DC). Wyjście wysokiej częstotliwości (>100 kHz) z fotodiody jest przesyłane do wzmacniacza lock-in, a wyjście X sygnału wzmacniacza lock-in jest wysyłane do kanału 2 karty akwizycji danych (określanego jako kanał AC).
   7. Wyreguluj lusterko kierownicze przed skanerem galvo, aby wyśrodkować sygnał DC na wyświetlaczu kanału 1. Przesuń zmotoryzowany stopień opóźniający i uważnie obserwuj wyjście blokujące pokazane na wyświetlaczu kanału 2 (tj. kanału AC).
      UWAGA: Gdy pompa i Stokes zbiegną się w czasie, na kanale AC pojawi się sygnał. Pomocne jest dostosowanie skali kolorów kanału AC w celu wyświetlenia niewielkiej zmiany intensywności.
   8. Zmaksymalizuj intensywność sygnału AC, precyzyjnie dostosowując opóźnienie czasowe. Wyreguluj zwierciadło dichroiczne, aby wyśrodkować sygnał SRS na kanale AC (utrzymując kanał DC wyśrodkowany). Dostosuj fazę lock-in amplifier, aby zmaksymalizować sygnał. Zobacz Rysunek 3, aby uzyskać zadowalający sygnał.

3. Optymalizacja rozdzielczości spektralnej

UWAGA: Pompa i wiązki Stokesa docierające do próbki powinny mieć taką samą ilość grupowej dyspersji opóźnionej (GDD), aby zmaksymalizować rozdzielczość spektralną. Dyspersja zależy w dużej mierze od konfiguracji eksperymentalnej. Opisana tutaj konfiguracja eksperymentalna wykorzystuje impulsy femtosekundowe o długości fali 1040 nm i 800 nm odpowiednio jako Stokesa i pompę. Jako medium rozciągające impulsowo stosuje się pręty ze szkła krzemiennego o gęstości (H-ZF52A).

1. Włożyć 48 cm pręta szklanego o wysokiej dyspersji (H-ZF52A lub równoważne gęste szkło krzemienne) do ścieżki wiązki o długości fali 800 nm. Oszacuj GDD za pomocą równania (1):
   (1)
   UWAGA: GVD różnych materiałów szklanych o różnych długościach fal można znaleźć w zasobie bazy danych indeksu refrakcji. Na przykład H-ZF52A ma DMC 220,40 fs²/mm przy 800 nm. Całkowita GDD wynosi 105792 fs².
2. Oblicz, ile cm dyspersyjnego pręta szklanego jest potrzebne, aby dodać go do ścieżki wiązki 1,040 nm, aby dopasować GDD pompy. Włożyć odpowiednią długość dyspersyjnych prętów szklanych do ścieżki wiązki 1,040 nm, aby w przybliżeniu dopasować GDD wiązki 800 nm. Należy pamiętać, że dodanie szklanych prętów zmieni czasowe nakładanie się dwóch belek i może być konieczna regulacja opóźnienia.
3. Kalibracja rozdzielczości spektralnej
   1. Wykonaj próbkę szkiełka mikroskopowego za pomocą DMSO. Umieść szkiełko na mikroskopie i sprawdź moc wiązek wychodzących z kondensatora mikroskopu. Dostosuj odpowiednio moc, aby mieć ~40 mW każdy przy próbce ostrości.
   2. Otwórz program ScanImage z programu MATLAB. Znajdź maksymalny sygnał SRS, skanując stopień opóźniający, który odpowiada pikowi ramanowskiemu DMSO wynoszącemu 2,913 ^cm-1. Oszacuj pozycję stolika na podstawie poprzedniego położenia stolika ze zwiększoną długością ścieżki optycznej spowodowaną włożeniem prętów. Wyrównaj przestrzenne nakładanie się belki ze względu na niewielkie odchylenie belki podczas dodawania prętów szklanych.
   3. Zapisz hiperspektralny skan SRS, sekwencyjnie wykonując serię obrazów SRS podczas przesuwania zmotoryzowanego stolika.
      UWAGA: Zakres skanowania opóźnienia obejmuje dwa piki Ramana, odpowiadające odpowiednio pikom Ramana 2,913 ^cm-1 i 2,994 ^cm-1 DMSO. Te dwa przejścia obserwuje się przy użyciu pompy o długości fali 800 nm i lasera Stokesa o długości fali 1040 nm.
   4. Wykreśl widma SRS roztworu DMSO za pomocą ImageJ lub MATLAB. Dopasuj duży pik DMSO 2,913 ^cm-1 do funkcji Gaussa lub Lorentza w MATLAB, aby obliczyć pełną szerokość przy połowie maksimum (FWHM) szczytu.
      UWAGA: Reprezentatywne wyniki są pokazane w Rysunek 4. Jeśli obecny jest tylko jeden szeroki pik, oznacza to, że albo rozdzielczość widmowa jest zbyt niska, aby rozróżnić dwa piki i potrzeba więcej szklanych pręcików, albo skanowany zakres był zbyt mały, aby wykryć drugi pik. Zazwyczaj akceptowalna rozdzielczość spektralna DMSO wynosi ~20-25 ^cm-1, gdy stosuje się pręty szklane o długości >60 cm. Niższa rozdzielczość jest często używana do obrazowania tkanek w celu wymiany na wyższe sygnały o krótszych impulsach¹⁷.
4. (OPCJONALNIE) Użyj autokorelatora lub FROG (Frequency-Resolved Optical Gating), aby określić czas trwania impulsu każdego ramienia, aby dokładnie obliczyć ilość GDD i długość prętów potrzebnych do dopasowania GDD między pompą a Stokesem.
5. Powtórz kroki 3.3.2-3.3.4 dla różnych długości prętów na belce Stokesa, aby znaleźć optymalną rozdzielczość spektralną, co oznacza, że eksperymentalnie znaleziono najlepsze dopasowanie GDD. Użyj wielu zestawów szklanych prętów o różnej długości, aby uzyskać optymalną rozdzielczość spektralną.

