Generación y caracterización del infarto de miocardio del ventrículo derecho inducido por ligadura permanente de la arteria coronaria derecha en ratones

Resumen

Hay varias diferencias entre los ventrículos derecho e izquierdo. Sin embargo, no se ha aclarado la fisiopatología del infarto del ventrículo derecho (RVI). En el presente protocolo, se introduce un método reproducible para la generación de modelos de ratón RVI, que puede proporcionar un medio para explicar el mecanismo de RVI.

Resumen

El infarto del ventrículo derecho (RVI) es una presentación común en la práctica clínica. La RVI grave puede provocar disfunción hemodinámica fatal y arritmia. En contraste con el modelo de infarto de miocardio (IM) de ratón ampliamente utilizado generado por la ligadura de la arteria coronaria izquierda, el modelo de ratón RVI rara vez se emplea debido a la dificultad asociada con la generación del modelo. La investigación sobre los mecanismos y el tratamiento de la remodelación y disfunción del RV inducido por RVI requiere modelos animales para imitar la fisiopatología de RVI en pacientes. Este estudio introduce un procedimiento factible para la generación de modelos RVI en ratones C57BL/6J. Además, este modelo se caracterizó en base a lo siguiente: evaluación del tamaño del infarto a las 24 h después del IM, evaluación de la remodelación cardíaca y la función con ecocardiografía, evaluación de la hemodinámica del RV e histología de la zona del infarto a las 4 semanas después de la RVI. Además, se realizó un yeso de vasculatura coronaria para observar la disposición arterial coronaria en RV. Este modelo de ratón de RVI facilitaría la investigación sobre los mecanismos de la insuficiencia cardíaca derecha y buscaría nuevas dianas terapéuticas de remodelación de RV.

Introducción

El ventrículo derecho (RV), que durante mucho tiempo se pensó que era un tubo simple conectado a la arteria pulmonar, se ha descuidado injustamente durante muchos años¹. Sin embargo, ha habido un creciente interés en la función de RV recientemente, ya que desempeña un papel esencial en los trastornos hemodinámicos ^2,3 y puede servir como un predictor de riesgo independiente de enfermedad cardiovascular ^4,5,6,7. Las enfermedades de RV incluyen infarto de RV (RVI), hipertensión arterial pulmonar y enfermedad valvular⁸. En contraste con el inmenso interés en la hipertensión arterial pulmonar, la RVI ha permanecido descuidada ^7,9.

La RVI, generalmente acompañada de infarto de miocardio inferior-posterior^10,11, es causada por la oclusión de la arteria coronaria derecha (RCA). Según las investigaciones clínicas, la RVI grave probablemente induce alteraciones hemodinámicas y arritmias, como hipotensión, bradicardia y bloqueo auriculoventricular, asociadas con una mayor morbilidad y mortalidad hospitalaria 12,13,14. La función RV podría recuperarse espontáneamente hasta cierto punto incluso en ausencia de reperfusión^15,16. Existen varias diferencias morfológicas y funcionales entre el ventrículo izquierdo (VI) y el RV¹⁷. Se cree que rv es más resistente a la isquemia que LV⁸, en parte debido a la formación de circulación colateral más extensa después de RVI. Aclarar las diferencias entre el infarto del VI (LVI) y el RVI e identificar los mecanismos subyacentes proporcionaría nuevas dianas terapéuticas para la regeneración cardíaca y la insuficiencia cardíaca isquémica. Sin embargo, debido a la dificultad asociada con la generación de modelos de ratón RVI, la investigación básica sobre RVI es principalmente limitada.

Se ha generado un modelo animal grande de RVI mediante la ligadura de RCA en^{cerdos 18}, que es más fácil de operar debido a la RCA visible. En comparación con el modelo animal grande, el modelo de ratón tiene las siguientes ventajas: más accesibilidad en la manipulación de genes, menor costo económico y menor período experimental^19,20. Aunque anteriormente se informó de un modelo RVI de ratón centrado en la influencia de RVI en la función del VI, los pasos detallados del procedimiento, las dificultades y puntos clave de operación, y las características del modelo, como los cambios hemodinámicos, no se introdujeron completamente ^9,21.

