Geração e Caracterização do Infarto do Miocárdio Ventricular Direito Induzido pela Ligação Permanente da Artéria Coronária Direita em Camundongos

Resumo

Há várias diferenças entre os ventrículos direito e esquerdo. No entanto, a fisiopatologia do infarto ventricular direito (RVI) não foi esclarecida. No presente protocolo, é introduzido um método reprodutível para geração de modelos de mouse RVI, o que pode fornecer um meio de explicar o mecanismo do RVI.

Resumo

O infarto ventricular direito (RVI) é uma apresentação comum na prática clínica. RVI grave pode levar a disfunção hemodinâmica fatal e arritmia. Em contraste com o modelo de infarto do miocárdio (MI) extensivamente utilizado gerado pela ligadura da artéria coronária esquerda, o modelo de mouse RVI raramente é empregado devido à dificuldade associada à geração do modelo. Pesquisas sobre os mecanismos e tratamento da remodelação e disfunção de RV induzidas pelo RVI exigem modelos animais para imitar a fisiopatologia do RVI em pacientes. Este estudo introduz um procedimento viável para a geração de modelos RVI em camundongos C57BL/6J. Além disso, este modelo foi caracterizado com base no seguinte: avaliação do tamanho do infarto em 24 h após MI, avaliação de remodelagem cardíaca e função com ecocardiografia, avaliação hemodinâmica de RV e histologia da zona de infarto às 4 semanas após o RVI. Além disso, foi realizado um molde de vasculatura coronária para observar o arranjo arterial coronária na RV. Este modelo de mouse de RVI facilitaria a pesquisa sobre mecanismos de insuficiência cardíaca direita e buscaria novos alvos terapêuticos de remodelação de RV.

Introdução

O ventrículo direito (RV), considerado por muito tempo um tubo simples ligado à artéria pulmonar, foi negligenciado injustamente por muitos anos¹. No entanto, tem havido um interesse crescente pela função RV recentemente, uma vez que desempenha um papel essencial nos distúrbios hemodinâmicos ^2,3 e pode servir como um preditor de risco independente de doenças cardiovasculares ^4,5,6,7. As doenças da RV incluem infarto de RV (RVI), hipertensão arterial pulmonar e doença valvular⁸. Em contraste com o imenso interesse pela hipertensão arterial pulmonar, o RVI permaneceu negligenciado ^7,9.

RVI, geralmente acompanhado de infarto do miocárdio inferior-posterior^10,11, é causado pela oclusão da artéria coronária direita (RCA). De acordo com investigações clínicas, o RVI grave provavelmente induz distúrbios hemodinâmicos e arritmias, como hipotensão, bradicardia e bloqueio atrioventricular, associados à maior morbidade hospitalar e mortalidade 12,13,14. A função RV poderia se recuperar espontaneamente até certo ponto, mesmo na ausência de reperfusão ^15,16. Existem várias diferenças morfológicas e funcionais entre o ventrículo esquerdo (LV) e o RV¹⁷. Acredita-se que o RV seja mais resistente à isquemia do que a LV⁸, em parte devido à formação mais extensa de circulação colateral após o RVI. Esclarecer as diferenças entre o infarto de LV (LVI) e o RVI e identificar os mecanismos subjacentes forneceria novos alvos terapêuticos para a regeneração cardíaca e insuficiência cardíaca isquêmica. No entanto, devido à dificuldade associada à geração de modelos de mouse RVI, a pesquisa básica sobre RVI é limitada principalmente.

Um grande modelo animal de RVI tem sido gerado ligando RCA no suíno¹⁸, que é mais fácil de operar por causa da RCA visível. Em comparação com o modelo animal de grande porte, o modelo do mouse tem as seguintes vantagens: mais acessibilidade na manipulação genética, menor custo econômico e menor período experimental^19,20. Embora um modelo de RVI do mouse com foco na influência do RVI na função LV tenha sido relatado anteriormente, as etapas detalhadas do procedimento, as dificuldades e os principais pontos de operação e as características do modelo, como alterações hemodinâmicas, não foram totalmente^{introduzidas 9,21}.

