小鼠右冠状动脉永久结扎诱导的右心室性心肌梗死的生成与表征

摘要

右心室和左心室之间有几个区别。然而，右心室梗死（RVI）的病理生理学尚未明确。在本方案中，引入了一种用于生成RVI小鼠模型的可重复方法，该方法可以提供解释RVI机制的方法。

摘要

右心室梗死 （RVI） 是临床实践中的常见表现。重度 RVI 可导致致命的血流动力学功能障碍和心律失常。与广泛使用的左冠状动脉结扎生成的小鼠心肌梗死（MI）模型相比，由于与模型生成相关的困难，RVI小鼠模型很少使用。关于RVI诱导的RV重塑和功能障碍的机制和治疗的研究需要动物模型来模拟患者RVI的病理生理学。本研究介绍了在C57BL / 6J小鼠中生成RVI模型的可行程序。此外，该模型的特征基于以下内容:心肌梗死后24小时的梗死大小评估，超声心动图的心脏重塑和功能评估，左心室血流动力学评估以及RVI后4周梗死区的组织学。此外，还进行了冠状动脉系统管型，以观察RV中的冠状动脉排列。这种RVI小鼠模型将有助于右心衰竭机制的研究，并寻求RV重塑的新治疗靶点。

引言

长期以来，右心室 （RV） 被认为是连接到肺动脉的简单管子，多年来一直被错误地忽视¹。然而，最近人们对RV功能的兴趣日益浓厚，因为它在血液动力学障碍^2，3 中起着至关重要的作用，并且可以作为心血管疾病的独立风险预测因子^{4，5，6，7}。房车疾病包括心房梗死 （RVI）、肺动脉高压和瓣膜病⁸。与对肺动脉高压的巨大兴趣相反，RVI^{仍然被忽视7，9}。

RVI，通常伴有下后心肌梗死^10，11，由右冠状动脉 （RCA） 闭塞引起。根据临床调查，重度 RVI 可能诱发血流动力学紊乱和心律失常，例如低血压、心动过缓和房室传导阻滞，与较高的住院发病率和死亡率相关^12，13，14。RV功能即使在没有再灌注的情况下也能在一定程度上自发恢复^15，16。左心室（LV）和RV¹⁷之间存在几种形态和功能差异。RV被认为比LV⁸对缺血的抵抗力更强，部分原因是RVI后形成更广泛的侧支循环。澄清左心室梗死（LVI）和RVI之间的差异并确定其潜在机制将为心脏再生和缺血性心力衰竭提供新的治疗靶点。然而，由于与RVI小鼠模型生成相关的困难，对RVI的基础研究主要有限。

通过在猪¹⁸中结扎RCA来生成RVI的大型动物模型，由于可见的RCA，该模型更易于操作。与大型动物模型相比，小鼠模型具有以下优点:基因操作的可及性更高，经济成本更低，实验周期更短^19，20。虽然之前报道了以RVI对左心室功能的影响为重点的小鼠RVI模型，但未充分介绍手术的详细步骤、操作的难点和关键点，以及血流动力学变化等模型特征^9，21。

本文提供了生成RVI小鼠模型的详细外科手术程序。此外，该模型通过超声心动图测量，侵入性血流动力学评估和组织学分析进行表征。此外，进行冠状动脉系统管型检查以观察RV中的冠状动脉排列。本文介绍的技术有助于初学者快速掌握小鼠RVI模型的生成，具有可接受的操作死亡率和可靠的评估方法。RVI小鼠模型有助于研究右心衰竭的机制，寻找新的RV重塑治疗靶点。

研究方案

所有程序均按照美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》（NIH出版物第85-23号，1996年修订）进行，并经南方医科大学南方医院动物伦理委员会（中国广州）批准。从南方医科大学动物中心获得健康的雄性C57BL / 6J小鼠（8-10周龄;体重，25-30g）。也可以使用雌性小鼠，但由于性别差异的潜在影响，不建议混合两种性别。到达后，将小鼠置于12小时/ 12小时黑暗/光照循环（每个笼子3-4只小鼠）下，随意食物和水。