Este artículo proporciona procedimientos quirúrgicos detallados para generar un modelo de ratón de RVI. Además, este modelo se caracterizó por la medición ecocardiográfica, la evaluación hemodinámica invasiva y el análisis histológico. Además, se realizó un yeso de vasculatura coronaria para observar la disposición arterial coronaria en RV. La técnica introducida en este artículo ayudaría a los principiantes a comprender rápidamente la generación del modelo RVI del ratón con una mortalidad operativa aceptable y enfoques de evaluación confiables. El modelo de ratón de RVI ayudaría a investigar los mecanismos de la insuficiencia cardíaca derecha y buscar nuevos objetivos terapéuticos de remodelación de RV.

Protocolo

Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (Publicación NIH No. 85-23, revisada en 1996) y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Hospital Nanfang, Universidad Médica del Sur (Guangzhou, China). Los ratones machos sanos C57BL / 6J (8-10 semanas de edad; peso corporal, 25-30 g) se obtuvieron del Centro de Animales de la Universidad Médica del Sur. También se pueden usar ratones hembra, pero no se recomienda mezclar ambos sexos debido a las posibles influencias de las diferencias sexuales. Después de su llegada, los ratones fueron alojados bajo un ciclo oscuro / claro de 12 h / 12 h (3-4 ratones por jaula), con comida y agua ad libitum.

1. Preparación para la cirugía

1. Esterilizar los instrumentos quirúrgicos mediante autoclave antes de la cirugía. Ajuste la almohadilla térmica a 37 °C.
2. Anestesiar a los ratones mediante una inyección intraperitoneal de 50 mg/kg de pentobarbital (ver Tabla de Materiales) para aliviar el dolor quirúrgico. Coloque los ratones en cajas separadas para la inducción de la anestesia. Asegurar la profundidad de la anestesia por la ausencia de una respuesta de retirada del dedo del pie.
   NOTA: También se recomienda usar isoflurano al 1,5% para la anestesia por inhalación porque es mejor para la analgesia.
3. Coloque los ratones supinos en la almohadilla fijando sus incisivos con una sutura e inmovilizando sus extremidades con cinta adhesiva. Asegure la profundidad de la anestesia nuevamente verificando el reflejo.
4. Retire el vello del cuello a xifoide con una crema depilatoria. Desinfecte el área quirúrgica 3 veces con exfoliante antiséptico alterno y alcohol al 75% y luego cubra el campo quirúrgico.
5. Realice la intubación siguiendo los pasos a continuación.
   1. Ajuste la frecuencia respiratoria del animal con un mini ventilador (ver Tabla de Materiales) a 150/min y el volumen corriente a 300 μL.
      NOTA: No es necesario utilizar el modo de presión positiva al final de la espiración.
   2. Extraiga la lengua ligeramente con pinzas, levante la mandíbula con un depresor de la lengua para exponer la glotis y realice la intubación intratraqueal insertando una cánula de 22 G en la glotis.
   3. Encienda el mini ventilador y conecte la cánula traqueal al ventilador. El fenómeno de la ondulación torácica que se vuelve igual a la frecuencia del ventilador indica una intubación exitosa. Fije la cánula con cinta adhesiva para evitar que se resbale durante la operación.