Este artigo fornece procedimentos cirúrgicos detalhados para a geração de um modelo de camundongos de RVI. Além disso, este modelo foi caracterizado por medição ecocardiográfica, avaliação hemodinâmica invasiva e análise histológica. Além disso, foi realizado um molde de vasculatura coronária para observar o arranjo arterial coronária na caravana. A técnica introduzida neste artigo ajudaria os iniciantes a compreender rapidamente a geração do modelo RVI do mouse com mortalidade de operação aceitável e abordagens de avaliação confiáveis. O modelo de mouse de RVI ajudaria a pesquisar os mecanismos de insuficiência cardíaca direita e buscar novos alvos terapêuticos de remodelação de RV.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (Publicação NIH nº 85-23, revisado em 1996) e aprovado pelo Comitê de Ética Animal do Hospital Nanfang, Southern Medical University (Guangzhou, China). Camundongos C57BL/6J masculinos saudáveis (8-10 semanas de idade; peso corporal, 25-30 g) foram obtidos do Centro Animal da Universidade Médica do Sul. Camundongos fêmeas também podem ser usados, mas misturar ambos os sexos não é recomendado devido às potenciais influências das diferenças sexuais. Após a chegada, os ratos foram alojados sob um ciclo escuro/claro de 12 h/12 h (3-4 ratos por gaiola), com comida e água ad libitum.

1. Preparação para cirurgia

1. Esterilizar instrumentos cirúrgicos autoclavando antes da cirurgia. Ajuste a almofada de aquecimento para 37 °C.
2. Anestesiar os camundongos por uma injeção intraperitoneal de 50 mg/kg de pentobarbital (ver Tabela de Materiais) para aliviar a dor cirúrgica. Coloque os ratos em caixas separadas para indução de anestesia. Certifique-se da profundidade da anestesia pela ausência de uma resposta de retirada dos dedos.
   NOTA: Também é recomendado o uso de isoflurano de 1,5% para anestesia de inalação, pois é melhor para analgesia.
3. Coloque os ratos supinos na almofada fixando seus incisivos com uma sutura e imobilizando seus membros com fita adesiva. Certifique-se novamente da profundidade da anestesia verificando o reflexo.
4. Remova o cabelo do pescoço para xiphoid com um creme depilatório. Desinfete a área cirúrgica 3 vezes com esfoliação antisséptica alternada e 75% de álcool e, em seguida, drape o campo cirúrgico.
5. Realizar entubação seguindo os passos abaixo.
   1. Ajuste a frequência respiratória do animal com um mini ventilador (ver Tabela de Materiais) para 150/min e o volume da maré para 300 μL.
      NOTA: É desnecessário usar o modo de pressão final-expiratória positiva.
   2. Puxe a língua ligeiramente com pinças, levante a mandíbula com um depressor de língua para expor o glottis, e realize a intubação intra-traqueal inserindo uma cânula de 22 G no glottis.
   3. Ligue o mini ventilador e conecte a cânula traqueal ao ventilador. O fenômeno da ondulação torácica torácica se tornando igual à frequência do ventilador indica intubação bem sucedida. Corrija a cânula com fita adesiva para evitar escorregar durante a operação.