4. Charakterystyka sygnału do szumu (SNR)

1. Upewnij się, że krok 4.2 został wykonany po całkowitym wyrównaniu przestrzennym i czasowym.
2. Uzyskaj obraz SRS odpowiadający pikowi ramanowskiemu DMSO wynoszącemu 2 913 ^cm-1. Otwórz obraz w ImageJ i wybierz mały obszar na środku ramki. Funkcja miary służy do obliczania średniej i odchylenia standardowego wartości w wybranym obszarze.
3. Podziel średnią wartość wybranego obszaru przez odchylenie standardowe, aby znaleźć wartość SNR, jak w Równaniu (2).
   (2)
   UWAGA: Dobry stosunek sygnału do szumu (ze stałą czasową blokady wynoszącą 4 μs) przy DMSO przy 40 mw/40 mw przy ostrości dla obu ramion wynosi >800. Niższe stężenia DMSO lub niższa moc mogą być używane do dokładniejszego oszacowania SNR, jeśli karta akwizycji danych ma ograniczoną głębię bitową.
4. Jeśli SNR jest zbyt niski, ponownie wyrównaj impulsy laserowe, aby zoptymalizować nakładanie przestrzenne, nakładanie czasowe, dopasowanie rozmiaru wiązki/kolimacji i/lub dopasowanie dyspersji. W przypadku obiektywu z kołnierzem korekcyjnym należy zoptymalizować sygnał, regulując kołnierz korekcyjny.

5. Kalibracja osi częstotliwości

UWAGA: Ten krok jest wykonywany w celu powiązania pozycji etapu opóźnienia z zeskanowanym przejściem Ramana. Staranny dobór rozpuszczalników jest wymagany do wygenerowania odpowiedniej "linijki Ramanowskiej". DMSO jest skutecznym rozpuszczalnikiem dla wiązań CH, ponieważ ma dwa ostre piki Ramana na 2,913 ^cm-1 i 2,994 ^cm-1.

