Farelerde Sağ Koroner Arterin Kalıcı Ligasyonu ile İndüklenen Sağ Ventrikül Miyokard İnfarktüsünün Oluşumu ve Karakterizasyonu

Özet

Sağ ve sol ventriküller arasında birkaç fark vardır. Ancak sağ ventrikül enfarktüsünün (RVI) patofizyolojisi aydınlatılamamıştır. Mevcut protokolde, RVI fare modeli üretimi için RVI'nın mekanizmasını açıklamak için bir araç sağlayabilecek tekrarlanabilir bir yöntem tanıtılmıştır.

Özet

Sağ ventrikül enfarktüsü (RVI) klinik pratikte sık görülen bir prezentasyondur. Şiddetli RVI ölümcül hemodinamik disfonksiyon ve aritmilere yol açabilir. Sol koroner arter ligasyonu tarafından üretilen yaygın olarak kullanılan fare miyokard enfarktüsü (MI) modelinin aksine, RVI fare modeli, model oluşturma ile ilişkili zorluk nedeniyle nadiren kullanılmaktadır. RVI kaynaklı RV yeniden şekillenmesi ve disfonksiyonunun mekanizmaları ve tedavisi üzerine yapılan araştırmalar, hayvan modellerinin hastalarda RVI patofizyolojisini taklit etmesini gerektirmektedir. Bu çalışma, C57BL / 6J farelerde RVI modeli üretimi için uygulanabilir bir prosedür sunmaktadır. Ayrıca, bu model aşağıdakilere dayanarak karakterize edildi: MI'den 24 saat sonra enfarktüs boyutu değerlendirmesi, ekokardiyografi ile kardiyak yeniden şekillenme ve fonksiyonun değerlendirilmesi, RV hemodinamik değerlendirmesi ve RVI'dan 4 hafta sonra enfarktüs bölgesinin histolojisi. Ek olarak, RV'de koroner arteriyel düzenlemeyi gözlemlemek için koroner vaskülatür alçısı yapıldı. RVI'nın bu fare modeli, sağ kalp yetmezliğinin mekanizmaları üzerine araştırmayı kolaylaştıracak ve RV yeniden şekillenmesinin yeni terapötik hedeflerini arayacaktır.

Giriş

Uzun zamandır pulmoner artere bağlı basit bir tüp olduğu düşünülen sağ ventrikül (RV), uzun yıllardır yanlış bir şekilde ihmal edilmiştir¹. Bununla birlikte, hemodinamik bozukluklarda önemli bir rol oynadığı^için son zamanlarda RV fonksiyonuna artan bir ilgi olmuştur ^2,3 ve kardiyovasküler hastalığın bağımsız bir risk belirleyicisi olarak hizmet edebilir 4,5,6,7. RV hastalıkları arasında RV enfarktüsü (RVI), pulmoner arter hipertansiyonu ve kapak hastalığı^{8 bulunur}. Pulmoner arter hipertansiyonuna olan yoğun ilginin aksine, RVI^ihmal edilmiş ^7,9 kalmıştır.

Genellikle inferior-posterior miyokard enfarktüsü^10,11 eşlik eden RVI, sağ koroner arter (RCA) tıkanıklığından kaynaklanır. Klinik araştırmalara göre, şiddetli RVI muhtemelen daha yüksek hastane morbiditesi ve mortalitesi ile ilişkili hipotansiyon, bradikardi ve atriyoventriküler blok gibi hemodinamik bozukluklara ve aritmilere neden olur^12,13,14. RV fonksiyonu, reperfüzyon^15,16 yokluğunda bile bir dereceye kadar kendiliğinden iyileşebilir. Sol ventrikül (AG) ve RV¹⁷ arasında çeşitli morfolojik ve fonksiyonel farklılıklar vardır. RV'nin, kısmen RVI'dan sonra daha geniş kollateral dolaşım oluşumu nedeniyle, iskemiye LV^8'den daha dirençli olduğuna inanılmaktadır. LV enfarktüsü (LVI) ve RVI arasındaki farkların açıklığa kavuşturulması ve altta yatan mekanizmaların belirlenmesi, kardiyak rejenerasyon ve iskemik kalp yetmezliği için yeni terapötik hedefler sağlayacaktır. Bununla birlikte, RVI fare modeli üretimi ile ilişkili zorluk nedeniyle, RVI ile ilgili temel araştırmalar esas olarak sınırlıdır.