2. Ligadura permanente da artéria coronária direita

1. Conecte os eletrocardiografia (ECG) (ver Tabela de Materiais) aos membros do mouse corretamente e registo o ECG.
   NOTA: Um dos líderes II, III ou AVF é selecionado como um lead de monitoramento; Chumbo III é mais apropriado.
2. Abra o peito.
   1. Faça uma incisão de 1 cm de comprimento na pele paralela à terceira costela direita com uma tesoura oftálmica. Determine o terceiro intercostal novamente e garanta espaço adequado de acordo com o ângulo do esterno.
      NOTA: A direção da incisão da pele é feita do ângulo do esterno para a linha axilar anterior direita.
   2. Separe e corte os músculos peitoral e peitoral com tesoura e micro fórceps acima do terceiro espaço intercostal. Depois disso, separe sem rodeios o músculo intercostal com fórceps do cotovelo para expor o campo cirúrgico.
      NOTA: Apenas uma pequena parte dos músculos peitorais precisa ser cortada, e então uma separação contundente é recomendada para expor o coração.
   3. Inciso o pericárdio. Levante o átrio direito com algodão estéril e ligate a RCA com um 8-0 estéril linha de nylon com uma faixa de ligadura de 3-5 mm. Após a ligadura do RCA, o ECG de monitoramento (chumbo III) mostra elevação do segmento ST.
      NOTA: Como o RCA do mouse é invisível, sua localização anatômica deve ser cuidadosamente confirmada. O miocárdio do trailer é muito mais fino que o da LV. Portanto, é difícil entender a profundidade da agulha inserida. É fácil induzir bradicardia sinusa e bloqueio atrioventricular se a profundidade da agulha inserida for muito profunda e a faixa de ligadura é muito grande.
3. Remova os músculos estéreis de algodão e sutura e a pele com um fio de nylon estéril 5-0 para fechar a incisão intercostal. Desinfete a pele novamente com 75% de álcool e abriga o rato após a cirurgia.
   NOTA: O músculo bem suturado é importante para evitar o aerotórax. Um tubo de drenagem estéril é colocado na cavidade torácica até a conclusão do fechamento do peito, e então a cavidade torácica é evacuada por uma seringa de injeção que liga o tubo de drenagem.
   NOTA: Após a cirurgia, os ratos são colocados em uma almofada de aquecimento. Analgésicos como buprenorfina (0,1 mg/kg de peso corporal, injeção subcutânea) são necessários para reduzir a dor dos animais após a cirurgia. As complicações esperadas são bradicardia sinusa e bloco atrioventricular, e a taxa de mortalidade pós-cirurgia é de 10 a 20%.

3. Avaliação ecocardiográfica da função RV após cirurgia

NOTA: Para a ecocardiografia, use uma sonda MS400D com uma frequência central de 30 MHz, conectada a um sistema de imagem de ultrassom de alta resolução (ver Tabela de Materiais). O exame de ecocardiografia é realizado 4 semanas após a cirurgia.

1. Anestesiar o rato com 3% de isoflurane por inalação.
2. Coloque o mouse na posição supina em uma plataforma ultrassônica para fixação animal e operação ultrassônica. Tape suas garras no eletrodo para obter uma gravação de ECG através de um sistema conectado à máquina ultrassônica.
3. Monitore a frequência cardíaca através do ECG e mantenha-a entre 450-550 batidas/min, ajustando a concentração anestésico entre 1,5% e 3%.
4. Retire o cabelo do peito do rato com um creme depilatório e aplique gel de ultrassom na pele do peito.
5. Coloque a plataforma na posição horizontal. Oriente o transdutor paralelo à perna esquerda e obtenha a imagem ventricular de longo eixo esquerdo. Gire a sonda 90° no sentido horário para obter a visão do eixo curto LV. Pressione o botão da loja Cine para salvar as imagens.
   NOTA: A parte superior esquerda da plataforma está inclinada no ponto mais baixo. O ângulo de rotação do eixo curto LV do transdutor é mantido enquanto o transdutor é orientado para o ombro direito do mouse.
6. Mova-se para baixo do transdutor verticalmente, mantendo sua posição sobre o abdômen superior e abaixo do diafragma do mouse sob o modo B. Ajuste ligeiramente a posição da plataforma girando seus eixos x e y até que o RV, o átrio direito (RA), o átrio esquerdo (LA) e o LV sejam claramente vistos na tela. Salve imagens apical de quatro câmaras pressionando a loja Cine ou o botão da loja Frame .
   NOTA: O modo B é usado para mostrar a visão de duas dimensões (2D) do coração.
7. Pressione o modo M; após a linha indicadora 2x aparecer, localize a linha indicadora no orifício da válvula tricúspide para obter o movimento do plano anular tricúspide. Pressione a loja Cine ou o botão frame store para salvar dados e imagens.
   NOTA: Modo M significa modo de movimento, que revela o movimento do coração ou do vaso em uma forma de curva.
8. Pressione o botão Medir para entrar no modo de medição. Clique no botão de medição da área para a região em RV e LV. Calcule a área de RV e LV para obter a razão de área de RV para LV.
   1. Clique no botão Linha do Tempo e faça duas linhas de base para definir a faixa de movimento do plano anular tricúsplica durante os períodos sistólico e diastólico. Clique no botão Distância e meça a distância entre duas linhas de base para obter excursão sistólica do plano anular tricúsplica (TAPSE).
9. Incline o lado esquerdo da plataforma no ponto mais baixo. Mantenha a sonda em um ângulo de 30° para o eixo horizontal ao longo da linha axilar anterior direita. Gire os eixos x e y da plataforma para exibir o RV.
   1. Pressione o botão do modo M e localize a linha indicadora no ponto hiperérico do septo para obter a imagem do modo M da interface RV. Pressione o botão da loja Cine para salvar a imagem.
10. Abra a imagem do modo M da interface RV, pressione o botão Medir para entrar no modo de medição. Meça a distância interna do RV no final da diastole (RVIDd), fração de ejeção de RV (RVEF) e encurtamento de fração RV (RVFS) utilizando a ferramenta de medição embutida do sistema ecocardiográfico.
11. Pare de administrar isoflurane e coloque o rato na almofada de aquecimento por 3-5 minutos até que ele recupere a consciência. Depois disso, devolva o mouse à sua gaiola com 12 h de ciclo claro/escuro.

