胫骨骨折-针模型：骨科损伤的临床相关小鼠模型

摘要

胫骨骨折针模型是一种临床相关的骨科创伤模型，包括单侧开放性胫骨骨折伴髓内钉内固定和同时损伤胫骨前肌。该模型中的热灵敏度可以使用 45 s 热板范式进行测量。

摘要

胫骨骨折针模型是骨科创伤和手术的小鼠模型，它概括了人类此类损伤所表现的复杂肌肉、骨骼、神经和结缔组织损伤。开发该模型的是因为以前的骨科创伤模型不包括对多种组织类型（骨骼、肌肉、神经）的同时损伤，并且不能真正代表人类复杂的骨科创伤。因此，作者修改了以前的骨科创伤模型并开发了胫骨骨折针模型。这种改良的骨折模型包括单侧开放性胫骨骨折伴髓内钉 （IMN） 内固定和同时发生的胫骨前部 （TA） 肌肉损伤，导致机械性异常性疼痛，在受伤后持续长达 5 周。这一系列协议概述了执行临床相关的骨科创伤胫骨骨折针模型的详细步骤，然后进行改良的热板测定以检查骨科损伤后的伤害感受变化。总而言之，这些详细、可重复的方案将使疼痛研究人员能够扩展他们研究骨科创伤引起的疼痛的工具包。

引言

骨科创伤占全球每年近 5 亿人遭受的所有伤害的 25% ^1,2,3。骨科创伤可能与复杂的肌肉、骨骼、神经和结缔组织损伤有关，需要住院和手术以确保充分恢复 ^3,4。骨科创伤后的急性和慢性疼痛会导致严重的身体、心理和经济负担，从而影响患者的生活质量 ^1,4。此外，用于稳定和修复骨折的骨科手术还与严重的急性和慢性术后疼痛有关 ^5,6,7,8,9。

需要更好地了解急性和慢性创伤相关疼痛的潜在机制，以开发更好的治疗方法。为了实现这一目标，需要可靠、可重复且具有临床相关性的临床前模型。由于大多数骨科创伤的动物模型不涉及多种组织类型（骨骼、肌肉、神经）的同时损伤，因此它们并不能真正代表人类复杂的骨科创伤，例如跌倒后的创伤、机动车碰撞或与战争相关的伤害^10,11。因此，我们开发了胫骨骨折针小鼠模型来检查这种损伤的主要表现，包括骨骼和肌肉组织损伤以及急性和慢性疼痛¹¹。胫骨骨折针模型由单侧开放性胫骨骨折伴 IMN 内固定和同时发生的 TA 肌肉损伤组成。TA 的组织学切片显示肌肉损伤，其中致密纤维化发展，早在受伤后 2 周就伴有大而成熟的肌纤维的损失。此外，骨折愈伤组织在受伤后 4 周的显微计算机断层扫描 （microCT） 上很明显，并继续进行重塑¹¹。

各种反射性和非反射性行为分析可用于评估胫骨骨折针模型中疼痛的感觉和情感成分。例如，在这个模型中，可以使用 Von Frey 细丝来演示机械超敏反应。事实上，小鼠在胫骨骨折针手术后在同侧后爪发展出长期的机械超敏反应¹¹。另一个特别有用的行为范式是热板测定，它传统上测量爪子因热刺激而撤离的潜伏期。虽然这种测定法已经使用了几十年¹²，确实是临床前疼痛研究的金标准，但单独测量反射行为有其局限性¹³。因此，我们开发了一种改进的热板范式，它可以在热刺激¹⁴ 的情况下捕获反射和非反射反应的元素。

这种改进的热板测定确定了与原始热板测试一样的初始反应潜伏期和延长的观察期以记录额外的伤害性行为。通过将这些扩展行为分为不同的类别（畏缩、舔舐、守卫、跳跃），可以捕捉到对热刺激的非反射反应。畏缩是指快速移开爪子和/或张开手指，但肢体很快回到热板上。舔和咬后爪和前爪都被定义为舔分析。守卫是在传入伤害性信息结束后继续抬起肢体。最后，跳跃是从热板表面去除所有四个肢体。这些行为可以单独分析，并特别小心地组合在一起，以仍然注意初始响应延迟。