2. Ligadura permanente de la arteria coronaria derecha

1. Conecte los electrodos de electrocardiografía (ECG) (consulte la Tabla de materiales) a las extremidades del ratón correctamente y registre el ECG.
   NOTA: Uno de los cables II, III o AVF se selecciona como cable de monitoreo; El plomo III es más apropiado.
2. Abra el cofre.
   1. Haga una incisión de 1 cm de largo en la piel paralela a la tercera costilla derecha con tijeras oftálmicas. Determine el tercer intercostal nuevamente y asegure el espacio adecuado de acuerdo con el ángulo del esternón.
      NOTA: La dirección de la incisión en la piel se realiza desde el ángulo del esternón hasta la línea axilar anterior derecha.
   2. Separe y corte los músculos pectoral mayor y pectoral menor con tijeras y micro pinzas por encima del tercer espacio intercostal. Después de eso, separe sin rodeos el músculo intercostal con pinzas de codo para exponer el campo quirúrgico.
      NOTA: Solo se necesita cortar una pequeña parte de los músculos pectorales, y luego se recomienda una separación roma para exponer el corazón.
   3. Incise el pericardio. Levantar la aurícula derecha con algodón estéril y ligar el RCA con un 8-0 estéril hilo de nylon con un rango de ligadura de 3-5 mm. Después de ligar el RCA, el ECG de monitoreo (plomo III) muestra la elevación del segmento ST.
      NOTA: Debido a que el RCA del ratón es invisible, su ubicación anatómica debe confirmarse cuidadosamente. El miocardio del RV es mucho más delgado que el del LV. Por lo tanto, es difícil comprender la profundidad de la aguja insertada. Es fácil inducir bradicardia sinusal y bloqueo auriculoventricular si la profundidad de la aguja insertada es demasiado profunda y el rango de ligadura es demasiado grande.
3. Retire el algodón estéril y suture los músculos y la piel con un hilo de nylon estéril 5-0 para cerrar la incisión intercostal. Desinfecte la piel nuevamente con alcohol al 75% y use el ratón después de la cirugía.
   NOTA: El músculo bien suturado es importante para evitar el aerotórax. Se coloca un tubo de drenaje estéril en la cavidad torácica hasta la finalización del cierre del tórax, y luego la cavidad torácica se evacua con una jeringa de inyección que conecta el tubo de drenaje.
   NOTA: Después de la cirugía, los ratones se colocan en una almohadilla térmica. Se requieren analgésicos como la buprenorfina (0,1 mg/kg de peso corporal, inyección subcutánea) para reducir el dolor de los animales después de la cirugía. Las complicaciones esperadas son bradicardia sinusal y bloqueo auriculoventricular, y la tasa de mortalidad después de la cirugía es del 10-20%.

3. Evaluación ecocardiográfica de la función RV después de la cirugía

NOTA: Para la ecocardiografía, utilice una sonda MS400D con una frecuencia central de 30 MHz, conectada a un sistema de imágenes de ultrasonido de alta resolución (consulte la Tabla de materiales). El examen de ecocardiografía se realiza 4 semanas después de la cirugía.

1. Anestesiar al ratón con 3% de isoflurano por inhalación.
2. Coloque el ratón en posición supina en una plataforma ultrasónica para la fijación animal y el funcionamiento ultrasónico. Pegue sus garras al electrodo para obtener una grabación de ECG a través de un sistema conectado a la máquina ultrasónica.
3. Monitorizar la frecuencia cardíaca a través del ECG y mantenerla entre 450-550 latidos/min ajustando la concentración anestésica entre el 1,5% y el 3%.
4. Retire el vello del pecho del ratón con una crema depilatoria y aplique gel de ultrasonido en la piel del pecho.
5. Ajuste la plataforma a la posición horizontal. Oriente el transductor paralelo a la pierna izquierda y obtenga la imagen del eje largo del ventrículo izquierdo. Gire la sonda 90° en el sentido de las agujas del reloj para obtener la vista de eje corto LV. Pulsa el botón Cine store para guardar las imágenes.
   NOTA: La parte superior izquierda de la plataforma está inclinada en el punto más bajo. El ángulo de rotación de eje corto LV del transductor se mantiene mientras que el transductor está orientado hacia el hombro derecho del ratón.
6. Desplácese hacia abajo por el transductor verticalmente, manteniendo su posición sobre la parte superior del abdomen y por debajo del diafragma del ratón en modo B. Ajuste ligeramente la posición de la plataforma girando sus ejes X e Y hasta que el RV, la aurícula derecha (RA), la aurícula izquierda (LA) y el LV se vean claramente en la pantalla. Guarde imágenes apicales de cuatro cámaras presionando el botón Tienda Cine o Tienda Marco .
   NOTA: El modo B se utiliza para mostrar la vista de dos dimensiones (2D) del corazón.
7. Presione M-mode; después de que aparezca la línea indicadora 2x, ubique la línea indicadora en el orificio de la válvula tricúspide para obtener el movimiento del plano anular tricúspide. Presione el botón Tienda Cine o Almacén de marcos para guardar datos e imágenes.
   NOTA: M-mode significa modo de movimiento, que revela el movimiento del corazón o vaso en forma de curva.
8. Pulse el botón Medir para entrar en el modo de medición. Haga clic en el botón Medición de área para zonificar en RV y LV. Calcule el área de RV y LV para obtener la relación de área de RV a LV.
   1. Haga clic en el botón Línea de tiempo y haga dos líneas de base para definir el rango de movimiento del plano anular tricúspide durante los períodos sistólico y diastólico. Haga clic en el botón Distancia y mida la distancia entre dos líneas de base para obtener la excursión sistólica del plano anular tricúspide (TAPSE).
9. Incline el lado izquierdo de la plataforma en el punto más bajo. Mantenga la sonda en un ángulo de 30° con respecto al eje horizontal a lo largo de la línea axilar anterior derecha. Gire los ejes X e Y de la plataforma para mostrar el RV.
   1. Presione el botón M-mode y localice la línea indicadora en el punto hiperecoico del tabique para obtener la imagen M-mode de la interfaz RV. Presione el botón Tienda Cine para guardar la imagen.
10. Abra la imagen en modo M de la interfaz RV, presione el botón Medir para ingresar al modo de medición. Mida la distancia interna de RV al final de la diástole (RVIDd), la fracción de eyección de RV (RVEF) y el acortamiento de fracción de RV (RVFS) utilizando la herramienta de medición incorporada del sistema ecocardiográfico.
11. Deje de administrar isoflurano y coloque el ratón sobre la almohadilla térmica durante 3-5 minutos hasta que recupere la conciencia. Después de eso, devuelva el ratón a su jaula con un ciclo de luz / oscuridad de 12 h.