1. 手术准备

1. 手术前通过高压灭菌对手术器械进行灭菌。将加热垫调节至37°C。
2. 通过腹腔注射50mg / kg戊巴比妥麻醉小鼠（见 材料表）以缓解手术疼痛。将小鼠放在单独的盒子中进行麻醉诱导。通过没有脚趾退缩反应来确保麻醉的深度。
   注意:还建议使用1.5%异氟醚进行吸入麻醉，因为它更适合镇痛。
3. 将小鼠仰卧在垫子上，方法是用缝合线固定门牙，并用胶带固定四肢。通过检查反射再次确保麻醉深度。
4. 用脱毛膏从脖子到xiphoid去除毛发。用交替使用抗菌擦洗剂和75%酒精对手术区域进行3次消毒，然后覆盖手术区域。
5. 按照以下步骤进行插管。
   1. 用迷你呼吸机（见 材料表）将动物的呼吸频率调整为150 / min，潮气量调节至300μL。
      注意:没有必要使用呼气末正压模式。
   2. 用镊子稍微拉出舌头，用压舌板抬起下颌骨以暴露声门，并通过将22 G套管插入声门进行气管插管。
   3. 打开迷你呼吸机，将气管套管连接到呼吸机。胸腔起伏等于呼吸机频率的现象表明插管成功。用胶带固定套管，以防止在操作过程中打滑。

2.右冠状动脉永久结扎

1. 将心电图（ECG）电极（见 材料表）正确连接到小鼠肢体并记录ECG。
   注:选择II、III或AVF导联中的一种作为监测导联;铅III更合适。
2. 打开宝箱。
   1. 用眼科剪刀在皮肤上做一个1厘米长的切口，平行于第三根右肋骨。再次确定第三肋间，并根据胸骨角度确保足够的空间。
      注意:皮肤切口的方向是从胸骨角到右前腋窝线。
   2. 在第三肋间隙上方用剪刀和微镊子分离并切割胸大肌和胸小肌。之后，用肘部镊子钝地分离肋间肌肉，以暴露手术场。
      注意:只需要切除一小部分胸肌，然后建议钝分离以暴露心脏。
   3. 切开心包。用无菌棉抬起右心房，用无菌8-0连接RCA尼龙螺纹，连接范围为3-5 mm。锁住RCA后，监测心电图（导联III）显示ST段抬高。
      注意:由于鼠标RCA是不可见的，因此必须仔细确认其解剖位置。房车的心肌比左心室的心肌薄得多。因此，很难掌握插入针的深度。如果插入的针头的深度太深，结扎范围太大，很容易诱发窦性心动过缓和房室传导阻滞。
3. 去除无菌棉，用无菌5-0尼龙线缝合肌肉和皮肤，以关闭肋间切口。手术后再次用75%酒精消毒皮肤，并对小鼠进行单室消毒。
   注意:缝合良好的肌肉对于避免气胸很重要。将无菌引流管放置在胸腔中，直到胸部闭合完成，然后通过连接引流管的注射注射器抽吸胸腔。
   注意:手术后，将小鼠放在加热垫上。需要使用丁丙诺啡（0.1mg / kg体重，皮下注射）等镇痛药来减轻动物术后疼痛。预期的并发症是窦性心动过缓和房室传导阻滞，术后死亡率为10-20%。