4. Medições invasivas do RV hemodinâmica

NOTA: A hemodinâmica do RV é avaliada através do cateterismo cardíaco direito 4 semanas após o RVI. Um cateter 1.0 F juntamente com um sistema de monitoramento é aplicado.

1. Anestesiar o camundongo com uma injeção intraperitoneal de 50 mg/kg de pentobarbital de sódio (ver Tabela de Materiais).
2. Após confirmar o desaparecimento do reflexo de retirada do pedal, mantenha o rato na posição supina e imobilize-o com fita adesiva.
3. Raspe o cabelo do peito do ângulo severo para o xiphoide. Desinfetar a área de operação com 75% de álcool.
4. Realizar intubação traqueal e definir o parâmetro do ventilador animal conforme descrito nas etapas 1.5.2-1.5.3.
5. Faça uma incisão bilateral de 1 cm na pele acima do processo xifoide e transecte o diafragma e a costela com uma tesoura oftálmica para expor o coração.
6. Puna a parede livre ventricular direita com uma agulha de 32 G. Retire a agulha e pressione a ferida com algodão para estancar o sangramento.
7. Insira a ponta do cateter no ventrículo direito através do local da punção e empurre o cateter para a frente lentamente. Ajuste a posição da ponta para obter uma forma de onda de pressão típica do RV mostrada em um monitor e sistema de gravação.
   NOTA: A veia jugular direita também é uma rota apropriada para a medição hemodinâmica.
8. Após 10 minutos de estabilização, registos os dados da pressão arterial sistólica do RV (RVSBP), da pressão diatólica final do RV (RVEDP) e do RV dP/dt. Clique no botão Selecionar para selecionar ciclos cardíacos para cálculo e, em seguida, clique no botão Analisar para calcular os valores médios dos ciclos selecionados.
9. Remova o cateter após a conclusão da gravação e coloque-o dentro da solução salina normal.
10. Eutanize o camundongo com uma injeção intraperitoneal de sódio pentobarbital de overdose (150 mg/kg) e, em seguida, sacrificá-lo por luxação cervical.
11. Colete o coração e a tíbia para análise histológica.

5. Elenco vascular coronário usando um agente de fundição vascular

1. Heparinize o camundongo com uma injeção intraperitoneal de 200 UI/mL de sódio de heparina a 2000 UI/kg (ver Tabela de Materiais).
2. Anestesiar o camundongo com uma injeção intraperitoneal de 50 mg/kg de pentobarbital de sódio.
3. Coloque o supino animal na almofada e entuba para ventilação artificial seguindo as etapas 1.5.2-1.5.3.
4. Abra o peito com uma tesoura cirúrgica conforme descrito na etapa 4.5 e exponha o coração.
5. Faça um entalhe de 3 mm com uma tesoura oftálmica na átrida direita e perfunda o coração com 5 mL de soro fisiológico normal através do ápice cardíaco com um injetor.
6. Bloqueie o sangue da aorta com um grampo aórtico e perfume 0,1 mL de nitroglicerina (1 mg/mL) através do ápice cardíaco com um injetor para dilatar a artéria coronária.
7. Prepare o reagente de elenco misturando os ingredientes no kit de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Recomenda-se preparar o reagente fundido e a perfusão com soro fisiológico normal e nitroglicerina simultaneamente para evitar o fechamento microvascular.
8. Perfunda o coração com 1 mL de reagente fundido através do ápice cardíaco e espere por 2-3 h.
9. Corroa o coração com hidróxido de sódio de 50% por 2-3 dias e remova o tecido muscular ou tecido conjuntivo enxaguando com soro fisiológico normal.
10. Tire fotos debaixo de uma câmera.
    ATENÇÃO: O reagente fundido é prejudicial aos olhos, pele e trato respiratório. Hidróxido de sódio é corrosivo. Usar luvas de proteção, óculos e um jaleco é necessário. O reagente do elenco deve ser preparado em um capô de fumaça.