1. Zapisz skan hiperspektralny z zakresem etapów opóźnienia obejmującym piki Ramana DMSO o długości 2 913 ^cm-1 i 2 994 ^cm-1. Zapisz pozycje stołu montażowego odpowiadające zestawowi danych hiperspektralnych.
   UWAGA: Globalny maksymalny pik widma odpowiada przesunięciu Ramana DMSO 2,913 ^cm-1, a drugi maksymalny pik odpowiada przesunięciu Ramana DMSO 2,994 ^cm-1.
2. Wykonaj regresję liniową dla pozycji sceny i przesunięć Ramana przy 2,913 ^cm-1 i 2,994 ^cm-1. Korzystając z równania regresji liniowej wiążącego położenie etapu z przesunięciem Ramana, przelicz pozycje opóźnienia na odpowiednie częstotliwości Ramana.

6. Modulacja ortogonalna i obrazowanie dwukolorowe

UWAGA: Krok modulacji ortogonalnej jest konieczny tylko wtedy, gdy potrzebne jest obrazowanie dwukolorowe w czasie rzeczywistym. Schemat tego schematu pokazany jest w Rysunek 5. Modulacja ortogonalna wykorzystuje parę EOM napędzanych jedną czwartą częstotliwości lasera (20 MHz dla lasera 80 MHz) z przesunięciem fazowym między nimi o 90°. Ten ortogonalny krok modulacji można pominąć w przypadku jednokolorowego obrazowania SRS lub hiperspektralnego obrazowania SRS.

1. Modulacja EOM1
   1. Zainstaluj PBS (PBS2), płytkę ćwierćfalową (QWP2) i drugi EOM (EOM2) w ścieżce wiązki Stokesa po pierwszym EOM. Odłącz wejście sygnału od EOM2. Podłącz wejście sygnału do EOM1 i włącz je.
   2. Moduluj wiązkę Stokesa (ustaloną na 1,040 nm) przy 20 MHz (f₀/4), wysyłając wiązkę przez pierwszy EOM. Dostosuj nachylenie i położenie EOM1, aby upewnić się, że wiązka uderza prosto i wyśrodkowana przez kryształ EOM.
   3. Monitoruj głębokość modulacji, obserwując obie polaryzacje wychodzące z PBS1 za pomocą dwóch fotodiod i wyświetlając modulację na oscyloskopie.
   4. Dostosuj napięcie QWP1, EOM1 i fazę wejścia 20 MHz (za pomocą przesuwnika fazowego), aby zoptymalizować głębokość modulacji przesyłanej wiązki tak, aby była bliska 100%. Zobacz Rysunek 2B dla ilustracji dobrej głębokości modulacji.
2. Modulacja EOM2
   1. Odłącz EOM1 i podłącz EOM2.
   2. Wyślij wyjście wysokiego napięcia drugiego wzmacniacza o częstotliwości 20 MHz do EOM2. Dostosuj nachylenie i położenie EOM2, aby upewnić się, że wiązka uderza prosto i wyśrodkowana przez kryształ EOM.
   3. Po raz kolejny monitoruj głębokość modulacji, patrząc na obie polaryzacje wychodzące z PBS2 za pomocą oscyloskopu. Dostosuj napięcie QWP2, EOM2 i przesuwnik fazowy zgodnie z potrzebami, aby uzyskać modulację bliską 100% dla obu polaryzacji.
   4. Upewnij się, że modulacja ciągu impulsów ma przesunięcie fazowe o 90° od pierwszej modulacji.
      UWAGA: Jeśli dwa ciągi impulsów pompy nie są ortogonalne pod kątem 90°, przesłuch między dwoma kanałami będzie problemem.
   5. Przetestuj ortogonalność modulacji, włączając i podłączając zarówno EOM1, jak i EOM2. Monitoruj obie polaryzacje dzielone przez PBS2 za pomocą oscyloskopu. Zoptymalizuj ponownie EOM1 i EOM2 indywidualnie, jeśli ciąg impulsów po drugim PBS nie przypomina Rysunek 2C.
   6. Zainstaluj 20-milimetrowy dwójłomny kryształ kwarcu (BRC) i HWP za EOM2. Podłącz oba EOM jednocześnie i monitoruj ciąg impulsów tak, aby przypominał Rysunek 2D.
      UWAGA: Dla ćwierkania użytego w tym eksperymencie, 20 mm BRC indukuje opóźnienie czasowe, które odpowiada przesunięciu Ramana o 80 ^cm-1. Inna długość BRC może być potrzebna, jeśli używany jest inny ćwierk
   .
3. wzorcowanie
   1. Skalibruj system za pomocą DMSO, wykrywając sygnały z wyjścia kanału X i Y wzmacniacza lock-in (wysyłane do kanałów 2 i 3 karty akwizycji danych).
   2. Sprawdź, czy sygnały generowane przez szczyt 2,913 ^cm-1 z szybszej polaryzacji i te z wolniejszej polaryzacji są bliskie 90° przesunięcia w fazie na wzmacniaczu lock-in. Jeśli tak nie jest, dostosuj wyrównanie EOM, aż oba sygnały będą bliskie 90° przesunięcia w fazie.
   3. Po zakończeniu kalibracji znajdź pozycję opóźnienia, która sonduje przejście białka na 2,930 ^cm-1 dla jednej z wiązek ortogonalnych. Upewnij się, że druga polaryzacja sonduje przejście lipidowe 2,850 ^cm-1.