3. 术后左心室功能超声心动图评估

注:对于超声心动图，请使用中心频率为30 MHz的MS400D探头，连接到高分辨率超声成像系统（参见 材料表）。超声心动图检查在手术后4周进行。

1. 通过吸入用3%异氟醚麻醉小鼠。
2. 将小鼠置于超声平台上的仰卧位，以进行动物固定和超声操作。将其爪子贴在电极上，通过连接到超声波机器的系统获得ECG记录。
3. 通过心电图监测心率，并通过在1.5%至3%之间调节麻醉浓度，将其维持在450-550次/分钟之间。
4. 用脱毛膏从小鼠胸部取下毛发，并将超声波凝胶涂抹在胸部皮肤上。
5. 将平台设置为水平位置。将换能器平行于左腿定向，并获得左心室长轴图像。顺时针旋转探头90°以获得LV短轴视图。按 电影商店 按钮保存图像。
   注:平台的左上角在最低点倾斜。当传感器朝向鼠标右肩时，传感器保持LV短轴旋转角度。
6. 垂直向下移动探头，在 B模式下保持其上腹部和鼠标隔膜下方的位置。通过旋转其 x 轴和 y 轴来稍微调整平台位置，直到在屏幕上清楚地看到 RV、右心房 （RA）、左心房 （LA） 和 LV。通过按 电影商店 或 相框 商店按钮保存顶端四室图像。
   注意:B 模式用于显示心脏的二维 （2D） 视图。
7. 按 M模式;2x指示线出现后，将指示线定位在三尖瓣孔口处，以获得三尖瓣环面的运动。按 电影商店 或 相框商店 按钮以保存数据和图像。
   注意:M模式是指运动模式，它以曲线形式显示心脏或血管的运动。
8. 按 测量 按钮进入测量模式。单击 "面积测量 "按钮可划分为 RV 和 LV。计算 RV 和 LV 的面积，得到 RV 与 LV 的面积比。
   1. 单击时间 轴 按钮并制作两个基线，以定义收缩期和舒张期三尖瓣环平面的运动范围。单击" 距离 "按钮并测量两个基线之间的距离，以获得三尖瓣环平面收缩期偏移 （TAPSE）。
9. 在最低点倾斜平台的左侧。使探头沿右前腋窝线与水平轴成 30° 角。旋转平台的 x 轴和 y 轴以显示 RV。
   1. 按下 M模式 按钮，将指示线定位在隔膜的高回声点，以获得RV接口的M模式图像。按 电影商店 按钮保存图片。
10. 打开RV界面的M模式图像，按 测量 按钮进入测量模式。使用超声心动图系统的内置测量工具测量舒张末期的房车内距 （RVIDd）、右心室射血分数 （RVEF） 和心房分数缩短 （RVFS）。
11. 停止给予异氟醚，并将小鼠放在加热垫上3-5分钟，直到它恢复意识。之后，将小鼠放回笼子，进行12小时的光/暗循环。

4. 房车血流动力学的侵入性测量

注意:在 RVI 后 4 周通过右心导管插入术评估房车血流动力学。应用1.0 F导管和监测系统。

1. 用腹腔注射50mg / kg戊巴比妥钠麻醉小鼠（见 材料表）。
2. 确认踏板退出反射消失后，将鼠标保持在仰卧位并用胶带固定。
3. 将胸毛从胸骨角剃除到胸廓。用75%的酒精对操作区域进行消毒。
4. 执行气管插管并设置动物呼吸机的参数，如步骤1.5.2-1.5.3中所述。
5. 在剑突上方的皮肤上做一个1厘米的双侧切口，并用眼科剪刀横切隔膜和肋骨以暴露心脏。
6. 用 32 G 针头刺穿右心室游离壁。取出针头，用棉花按压伤口以固定出血。
7. 将导管的尖端通过穿刺部位插入右心室，然后缓慢向前推导管。调整尖端的位置，以获得监视器和记录系统上显示的典型RV压力波形。
   注意:右颈静脉也是血流动力学测量的合适途径。
8. 稳定10分钟后，记录房车收缩压（RVSBP），房车舒张末压（RVEDP）和RV dP / dt的数据。单击 "选择" 按钮以选择要计算的心脏周期，然后单击" 分析 "按钮以计算所选周期的平均值。
9. 记录完成后取出导管，然后将其置于生理盐水溶液中。
10. 用腹腔注射过量的戊巴比妥钠（150mg / kg）对小鼠实施安乐死，然后通过宫颈脱位处死。
11. 收集心脏和胫骨进行组织学分析。

5. 使用血管石膏固定剂的冠状动脉血管石膏

1. 用腹腔注射200 IU / mL肝素钠以2000 IU / kg对小鼠进行肝素化（见 材料表）。
2. 用腹腔注射50mg / kg戊巴比妥钠麻醉小鼠。
3. 按照步骤1.5.2-1.5.3将动物仰卧并插管以进行人工通气。
4. 按照步骤4.5所述，用手术剪刀打开胸部并露出心脏。
5. 在右心房用眼科剪刀做一个3毫米的缺口，并用注射器通过心脏顶点向心脏灌注5 mL生理盐水。
6. 用主动脉夹阻断主动脉的血液，并用注射器通过心尖灌注0.1mL硝酸甘油（1mg / mL）以扩张冠状动脉。
7. 根据制造商的说明，通过将试剂盒中的成分混合来制备投射试剂（参见 材料表）。
   注意:建议同时用生理盐水和硝酸甘油制备铸试剂和灌注，以防止微血管闭合。
8. 用1mL投射试剂通过心脏顶点灌注心脏，等待2-3小时。
9. 用50%氢氧化钠侵蚀心脏2-3天，并通过用生理盐水冲洗去除肌肉组织或结缔组织。
10. 在相机下拍照。
    注意:投射试剂对眼睛、皮肤和呼吸道有害。氢氧化钠具有腐蚀性。需要戴防护手套，护目镜和实验室外套。投射试剂必须在通风橱中制备。