Resultados

Neste estudo, os camundongos foram aleatoriamente atribuídos ao grupo RVI (n = 11) ou operação falsa (n = 11). O molde coronário em 2 corações normais de rato é mostrado na Figura 1A. Em resposta à ligadura da RCA, a elevação do segmento ST foi observada no chumbo III do ECG (Figura 1B). Além disso, 2,3,5-triphenyl tetrazolium cloreto (TTC) manchas mostraram que a área de infarto representa 45% da parede livre de RV às 24 horas após o pós-operató...

Discussão

Sicard e colegas da França relataram pela primeira vez um modelo de rato de RVI em 2019, que descreveu o processo cirúrgico e focou na interação entre LV e RV após rvi⁹. No entanto, até o momento, nenhum estudo relatou o uso desse modelo para estudos posteriores. Um procedimento mais detalhado seria útil para os pesquisadores usarem o modelo de mouse de RVI para investigação. Em contraste com o relatório de Sicard et ^al.9, fornecemos informações passo a passo pa...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Sigma	T8877	For TTC staining
Animal Mini Ventilator	Havard	Type 845	For artificial ventilation
Animal ultrasound system VEVO2100	Visual Sonic	VEVO2100	Measurement for Doppler flow velocity and AS plaque
Batson’s #17 Anatomical Corrosion Kit	Polyscience Inc	7349	For vasculature casting
buprenorphine	Isoreag	1134630-70-8	For reduce the pain of mice after surgery
C57BL/6J mice + D29A1A2:D27	Animal Center of South Medical University	-	For the generation of mouse RVI model
Camera	Sangnond		For taking photograph
Cold light illuminator	Olympus	ILD-2	Light for operation
electrocardiograph	ADI Instrument	ADAS1000	For recording electrocardiogram
hair removal cream	Reckitt Benchiser	RQ/B 33 Type 2	Remove mouse hair
Heat pad- thermostatic surgical system (ALC-HTP-S1)	SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO	ALC-HTP-S1	Heating
Hematoxylin-eosin dye	Leagene	DH0003	Hematoxylin-eosin staining
Heparin sodium salt	Macklin	H837056	For heparization
Isoflurane	RWD life science	R510-22	Inhalant anaesthesia
Lab made spatula			Work as a laryngoscope
Lab made tracheal cannula			For intubation
Matrx VIP 3000 Isofurane Vaporizer	Midmark Corporation	VIP 3000	Anesthetization
Medical nylon suture (5-0)	Ningbo Medical Needle Co.	5-0	For chest close
Microsurgical elbow tweezers	RWD life science	F11021-11	For surgery
Microsurgical scissors	NAPOX	MB-54-1	For arteriotomy
Millar Catheter	AD Instruments, Shanghai	1.0F	Measurement of pressure gradient
MS400D ultrasonic probe	Visual Sonic	MS400D	Measurement for Doppler flow velocity and AS plaque
needle forceps	Visual Sonic	F31006-12	For surgery
nitroglycerin	BEIJING YIMIN MEDICINE Co		For dilating coronary artery
Ophthalmic scissors	RWD life science	S11022-14	For surgery
Pentobarbital sodium salt	Merck	25MG	Anesthetization
PowerLab Multi-Directional Physiological Recording System	AD Instruments, Shanghai	4/35	Pressure recording
Precision electronic balance	Denver Instrument	TB-114	Weighing scale
Silk suture (8-0)	Ningbo Medical Needle Co.	6-0	coronary artery ligation
Small animal microsurgery equipment	Napox	MA-65	Surgical instruments
tissue forceps	Visual Sonic	F-12007-10	For surgery
tissue scissor	Visual Sonic	S13052-12	Open chest for hemodynamic measurement
Transmission Gel	Guang Gong pai	250ML	preparation for Echocardiography measurement
Vascular Clamps	Visual Sonic	R31005-06	For blocking blood from aorta