7. Obrazowanie SRS w trybie Epi

UWAGA: W schemacie obrazowania w trybie transmisji, obiektyw skupia laser na próbce, a następnie soczewka kondensatora kieruje transmitowaną wiązkę do fotodiody w celu wykrycia blokady. W schemacie obrazowania w trybie epi światło, które jest wstecznie rozpraszane i depolaryzowane przez próbkę, jest zbierane przez obiektyw skupiający i izolowane za pomocą polaryzacyjnego rozdzielacza wiązki. Wyizolowane i rozproszone wstecznie fotony są wysyłane do fotodiody przez parę soczewek przekaźnikowych w celu wykrycia blokady. Rysunek 6 przedstawia schemat obrazowania w trybie epi.

1. Zainstaluj HWP, zanim wiązka wejdzie do mikroskopu, aby zmienić polaryzację wiązki wchodzącej do mikroskopu. Umieść PBS nad obiektywem, aby zdepolaryzowana wiązka odbita wstecznie mogła dotrzeć do detektora.
2. Użyj pary soczewek składających się z soczewki achromatycznej 75 mm i soczewki asferycznej 30 mm, aby przekazać fotony rozproszone wstecznie z tylnej apertury obiektywu do fotodetektora. Zamontuj detektor, aby zebrać światło rozproszone wstecznie kierowane przez PBS. Zainstaluj filtr, aby zablokować modulowaną wiązkę przed wejściem do detektora.
3. Umieść próbkę tkanki pod obiektywem. Ponieważ kondensator nie jest potrzebny do obrazowania w trybie epi, wyjmij go, jeśli wymagane jest więcej miejsca.
4. Obrazowania
   1. Zablokuj wiązkę za pomocą migawki; skieruj białe źródło światła na próbkę z boku i użyj jasnego pola, aby znaleźć obiektywną ostrość.
   2. Odblokuj obie wiązki i użyj wstępnie skalibrowanych pozycji opóźnienia, aby uzyskać obrazy SRS lipidów i białek z tkanki z dwóch wyjść wzmacniacza lock-in.
   3. Dostosuj wzmocnienie blokady i współczynnik pojemnika pikseli, aby uzyskać obrazy dobrej jakości.