RVI'nın büyük bir hayvan modeli, RCA'nın domuz^18'de bağlanmasıyla üretilmiştir, bu da görünür RCA nedeniyle kullanımı daha kolaydır. Büyük hayvan modeliyle karşılaştırıldığında, fare modeli aşağıdaki avantajlara sahiptir: gen manipülasyonunda daha fazla erişilebilirlik, daha düşük ekonomik maliyet ve daha kısa deney süresi^19,20. RVI'nın AG fonksiyonu üzerindeki etkisine odaklanan bir fare RVI modeli daha önce bildirilmiş olmasına rağmen, prosedürün ayrıntılı adımları, çalışmanın zorlukları ve kilit noktaları ve hemodinamik değişiklikler gibi model özellikleri tam olarak tanıtılmamıştır ^9,21.

Bu makalede, RVI'nın fare modelini oluşturmak için ayrıntılı cerrahi prosedürler sağlanmaktadır. Ayrıca bu model ekokardiyografik ölçüm, invaziv hemodinamik değerlendirme ve histolojik analiz ile karakterize edildi. Ayrıca RV'de koroner arteriyel düzenlemeyi gözlemlemek için koroner vaskülatür alçı yapıldı. Bu makalede tanıtılan teknik, yeni başlayanların kabul edilebilir operasyon mortalitesi ve güvenilir değerlendirme yaklaşımları ile fare RVI modelinin neslini hızlı bir şekilde kavramalarına yardımcı olacaktır. RVI'nın fare modeli, sağ kalp yetmezliğinin mekanizmalarını araştırmaya ve RV yeniden modellemesinin yeni terapötik hedeflerini aramaya yardımcı olacaktır.

Protokol

Tüm prosedürler, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na (NIH Yayın No. 85-23, 1996'da revize edilmiştir) göre gerçekleştirilmiş ve Nanfang Hastanesi, Güney Tıp Üniversitesi (Guangzhou, Çin) Hayvan Etiği Komitesi tarafından onaylanmıştır. Sağlıklı erkek C57BL / 6J fareler (8-10 haftalık; vücut ağırlığı, 25-30 g) Güney Tıp Üniversitesi Hayvan Merkezi'nden elde edildi. Dişi fareler de kullanılabilir, ancak cinsiyet farklılıklarının potansiyel etkileri nedeniyle her iki cinsiyetin de karıştırılması önerilmez. Varıştan sonra, fareler ad libitum yiyecek ve su ile 12 saat / 12 saat karanlık / ışık döngüsü (kafes başına 3-4 fare) altında barındırıldı.

1. Ameliyata hazırlık

1. Ameliyattan önce otoklavlama yaparak cerrahi aletleri sterilize edin. Isıtma yastığını 37 °C'ye ayarlayın.
2. Cerrahi ağrıyı hafifletmek için fareleri 50 mg / kg pentobarbital intraperitoneal enjeksiyonla anestezi altına alın (bakınız Malzeme Tablosu). Anestezi indüksiyonu için fareleri ayrı kutulara yerleştirin. Ayak parmağı çekilme yanıtının yokluğunda anestezi derinliğini sağlayın.
   NOT: Ayrıca inhalasyon anestezisi için% 1.5 izofluran kullanılması önerilir, çünkü analjezi için daha iyidir.
3. Fareleri, kesici dişlerini bir dikişle sabitleyerek ve uzuvlarını yapışkan bantla hareketsiz hale getirerek sırtüstü yatağa yerleştirin. Refleksi kontrol ederek anestezi derinliğini tekrar sağlayın.
4. Tüyleri tüy dökücü bir kremle boyundan ksifoide çıkarın. Cerrahi bölgeyi alternatif antiseptik ovma ve% 75 alkol ile 3 kez dezenfekte edin ve ardından cerrahi alanı örtün.
5. Aşağıdaki adımları izleyerek entübasyon yapın.
   1. Mini vantilatör ile hayvanın solunum frekansını ( Malzeme Tablosuna bakınız) 150/dk'ya ve gelgit hacmini 300 μL'ye ayarlayın.
      NOT: Pozitif ekspiratuar basınç modunun kullanılması gereksizdir.
   2. Dili cımbızla hafifçe çekin, glottis'i açığa çıkarmak için mandibulayı bir dil depresörüyle kaldırın ve glottisin içine 22 G'lik bir kanül yerleştirerek trakea içi entübasyon yapın.
   3. Mini ventilatörü açın ve trakea kanülünü ventilatöre bağlayın. Torasik dalgalanmanın ventilatör frekansına eşit hale gelmesi entübasyonun başarılı olduğunu gösterir. Operasyon sırasında kaymayı önlemek için kanülü bantla sabitleyin.