结果

在这项研究中，小鼠被随机分配到RVI（n = 11）或假手术（n = 11）组。图 1A所示为2个正常小鼠心脏的冠状动脉石膏。作为对RCA结扎的反应，心电图的3号导联观察到ST段抬高（图1B）。此外，2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色显示，术后24 h梗死面积占房车游离壁的45%（图1C，D）。以上数据表明RVI小鼠模型的成功生成。...

讨论

来自法国的Sicard及其同事于2019年首次报道了RVI的小鼠模型，该模型描述了手术过程，并专注于RVI⁹后LV和RV之间的相互作用。然而，迄今为止，还没有研究报告使用这种模型进行进一步的研究。更详细的程序将有助于研究人员使用RVI的小鼠模型进行调查。与Sicard等人⁹的报告相比，我们提供了模型生成和质量控制策略的分步信息，并进一步评估了RCA的解剖分布，RV?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Sigma	T8877	For TTC staining
Animal Mini Ventilator	Havard	Type 845	For artificial ventilation
Animal ultrasound system VEVO2100	Visual Sonic	VEVO2100	Measurement for Doppler flow velocity and AS plaque
Batson’s #17 Anatomical Corrosion Kit	Polyscience Inc	7349	For vasculature casting
buprenorphine	Isoreag	1134630-70-8	For reduce the pain of mice after surgery
C57BL/6J mice + D29A1A2:D27	Animal Center of South Medical University	-	For the generation of mouse RVI model
Camera	Sangnond		For taking photograph
Cold light illuminator	Olympus	ILD-2	Light for operation
electrocardiograph	ADI Instrument	ADAS1000	For recording electrocardiogram
hair removal cream	Reckitt Benchiser	RQ/B 33 Type 2	Remove mouse hair
Heat pad- thermostatic surgical system (ALC-HTP-S1)	SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO	ALC-HTP-S1	Heating
Hematoxylin-eosin dye	Leagene	DH0003	Hematoxylin-eosin staining
Heparin sodium salt	Macklin	H837056	For heparization
Isoflurane	RWD life science	R510-22	Inhalant anaesthesia
Lab made spatula			Work as a laryngoscope
Lab made tracheal cannula			For intubation
Matrx VIP 3000 Isofurane Vaporizer	Midmark Corporation	VIP 3000	Anesthetization
Medical nylon suture (5-0)	Ningbo Medical Needle Co.	5-0	For chest close
Microsurgical elbow tweezers	RWD life science	F11021-11	For surgery
Microsurgical scissors	NAPOX	MB-54-1	For arteriotomy
Millar Catheter	AD Instruments, Shanghai	1.0F	Measurement of pressure gradient
MS400D ultrasonic probe	Visual Sonic	MS400D	Measurement for Doppler flow velocity and AS plaque
needle forceps	Visual Sonic	F31006-12	For surgery
nitroglycerin	BEIJING YIMIN MEDICINE Co		For dilating coronary artery
Ophthalmic scissors	RWD life science	S11022-14	For surgery
Pentobarbital sodium salt	Merck	25MG	Anesthetization
PowerLab Multi-Directional Physiological Recording System	AD Instruments, Shanghai	4/35	Pressure recording
Precision electronic balance	Denver Instrument	TB-114	Weighing scale
Silk suture (8-0)	Ningbo Medical Needle Co.	6-0	coronary artery ligation
Small animal microsurgery equipment	Napox	MA-65	Surgical instruments
tissue forceps	Visual Sonic	F-12007-10	For surgery
tissue scissor	Visual Sonic	S13052-12	Open chest for hemodynamic measurement
Transmission Gel	Guang Gong pai	250ML	preparation for Echocardiography measurement
Vascular Clamps	Visual Sonic	R31005-06	For blocking blood from aorta