8. Barwienie fałszywymi kolorami

1. Otwórz stos obrazów za pomocą ImageJ.
2. Wyciągnij dwa obrazy, które odpowiadają gatunkom lipidów (2,850 ^cm-1) i białek (2,930 ^cm-1), klikając obraz prawym przyciskiem myszy i klikając Duplikuj.
3. Zmień nazwę obrazu lipidów na lipidy, a obrazu białka na białka.
4. Przejdź do punktu menu Proces | Kalkulator obrazów i wykonaj białka odejmujące lipidy.
5. Połącz obrazy, przechodząc do punktu menu Obraz | Kolor | Połącz kanały, ustawiając lipidy na zielony, a białka na niebieski. Otwórz narzędzie Kanały obrazów (punkt menu Obraz | Kolor | Kanały) i dostosuj jasność i kontrast (Obraz | Dostosuj | Jasność/Kontrast).
6. Dostosuj jasność i kontrast dla każdego kanału za pomocą narzędzia kanały. W przypadku kanału lipidowego dostosuj kontrast, aż cechy komórkowe staną się ciemne. W przypadku kanału białkowego dostosuj kontrast, aż cechy komórkowe staną się niebieskie. Przekonwertuj zielony/niebieski obraz scalonego kanału na obraz RGB, przechodząc do punktu menu Obraz | Rodzaj | Kolor RGB. Eksportuj ten obraz według Plik | Zapisz jako | Tiff.
   UWAGA: W przypadku fałszywego barwienia H&E schemat kolorów pokazuje różową cytoplazmę, podczas gdy jądra są ciemnoniebiesko-fioletowe.
7. Pobierz skrypt HE.m MATLAB z fałszywego zasobu skryptu barwienia H&E w tabeli materiałów.
8. Uruchom skrypt HE.m w programie MATLAB. Wybierz wyeksportowany obraz RGB z poprzedniego kroku, aby wygenerować sztucznie wybarwiony obraz H&E.
9. (OPCJONALNIE) Znormalizuj intensywność obrazu w przypadku obrazowania o dużym polu widzenia, ponieważ obraz jest ciemniejszy na obrzeżach niż w środku.
   1. Aby przeprowadzić normalizację pól obrazów, uśrednij jak najwięcej obrazów. Następnie usuń cechy intensywności za pomocą ImageJ (Process | Filtry | Rozmycie gaussowskie | Promień=50).
   2. Zmierz maksymalną intensywność rozmytego obrazu (Ctrl+M). Podziel rozmyty obraz przez maksymalną intensywność (punkt menu Process | Matematyka | Dzielić). Podziel surowy obraz SRS przez obraz rozmyty (punkt menu Process | Obraz | Kalkulator).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Optymalizacja rozdzielczości spektralnej:
Na dyspersję w materiale ma wpływ ośrodek dyspersyjny (długość i materiał) oraz długość fali. Zmiana długości pręta dyspersyjnego wpływa na rozdzielczość widmową i rozmiar sygnału. Jest to relacja dawania i brania, która może być ważona w różny sposób w zależności od zastosowania. Pręciki rozciągają impuls wiązki od szerokiego pod względem częstotliwości i wąskiego w czasie do wąskiego pod względem częstotliwości i sz...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Dwukolorowy schemat obrazowania SRS przedstawiony w tym protokole opiera się na prawidłowej implementacji jednokolorowego obrazowania SRS. W jednokolorowym obrazowaniu SRS krytycznymi etapami są wyrównanie przestrzenne, wyrównanie czasowe, głębokość modulacji i przesunięcie fazowe. Przestrzenne połączenie dwóch wiązek odbywa się za pomocą zwierciadła dichroicznego. Kilka lusterek kierowniczych służy do precyzyjnej regulacji podczas wysyłania wiązek światła do lusterka dichroicznego. Po połączeniu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soczewka achromatyczna 100 mm	THORLABS	AC254-100-B	szerokopasmowa, 650 - 1,050 nm, ogniskowa obiektywu achromatycznego
filtr pasmowo-przepustowy	Miniukłady	BBP-21.4 +	Lumped LC Band Pass Filter, 19,2 - 23,6 MHz, 50 Ω
Soczewka achromatyczna 200 mm	THORLABS	AC254-200-B	Szerokopasmowa, 650 - 1,050 nm, ogniskowa soczewki achromatycznej, 200 mm
Achromatyczna półfalowa	Union Optic	WPA2210-650-1100-M25.4	Szerokopasmowa półfalowa