2. Sağ koroner arterin kalıcı ligasyonu

1. Elektrokardiyografi (EKG) elektrotlarını (bkz. Malzeme Tablosu) fare uzuvlarına doğru şekilde bağlayın ve EKG'yi kaydedin.
   NOT: II, III veya AVF uçlarından biri izleme kablosu olarak seçilir; Kurşun III daha uygundur.
2. Göğsü açın.
   1. Oftalmik makasla üçüncü sağ kaburgaya paralel olarak deride 1 cm uzunluğunda bir kesi yapın. Üçüncü interkostalı tekrar belirleyin ve sternum açısına göre yeterli alan sağlayın.
      NOT: Cilt insizyonunun yönü sternum açısından sağ ön aksiller çizgiye doğru yapılır.
   2. Pektoralis majör ve pektoralis minör kaslarını üçüncü interkostal boşluğun üzerinde makas ve mikro forseps ile ayırın ve kesin. Bundan sonra, cerrahi alanı ortaya çıkarmak için interkostal kası dirsek forseps ile açıkça ayırın.
      NOT: Göğüs kaslarının sadece küçük bir kısmının kesilmesi gerekir ve daha sonra kalbi açığa çıkarmak için künt bir ayrım önerilir.
   3. Perikardın kesilmesi. Sağ atriyumu steril pamukla kaldırın ve RCA'yı steril bir 8-0 ile yaslandırın 3-5 mm ligasyon aralığına sahip naylon iplik. RCA'yı bağladıktan sonra, izleme EKG'si (kurşun III) ST-segment yüksekliğini gösterir.
      NOT: Fare RCA'sı görünmez olduğundan, anatomik konumu dikkatlice doğrulanmalıdır. RV'nin miyokard, LV'ninkinden çok daha incedir. Bu nedenle, yerleştirilen iğnenin derinliğini kavramak zordur. Yerleştirilen iğnenin derinliği çok derinse ve ligasyon aralığı çok büyükse, sinüs bradikardisini ve atriyoventriküler bloğu indüklemek kolaydır.
3. İnterkostal insizyonu kapatmak için steril pamuk ve dikiş kaslarını ve cildi steril 5-0 naylon iplikle çıkarın. Cildi %75 alkol ile tekrar dezenfekte edin ve ameliyattan sonra fareyi tek haneye yerleştirin.
   NOT: İyi dikilmiş kas, aerotorakstan kaçınmak için önemlidir. Göğüs kapanmasının tamamlanmasına kadar göğüs boşluğuna steril bir drenaj tüpü yerleştirilir ve daha sonra göğüs boşluğu, drenaj tüpünü bağlayan bir enjeksiyon şırıngası ile boşaltılır.
   NOT: Ameliyattan sonra, fareler bir ısıtma yastığına yerleştirilir. Ameliyattan sonra hayvanların ağrısını azaltmak için buprenorfin (0.1 mg / kg vücut ağırlığı, deri altı enjeksiyonu) gibi analjezikler gereklidir. Beklenen komplikasyonlar sinüs bradikardisi ve atriyoventriküler bloktur ve ameliyat sonrası mortalite oranı %10-20'dir.

3. Ameliyat sonrası RV fonksiyonunun ekokardiyografik değerlendirmesi

NOT: Ekokardiyografi için, yüksek çözünürlüklü ultrason görüntüleme sistemine bağlı, merkez frekansı 30 MHz olan bir MS400D probu kullanın (bkz. Ekokardiyografi incelemesi ameliyattan 4 hafta sonra yapılır.