研究方案

根据美国兽医协会指南和国际疼痛研究协会，斯坦福大学实验动物护理管理小组 （APLAC #33114） 均按照斯坦福大学实验动物护理管理小组 （APLAC #33114） 的批准进行。小鼠 （C57BL/6J，到达时 9-11 周龄，研究开始时 11-12 周龄）每笼饲养 2-5 只，并在温度受控的环境中保持 12 小时的光照/黑暗循环，可 随意 获取食物和水。雄性小鼠在研究开始时重约 25 克。有关本研究中使用的所有材料的详细信息，请参阅 材料表 。

1. 基线行为测量

1. 由于小鼠在热板测定中学习速度快，因此不要在该测定中记录小鼠的基线。相反，将小鼠与未受伤的对照进行比较。

2. 麻醉/准备

1. 用吸入异氟醚 2%-4% 麻醉小鼠。
2. 用镊子捏住脚趾，利用脚趾捏反射的丧失来确认麻醉深度。
3. 在小鼠的眼睛上大量涂抹眼部润滑剂，以防止在麻醉下干燥。
4. 在鼠标下面放一块纱布，然后用剪刀去除鼠标右腿到膝关节的毛发。
5. 使用纱布清洁手术区域的头发，然后丢弃纱布。
6. 使用蘸有碘溶液的棉签对手术区域进行消毒。

3. 手术

1. 清洁手术区域并确认麻醉深度后，用手术刀在右腿内侧从胫骨远端到胫骨近端做一个皮肤切口，停在膝下关节水平（图1A）。
2. 使用棉签擦干该区域，特别注意胫骨近端。
3. 使用带有 0.6 毫米圆形毛刺钻头的钻头，在胫骨结节水平的胫骨近端钻一个孔，距离关节线远端 ~2 毫米（图 1B）。
4. 然后，将一根 27 G 针头穿过这个孔/截骨术沿骨髓轴向下插入以建立通道，然后取下针头（图 1B）。
5. 接下来，使用骨锯从外侧在中三分之一和远三分之一的交界处（截骨部位远端 ~5-6 毫米）对胫骨进行划痕，从而对胫骨前肌造成创伤（图 1D）。
   关键：骨折的内侧入路不会产生肌肉损伤。
6. 夹住胫骨的近端，用拇指和食指夹住胫骨的远端，并使用反压完成骨折（图 1C）。
7. 将 27 G 针重新插入髓内间隙，穿过胫骨近端，然后将其穿过骨折部位推进到骨骼的远端段以对齐骨折。
   注意：在不需要金属的成像应用中，可以插入类似尺寸的陶瓷植入物而不是 27 G 针头。虽然这里没有进行，但可以考虑的植入物是陶瓷螺钉（参见 材料表）。
8. 然后，使用切割钳切割与胫骨皮层齐平的针头/塑料植入物。
9. 清理所有血液并确认出血已停止，然后再继续。
10. 出血停止后，使用中断的 5-0 丝缝合线闭合伤口。
    关键：在手术的任何时候都不要让动物无人看管。观察动物，直到它能够独立活动，只有在完全恢复后才能将其放回其巢穴。

4. 手术后

1. 手术后，根据当地方案，通过皮下注射给小鼠 0.05 mg kg-1 丁丙诺啡 0.05 mg ^kg-1 ，每天两次，持续两天。
2. 在麻醉后期间和研究期间监测小鼠，如下所示：前 2 天每天两次，然后每天一次，最多 3 周，此后每周一次。
3. 评估小鼠的行为变化，表明严重压力或疾病，例如嗜睡、荷叶边或体重减轻 >20%。注意与行动和获取食物或水有关的任何问题。
   注意：手术后和每次检查时必须填写手术和护理后日志，并无限期维护，以供机构动物护理和使用委员会审计。