Achromatyczna ćwierćfalowa	płyta optyczna	Union Optic WPA4210-650-1100-M25.4	Szerokopasmowa ćwierćfalowa
Beam Sampler	THORLABS	BSN11	10:90 Płytowy rozdzielacz wiązki
Lustro dichroiczne	THORLABS	DMSP1000	Można stosować inne dichroiki o środkowej długości fali około 1,000 nm.
DMSO (dimetylosulfotlenek)	Sigma Aldrich	472301	Rozpuszczalnik do kalibracji przesunięcia Ramana. Można stosować inne rozpuszczalniki o znanych pikach Ramana.
Elektrooptyczny modulator amplitudy	THORLABS	EO-AM-NR-C1	Do modulacji ortogonalnej i obrazowania dwukanałowego potrzebne są dwa EOM. Zalecana jest wersja rezonansowa, aby można było zastosować niższe napięcie sterujące.
Fałszywy H& E Staining Script	Matlab		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer	PRL-414B	Pulse Research Lab	1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, do generowania częstotliwości sterującej EOM i odniesienia do blokady
Szybka fotodioda	THORLABS	DET10A2	Si Detector, 1 ns Increase
Time Frequency Divider	PRL-220A	Laboratorium	Badań ImpulsówDzielnik częstotliwości TTL (f/2, f/4, f/8, f/16), do generowania 20MHz z wyjścia laserowego.
Pręty szklane o wysokiej dyspersji	Union Optic	CYLROD01	Soczewka prętowa H-ZF52A o wysokiej dyspersji 120 mm, soczewka prętowa SF11 100 mm
Insight DS+	Newport		System laserowy zdolny do wysyłania dwóch zsynchronizowanych laserów impulsowych (jeden o stałej wiązce o długości fali 1,040 nm i jedna przestrajalna wiązka w zakresie 680-1,300 nm) z częstotliwością powtarzania 80 MHz.
Wzmacniacz typu lock-in	Liquid Instruments	Moku Lab	Wzmacniacz typu lock-in do ekstrakcji sygnału SRS z fotodiody. Można również użyć instrumentu Zurich HF2LI lub podobnego instrumentu.
Lustra	THORLABS	BB05-E03-10	Szerokopasmowe zwierciadło dielektryczne, 750 - 1 100 nm. Można również użyć srebrnych luster.
Zmotoryzowany stopień opóźniający	Zaber	X-DMQ12P-DE52	Stopień opóźniający do precyzyjnej kontroli czasowego nakładania się pompy i laserów Stokesa. Każdy inny zmotoryzowany etap powinien działać.
Kondensator zanurzeniowy olejowy	Nikon	CSC1003	1.4 NA. Można stosować inne skraplacze z NA>1.2.
Oscyloskop	Tektronix	TDS7054	Każdy inny oscyloskop o paśmie 400 MHz lub wyższym powinien działać.
Przesuwnik fazowy	SigaTek	SF50A2	Do przesuwania fazy częstotliwości modulacji
Fotodioda	Hamamatsu Corp	S3994-01	Krzemowa dioda PIN o dużej powierzchni (10 x 10 cm2). Można stosować inne diody o dużej powierzchni i niskiej pojemności.
Rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej	Union Optic	PBS9025-620-1000	Szerokopasmowy rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej
Baza danych			refractiveindex.info
Odbłyśnik	Edmund Optics	34-408	BBAR Pryzmat kątowy. Można zastosować inne pryzmaty lub retroreflektor.
Miniukłady	wzmacniacza mocy RF	ZHL-1-2W+	Blok wzmocnienia, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Lustra skanujące	Cambridge Technologies	6215H	Użyliśmy zestawu luster 5 mm z powłoką srebrną
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	Oprogramowanie sterujące laserowym mikroskopem skaningowym
Filtr krótkoprzepustowy	THORLABS	FESH1000	25,0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Długość fali: 1,000 nm. Do skutecznego tłumienia Stokesa mogą być konieczne dwa filtry.
Mikroskop pionowy	Nikon	Eclipse FN1	Można użyć dowolnej innej ramy mikroskopu. Jeśli dostępny jest laserowy mikroskop skaningowy, można go używać bezpośrednio. W przeciwnym razie do mikroskopu trzeba było dodać skaner galvo i soczewkę skanującą.
Obiektyw do zanurzenia w wodzie	Olympus	XLPLN25XWMP2	Wielofotonowy obiektyw 25X ma NA 1,05. Można zastosować inne podobne cele.