4. Mediciones invasivas de la hemodinámica de RV

NOTA: La hemodinámica de RV se evalúa a través de cateterismo cardíaco derecho 4 semanas después de RVI. Se aplica un catéter 1.0 F junto con un sistema de monitoreo.

1. Anestesiar al ratón con una inyección intraperitoneal de 50 mg/kg de pentobarbital sódico (ver Tabla de Materiales).
2. Después de confirmar la desaparición del reflejo de retirada del pedal, mantenga el ratón en posición supina e inmovilícelo con cinta adhesiva.
3. Afeitar el vello del pecho desde el ángulo esternal hasta la xifoidea. Desinfectar el área de operación con alcohol al 75%.
4. Realice la intubación traqueal y establezca el parámetro del ventilador animal como se describe en los pasos 1.5.2-1.5.3.
5. Haga una incisión bilateral de 1 cm en la piel por encima del proceso xifoide y transecte el diafragma y la costilla con tijeras oftálmicas para exponer el corazón.
6. Punción de la pared libre del ventrículo derecho con una aguja de 32 G. Retire la aguja y presione la herida con algodón para detener el sangrado.
7. Inserte la punta del catéter en el ventrículo derecho a través del sitio de la punción y empuje el catéter hacia adelante lentamente. Ajuste la posición de la punta para obtener una forma de onda de presión de RV típica que se muestra en un monitor y sistema de grabación.
   NOTA: La vena yugular derecha también es una ruta apropiada para la medición hemodinámica.
8. Después de 10 min de estabilización, registre los datos de la presión arterial sistólica de RV (RVSBP), la presión diastólica final de RV (RVEDP) y RV dP / dt. Haga clic en el botón Seleccionar para seleccionar ciclos cardíacos para el cálculo y luego haga clic en el botón Analizar para calcular los valores medios de los ciclos seleccionados.
9. Retire el catéter después de completar la grabación y luego colóquelo dentro de la solución salina normal.
10. Eutanasiar al ratón con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico por sobredosis (150 mg/kg) y luego sacrificarlo por luxación cervical.
11. Recoger el corazón y la tibia para el análisis histológico.

5. Yeso vascular coronario con un agente de fundición vascular

1. Heparinizar el ratón con una inyección intraperitoneal de 200 UI/ml de heparina sódica a 2000 UI/kg (ver Tabla de Materiales).
2. Anestesiar al ratón con una inyección intraperitoneal de 50 mg/kg de pentobarbital sódico.
3. Coloque el animal en decúbito supino sobre la almohadilla e intuba para ventilación artificial siguiendo los pasos 1.5.2-1.5.3.
4. Abra el tórax con tijeras quirúrgicas como se describe en el paso 4.5 y exponga el corazón.
5. Haga una muesca de 3 mm con tijeras oftálmicas en las aurículas derechas y perfunda el corazón con 5 ml de solución salina normal a través del ápice cardíaco con un inyector.
6. Bloquee la sangre de la aorta con una pinza aórtica y perfunda 0,1 ml de nitroglicerina (1 mg / ml) a través del ápice cardíaco con un inyector para dilatar la arteria coronaria.
7. Prepare el reactivo fundido mezclando los ingredientes en el kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: Se recomienda preparar el reactivo y la perfusión con solución salina normal y nitroglicerina simultáneamente para evitar el cierre microvascular.
8. Perfunda el corazón con 1 ml de reactivo de yeso a través del ápice cardíaco y espere 2-3 h.
9. Erosionar el corazón con hidróxido de sodio al 50% durante 2-3 días y eliminar el tejido muscular o el tejido conectivo enjuagando con solución salina normal.
10. Toma fotos debajo de una cámara.
    PRECAUCIÓN: El reactivo de yeso es perjudicial para los ojos, la piel y las vías respiratorias. El hidróxido de sodio es corrosivo. Se requiere el uso de guantes protectores, gafas y una bata de laboratorio. El reactivo de fundición debe prepararse en una campana extractora de humos.