1. Fareyi inhalasyon yoluyla % 3 izofluran ile uyuşturun.
2. Hayvan fiksasyonu ve ultrasonik çalışma için fareyi ultrasonik bir platformda sırtüstü konuma getirin. Ultrasonik makineye bağlı bir sistem aracılığıyla EKG kaydı elde etmek için pençelerini elektroda bantlayın.
3. EKG yoluyla kalp atış hızını izleyin ve anestezik konsantrasyonu% 1.5 ila% 3 arasında ayarlayarak 450-550 atım / dak arasında tutun.
4. Saçları farenin göğsünden tüy dökücü bir kremle çıkarın ve ultrason jelini göğsün cildine uygulayın.
5. Platformu yatay konuma ayarlayın. Transdüseri sol bacağa paralel olarak yönlendirin ve sol ventrikül uzun eksenli görüntüsünü elde edin. AG kısa eksenli görünümünü elde etmek için probu saat yönünde 90° döndürün. Görüntüleri kaydetmek için Cine store düğmesine basın.
   NOT: Platformun sol üst kısmı en alçak noktaya eğilir. Transdüserin AG kısa eksenli dönüş açısı korunurken, dönüştürücü farenin sağ omzuna doğru yönlendirilir.
6. Dönüştürücüyü dikey olarak aşağı doğru hareket ettirin, üst karın üzerindeki konumunu ve B modu altında farenin diyaframının altındaki konumunu koruyun. RV, sağ atriyum (RA), sol atriyum (LA) ve LV ekranda açıkça görülene kadar x ve y eksenlerini döndürerek platform konumunu hafifçe ayarlayın. Cine store veya Frame store düğmesine basarak apikal dört odacıklı görüntüleri kaydedin.
   NOT: B modu, kalbin iki boyutlu (2B) görünümünü göstermek için kullanılır.
7. M moduna basın; 2x gösterge çizgisi göründükten sonra, triküspid dairesel düzlemin hareketini elde etmek için triküspid valf deliğindeki gösterge çizgisini bulun. Verileri ve görüntüleri kaydetmek için Cine deposu veya Çerçeve deposu düğmesine basın.
   NOT: M-modu, kalbin veya damarın hareketini eğri şeklinde ortaya çıkaran hareket modu anlamına gelir.
8. Ölçüm moduna girmek için Ölçü düğmesine basın. RV ve LV'ye bölge oluşturmak için Alan ölçüm düğmesine tıklayın. RV ve AG'nin alan oranını elde etmek için RV ve LV alanını hesaplayın.
   1. Zaman Çizelgesi düğmesine tıklayın ve sistolik ve diyastolik dönemlerde triküspid dairesel düzlemin hareket aralığını tanımlamak için iki taban çizgisi yapın. Mesafe düğmesine tıklayın ve triküspid dairesel düzlem sistolik gezisi (TAPSE) elde etmek için iki taban çizgisi arasındaki mesafeyi ölçün.
9. Platformun sol tarafını en alçak noktaya eğin. Probu, sağ ön aksiller çizgi boyunca yatay eksene 30° açıyla tutun. RV'yi görüntülemek için platformun x ve y eksenlerini döndürün.
   1. M modu düğmesine basın ve RV arayüzünün M-mode görüntüsünü elde etmek için septumun hiperekoik noktasındaki gösterge çizgisini bulun. Resmi kaydetmek için Cine store düğmesine basın.
10. RV arayüzünün M modu görüntüsünü açın, ölçüm moduna girmek için Ölçüm düğmesine basın. Ekokardiyografik sistemin dahili ölçüm aracını kullanarak diyastol (RVIDd), RV ejeksiyon fraksiyonu (RVEF) ve RV fraksiyonu kısalma (RVFS) ucundaki RV iç mesafesini ölçün.
11. İzofluran uygulamasını bırakın ve bilincini geri kazanana kadar fareyi 3-5 dakika boyunca ısıtma yastığının üzerine yerleştirin. Bundan sonra, fareyi 12 saat açık / karanlık döngüsüyle kafesine geri getirin.

4. RV hemodinamiğinin invaziv ölçümleri

NOT: RV hemodinamiği, RVI'dan 4 hafta sonra sağ kalp kateterizasyonu ile değerlendirilir. İzleme sistemi ile birlikte 1.0 F kateter uygulanır.