5. 热板测试

注意：受伤后测量可以在胫骨骨折针手术后 7 天开始。为避免这种范式中学习的影响，请在手术后进行一次测试，并与未受伤的对照组进行比较。

1. 设置
   1. 将电热板放置在头顶照明的配置中，塑料圆柱体位于电热板的中心。
   2. 将温度设置为 50 °C，并小心地将相机放在板前，以保持整个封闭区域的视野。
      关键：本研究使用了标准的 8 位彩色工业相机，记录速度高达 76 fps。
2. 测定
   1. 将小鼠放在测试室内至少 30 分钟以适应。
      注意：确保测试室不会太热或太冷，以免结果出现偏差。
   2. 将鼠标放入圆柱体中并开始录制。
   3. 记录鼠标脚首次接触后 45 秒的移动。
   4. 对队列的其余部分重复步骤 5.2.1-5.2.3，同时保持每个后续试验的温度。
   5. 测量第一反应（通常是畏缩）的延迟（以秒为单位），这是经典的 Hot Plate 结果。
      注意：本实验室开发的以下协议还对反射性（畏缩）和非反射性（舔、守卫和跳跃）进行了评分。
3. 分析
   1. 使用提供毫秒时间戳的查看程序对 Hot plate 会话进行评分。
      1. 考虑在 Mac OS 上使用 NCH Prism 软件。在线免费下载此软件（参见 图 2 和 材料表）。
      2. 下载后，打开程序并单击 选项 继续使用演示版.接下来，单击绿色大加号上传热板录音。
      3. 上传后，双击单个文件以视频格式打开。利用窗口底部的光标缓慢拖动视频的长度并开始评分。
         关键：无论使用何种软件，请确保在尽可能大的窗口中观看视频，以避免在视频中拖动时间戳光标时丢失时间分辨率。
   2. 按如下方式设置电子表格的格式。
      1. 要正确运行提供的 R 脚本，请完全按照下面列出的顺序编写列标题，不要使用大写或空格，并按列出的顺序编写：mouseid、behavior、start、end。
      2. 在开始和结束列中输入数据，以 s 到小数点后三位为单位，没有前导零或冒号（例如：2.001）
   3. 对于每个视频，记录疼痛行为的每个实例（以 毫秒为单位）。请注意，仅记录两个后爪的疼痛行为实例。 不要 记录两个 前爪的行为。
      1. 将畏缩/轻弹简单地记录为“畏缩”，包括快速抽出爪子和/或张开手指，但只要他们没有探索/行走，肢体很快就会回到热板上。计算手指张开而不实际抬起整个爪子也算作退缩。 录制的畏缩/轻弹行为不要超过 500 毫秒。如果以这种方式记录，请尽可能缓慢地拖动光标通过此行为，因为在此范围内可能会发生多次退缩和/或防护。
      2. 在传入伤害性信息结束后，寻找肢体的长时间抬高/保护，并将其记录为 守卫。
      3. 将后爪的舔/咬记录为 舔。
      4. 将一次从热板上移除所有四肢记录为 跳跃。
         注意：如果鼠标畏缩，然后抬起爪子，继续通过舔/守卫来参加，然后拆分行为，没有任何时间戳重叠。为每个实验组创建一个单独的电子表格。
   4. 使用提供的 R 脚本开始分析数据。
      1. 使用 “Behavior_Raster_v2.R“ 生成栅格图（如下所示），以可视化整体行为。
      2. 使用“Behavior_duration.R“ 将包含 5 个工作表的电子表格写入工作目录。
         注意：第一个工作表提供所有疼痛行为的总持续时间、第一次疼痛行为的延迟以及疼痛行为的总数。每个后续表格都提供了个人疼痛行为的此信息。
      3. 使用“Behavior_bins.R“编写两个电子表格;一个带有 500 毫秒的箱，显示每个时间点的累积行为持续时间，另一个带有每个鼠标的持续时间行为配置文件的曲线下面积。
      4. 最后，使用 “Cumulative_Sums.R” 编写两个电子表格，但用于行为的累积总和。

结果

胫骨骨折针正畸创伤模型再现了复杂人体损伤中的骨骼、肌肉和疼痛样行为。如图 1C 所示，胫骨骨折会随着时间的推移而愈合，在骨折部位形成愈伤组织，在受伤后 4 周仍可见。由于使用上述骨锯进行外侧入路（步骤 3.5），胫骨前肌受伤，变得广泛纤维化，如整个组织中胶原蛋白沉积增加所见（图 1D）。后爪的敏感性相当严?...