Resultados

En este estudio, los ratones fueron asignados al azar al grupo RVI (n = 11) o operación simulada (n = 11). El yeso coronario en 2 corazones de ratón normales se muestra en la Figura 1A. En respuesta a la ligadura RCA, se observó elevación del segmento ST en la derivación III del ECG (Figura 1B). Además, la tinción de cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio (TTC) mostró que el área de infarto representa el 45% de la pared libre de RV a las 24 h postoperator...

Discusión

Sicard y sus colegas de Francia informaron por primera vez un modelo de ratón de RVI en 2019, que describió el proceso quirúrgico y se centró en la interacción entre LV y RV después de RVI⁹. Sin embargo, hasta la fecha, ningún estudio ha informado el uso de este modelo para estudios adicionales. Un procedimiento más detallado sería útil para que los investigadores utilicen el modelo de ratón de RVI para la investigación. A diferencia del informe de Sicard et ^al.9

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Sigma	T8877	For TTC staining
Animal Mini Ventilator	Havard	Type 845	For artificial ventilation
Animal ultrasound system VEVO2100	Visual Sonic	VEVO2100	Measurement for Doppler flow velocity and AS plaque
Batson’s #17 Anatomical Corrosion Kit	Polyscience Inc	7349	For vasculature casting
buprenorphine	Isoreag	1134630-70-8	For reduce the pain of mice after surgery
C57BL/6J mice + D29A1A2:D27	Animal Center of South Medical University	-	For the generation of mouse RVI model
Camera	Sangnond		For taking photograph
Cold light illuminator	Olympus	ILD-2	Light for operation
electrocardiograph	ADI Instrument	ADAS1000	For recording electrocardiogram
hair removal cream	Reckitt Benchiser	RQ/B 33 Type 2	Remove mouse hair
Heat pad- thermostatic surgical system (ALC-HTP-S1)	SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO	ALC-HTP-S1	Heating
Hematoxylin-eosin dye	Leagene	DH0003	Hematoxylin-eosin staining
Heparin sodium salt	Macklin	H837056	For heparization
Isoflurane	RWD life science	R510-22	Inhalant anaesthesia
Lab made spatula			Work as a laryngoscope
Lab made tracheal cannula			For intubation
Matrx VIP 3000 Isofurane Vaporizer	Midmark Corporation	VIP 3000	Anesthetization
Medical nylon suture (5-0)	Ningbo Medical Needle Co.	5-0	For chest close
Microsurgical elbow tweezers	RWD life science	F11021-11	For surgery
Microsurgical scissors	NAPOX	MB-54-1	For arteriotomy
Millar Catheter	AD Instruments, Shanghai	1.0F	Measurement of pressure gradient
MS400D ultrasonic probe	Visual Sonic	MS400D	Measurement for Doppler flow velocity and AS plaque
needle forceps	Visual Sonic	F31006-12	For surgery
nitroglycerin	BEIJING YIMIN MEDICINE Co		For dilating coronary artery
Ophthalmic scissors	RWD life science	S11022-14	For surgery
Pentobarbital sodium salt	Merck	25MG	Anesthetization
PowerLab Multi-Directional Physiological Recording System	AD Instruments, Shanghai	4/35	Pressure recording
Precision electronic balance	Denver Instrument	TB-114	Weighing scale
Silk suture (8-0)	Ningbo Medical Needle Co.	6-0	coronary artery ligation
Small animal microsurgery equipment	Napox	MA-65	Surgical instruments
tissue forceps	Visual Sonic	F-12007-10	For surgery
tissue scissor	Visual Sonic	S13052-12	Open chest for hemodynamic measurement
Transmission Gel	Guang Gong pai	250ML	preparation for Echocardiography measurement
Vascular Clamps	Visual Sonic	R31005-06	For blocking blood from aorta