1. Fareyi 50 mg / kg sodyum pentobarbital intraperitoneal enjeksiyonla anestezi altına alın (bkz.
2. Pedal çekilme refleksinin kaybolduğunu doğruladıktan sonra, fareyi sırtüstü pozisyonda tutun ve yapışkan bantla hareketsiz hale getirin.
3. Göğüs kıllarını sternal açıdan ksifoide tıraş edin. Çalışma alanını% 75 alkol ile dezenfekte edin.
4. Trakeal entübasyon yapın ve hayvan ventilatörünün parametresini adım 1.5.2-1.5.3'te açıklandığı gibi ayarlayın.
5. Ksifoid işlemin üzerindeki cilt üzerinde 1 cm'lik iki taraflı bir kesi yapın ve kalbi açığa çıkarmak için diyaframı ve kaburgayı oftalmik makasla transekte edin.
6. Sağ ventrikülsüz duvarı 32 G iğne ile delin. İğneyi çıkarın ve kanamayı durdurmak için yarayı pamukla bastırın.
7. Kateterin ucunu ponksiyon bölgesinden sağ ventriküle yerleştirin ve kateteri yavaşça ileri doğru itin. Bir monitörde ve kayıt sisteminde gösterilen tipik bir RV basıncı dalga formu elde etmek için ucun konumunu ayarlayın.
   NOT: Sağ juguler ven de hemodinamik ölçüm için uygun bir yoldur.
8. 10 dakikalık stabilizasyondan sonra, RV sistolik kan basıncı (RVSBP), RV diyastolik sonu basıncı (RVEDP) ve RV dP / dt verilerini kaydedin. Hesaplama için kardiyak siklusları seçmek için Seç düğmesine tıklayın ve ardından seçilen döngülerin ortalama değerlerini hesaplamak için Analiz Et düğmesine tıklayın.
9. Kaydın tamamlanmasından sonra kateteri çıkarın ve ardından normal tuzlu su çözeltisinin içine yerleştirin.
10. Fareyi aşırı dozda pentobarbital sodyum (150 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyonu ile ötenazi yapın ve daha sonra servikal çıkık ile feda edin.
11. Histolojik analiz için kalbi ve tibiayı toplayın.

5. Vasküler döküm ajanı kullanılarak koroner vasküler alçı

1. Fareyi, 2000 IU / kg'da 200 IU / mL heparin sodyum intraperitoneal enjeksiyonu ile heparinize edin (bkz.
2. Fareyi 50 mg / kg sodyum pentobarbital intraperitoneal enjeksiyonla uyuşturun.
3. Hayvanı sırtüstü yastığı ped üzerine yerleştirin ve 1.5.2-1.5.3 adımlarını izleyerek yapay havalandırma için entübe edin.
4. Göğsü adım 4.5'te açıklandığı gibi cerrahi makasla açın ve kalbi açığa çıkarın.
5. Sağ atriyumda oftalmik makasla 3 mm'lik bir çentik yapın ve kalbi bir enjektör ile kardiyak tepe noktasından 5 mL normal salin ile perfüze edin.
6. Aorttan gelen kanı bir aort kelepçesi ile bloke edin ve koroner arteri genişletmek için bir enjektör ile kardiyak tepe noktasından 0.1 mL nitrogliserin (1 mg / mL) perfüze edin.
7. Kitteki malzemeleri üreticinin talimatlarına göre karıştırarak dökme reaktifi hazırlayın (bkz.
   NOT: Mikrovasküler kapanmayı önlemek için dökme reaktifin ve perfüzyonun normal salin ve nitrogliserin ile aynı anda hazırlanması önerilir.
8. Kalbi kardiyak tepe noktasından 1 mL dökme reaktif ile perfüze edin ve 2-3 saat bekleyin.
9. Kalbi 2-3 gün boyunca% 50 sodyum hidroksit ile aşındırın ve normal salin ile durulayarak kas dokusunu veya bağ dokusunu çıkarın.
10. Bir kameranın altında fotoğraf çekin.
    DİKKAT: Dökme reaktif gözlere, cilde ve solunum yollarına zararlıdır. Sodyum hidroksit aşındırıcıdır. Koruyucu eldiven, gözlük ve laboratuvar önlüğü giymek gerekir. Dökme reaktif bir duman davlumbazında hazırlanmalıdır.