讨论

协议中的关键步骤
在整个手术过程中保持无菌条件至关重要。此外，在手术前、手术中和手术后进行适当的动物护理对于成功生成模型至关重要。如方案前面所述，在进行手术时，应从外侧骨折以确保肌肉受伤。注意不要将胫骨骨折得太低（低于胫骨中三分之一和远三分之一之间的建议交界处），因为这会影响骨折的方式、研究人员用针固定骨头的能力以...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
27 G needles	Medsitis	305136	https://medsitis.com/products/bd-precisionglide-27-g-x-1-1-4-hypodermic-needles-305136?variant=39724583299
5-0 suture	esuture	SN5668	https://www.esutures.com/product/0-in-date/2-/132-/16552-medtronic-monosof-black-18-p-11-cutting-SN5668/
Alcohol swabs	Amazon	B00VS4F91W	https://www.amazon.com/Dynarex-Alcohol-Prep-Sterile-Medium/dp/B00VS4F91W
Alternative drill bits	Rio Grande	341602	https://www.riogrande.com/product/BuschTungstenVanadiumRoundBur Set0314mm/341602
Bone saw drill attachment	Amazon	B07DSXR3NY	https://www.amazon.com/dp/B07DSXR3NY
Buprenorphine	Fidelis Pharmaceuticals		https://ethiqaxr.com/ordering/
Ceramic implant (alternative to pin)	RISystem	RIS.221.103	https://risystem.com/platefixation/mousescrew
Chux (Absorbent Underpad)	Fisher Scientific	NC0059881	https://www.fishersci.com/shop/products/underpad-17x24-chux-300-cs/nc0059881#?keyword=true
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory	Jax #00664	https://www.jax.org/strain/000664
Cotton swabs	Uline	S-18991	https://www.uline.com/Product/Detail/S-18991/First-Aid/Cotton-Tipped-Applicators-Industrial-6
Cutting pliers	Amazon	B076XYVS6Y	https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y
Drill	Chewy	129044	https://www.chewy.com/dremel-cordless-dog-cat-rotary-nail/dp/156127
Drill bits	Amazon	B00HVIGSX2	https://www.amazon.com/Universal-Diamond-Dremel-Rotary-Tool/dp/B00HVIGSX2
Electric shaver	Kent Scientific	CL9990-KIT	https://www.kentscientific.com/products/trimmer-combo-kit/
Eye lube	Amazon	B07H2NLCX5	https://www.amazon.com/OptixCare-Lube-Plus-Hyaluron-Horses/dp/B07H2NLCX5
Gauze pads 2" x 2"	Amazon	B07GHDTB53	https://www.amazon.com/Covidien-Curity-Sterile-Peel-Back-Package/dp/B07GHDTB53
Gauze pads 4" x 4"	Amazon	B00KJ6YFTC	https://www.amazon.com/Covidien-6309-Curity-Gauze-Pads/dp/B00KJ6YFTC
High definition video camera	The Imaging Source	DFK 22AUC03	https://www.theimagingsource.com/products/industrial-cameras/usb-2.0-color/dfk22auc03/?adsdyn&gclid=Cj0KCQiA3-yQBhD3ARIsAHuHT64uIIlImBvh_ toh-3GFSgBcL_fRc1gQTDyXlqDEa Qu4n2_VbWEiRuIaAiueEALw_wcB
Inhalational anesthesia system	Kent Scientific		https://www.kentscientific.com/products/vaporizer-with-vetflo-single-channel-anesthesia-stand/
Iodine solution	Amazon	B005FR7XIK	https://www.amazon.com/Dynarex-Povidone-Iodine-Scrub-Solution/dp/B005FR7XIK
Iodine swab sticks	Amazon	B001V9QKMG	https://www.amazon.com/POVIDONE-IODINE-SWAB-1202-25Box/dp/B001V9QKMG
Isoflurane	California pet pharmacy		https://www.californiapetpharmacy.com/fluriso-isoflurane-250ml.html
NCH Prism Software			https://www.nchsoftware.com/prism/index.html
Plastic Cylinder	Amazon	B08R5KM5B6	https://www.amazon.com/FixtureDisplays-Acrylic-Diameter-Thickness-15140-8-NPF/dp/B08R5KM5B6
Saline	Fisher Scientific	NC9054335	https://www.fishersci.com/shop/products/saline-injection-0-9-10ml/NC9054335
Scalpel	Fisher Scientific	12-000-162	https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-10-style-scalpel-blade/12000162#?keyword=
Scalpel handle	Amazon	B0056ZX1R8	https://www.amazon.com/Swann-Morton-Scalpel-Handle-blades/dp/B0056ZX1R8
Thermal place preference apparatus	BIOSEB	BIO-T2CT	https://www.bioseb.com/en/pain-thermal-allodynia-hyperalgesia/897-thermal-place-preference-2-temperatures-choice-nociception-test.html