Sonuçlar

Bu çalışmada, fareler rastgele RVI (n = 11) veya sahte operasyon (n = 11) grubuna atandı. 2 normal fare kalbindeki koroner döküm Şekil 1A'da gösterilmiştir. RCA ligasyonuna yanıt olarak EKG'nin kurşun III'ünde ST-segment yükselmesi görüldü (Şekil 1B). Ayrıca, 2,3,5-triphenil tetrazolyum klorür (TTC) boyaması, enfarktüs alanının postoperatif 24 saatte RV serbest duvarının %45'ini oluşturduğunu göstermiştir (Şekil...

Tartışmalar

Fransa'dan Sicard ve meslektaşları ilk olarak 2019'da cerrahi süreci tanımlayan ve RVI 9'dan sonra LV ile RV arasındaki etkileşime odaklanan bir fare^{RVI modelini} bildirdiler. Bununla birlikte, bugüne kadar, daha ileri çalışmalar için bu modeli kullanan hiçbir çalışma bildirilmemiştir. Daha ayrıntılı bir prosedür, araştırmacıların araştırma için RVI'nın fare modelini kullanmaları için yararlı olacaktır. Sicard ve ^ark.9'un raporunun aksine, mod...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Sigma	T8877	For TTC staining
Animal Mini Ventilator	Havard	Type 845	For artificial ventilation
Animal ultrasound system VEVO2100	Visual Sonic	VEVO2100	Measurement for Doppler flow velocity and AS plaque
Batson’s #17 Anatomical Corrosion Kit	Polyscience Inc	7349	For vasculature casting
buprenorphine	Isoreag	1134630-70-8	For reduce the pain of mice after surgery
C57BL/6J mice + D29A1A2:D27	Animal Center of South Medical University	-	For the generation of mouse RVI model
Camera	Sangnond		For taking photograph
Cold light illuminator	Olympus	ILD-2	Light for operation
electrocardiograph	ADI Instrument	ADAS1000	For recording electrocardiogram
hair removal cream	Reckitt Benchiser	RQ/B 33 Type 2	Remove mouse hair
Heat pad- thermostatic surgical system (ALC-HTP-S1)	SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO	ALC-HTP-S1	Heating
Hematoxylin-eosin dye	Leagene	DH0003	Hematoxylin-eosin staining
Heparin sodium salt	Macklin	H837056	For heparization
Isoflurane	RWD life science	R510-22	Inhalant anaesthesia
Lab made spatula			Work as a laryngoscope
Lab made tracheal cannula			For intubation
Matrx VIP 3000 Isofurane Vaporizer	Midmark Corporation	VIP 3000	Anesthetization
Medical nylon suture (5-0)	Ningbo Medical Needle Co.	5-0	For chest close
Microsurgical elbow tweezers	RWD life science	F11021-11	For surgery
Microsurgical scissors	NAPOX	MB-54-1	For arteriotomy
Millar Catheter	AD Instruments, Shanghai	1.0F	Measurement of pressure gradient
MS400D ultrasonic probe	Visual Sonic	MS400D	Measurement for Doppler flow velocity and AS plaque
needle forceps	Visual Sonic	F31006-12	For surgery
nitroglycerin	BEIJING YIMIN MEDICINE Co		For dilating coronary artery
Ophthalmic scissors	RWD life science	S11022-14	For surgery
Pentobarbital sodium salt	Merck	25MG	Anesthetization
PowerLab Multi-Directional Physiological Recording System	AD Instruments, Shanghai	4/35	Pressure recording
Precision electronic balance	Denver Instrument	TB-114	Weighing scale
Silk suture (8-0)	Ningbo Medical Needle Co.	6-0	coronary artery ligation
Small animal microsurgery equipment	Napox	MA-65	Surgical instruments
tissue forceps	Visual Sonic	F-12007-10	For surgery
tissue scissor	Visual Sonic	S13052-12	Open chest for hemodynamic measurement
Transmission Gel	Guang Gong pai	250ML	preparation for Echocardiography measurement
Vascular Clamps	Visual Sonic	R31005-06	For blocking blood from aorta