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Method Article
Il modello di perno per frattura tibiale è un modello clinicamente rilevante di trauma ortopedico che comprende una frattura tibiale aperta unilaterale con fissazione interna del chiodo intramidollare e lesione simultanea al muscolo tibiale anteriore. La sensibilità termica in questo modello può essere misurata utilizzando un paradigma a piastra riscaldante a 45 s.
Il modello di perno per frattura tibiale è un modello murino di traumatologia ortopedica e chirurgia che ricapitola il complesso danno muscolare, osseo, nervoso e del tessuto connettivo che si manifesta con questo tipo di lesione nell'uomo. Questo modello è stato sviluppato perché i precedenti modelli di trauma ortopedico non includevano lesioni simultanee a più tipi di tessuto (ossa, muscoli, nervi) e non erano veramente rappresentativi del trauma ortopedico complesso umano. Gli autori hanno quindi modificato i precedenti modelli di trauma ortopedico e sviluppato il modello di frattura tibiale-perno. Questo modello di frattura modificata consiste in una frattura tibiale aperta unilaterale con fissazione interna del chiodo intramidollare (IMN) e contemporanea lesione del muscolo tibiale anteriore (TA), con conseguente allodinia meccanica che dura fino a 5 settimane dopo l'infortunio. Questa serie di protocolli delinea i passaggi dettagliati per eseguire il modello di perno di frattura tibiale da trauma ortopedico clinicamente rilevante, seguito da un test su piastra riscaldante modificato per esaminare i cambiamenti nocicettivi dopo una lesione ortopedica. Nel loro insieme, questi protocolli dettagliati e riproducibili consentiranno ai ricercatori del dolore di espandere il loro kit di strumenti per lo studio del dolore indotto da traumi ortopedici.
I traumi ortopedici rappresentano il 25% di tutte le lesioni subite da quasi 500 milioni di persone ogni anno in tutto il mondo 1,2,3. Il trauma ortopedico può essere associato a danni complessi a muscoli, ossa, nervi e tessuto connettivo, che richiedono il ricovero in ospedale e la chirurgia per garantire un recupero adeguato 3,4. Il dolore acuto e cronico dopo un trauma ortopedico può comportare notevoli oneri fisici, psicologici e finanziari che influiscono sulla qualità della vita di un paziente 1,4. Inoltre, la chirurgia ortopedica per stabilizzare e riparare le fratture è anche associata a grave dolore post-chirurgico acuto e cronico 5,6,7,8,9.
I meccanismi alla base del dolore acuto e cronico correlato al trauma devono essere meglio compresi per sviluppare trattamenti migliori. Per raggiungere questo obiettivo, sono necessari modelli preclinici affidabili, riproducibili e clinicamente rilevanti. Poiché la maggior parte dei modelli animali di trauma ortopedico non comportava lesioni simultanee a più tipi di tessuto (ossa, muscoli, nervi), non erano veramente rappresentativi di traumi ortopedici complessi umani, ad esempio traumi dopo cadute, incidenti automobilistici o lesioni legate alla guerra 10,11. Pertanto, abbiamo sviluppato il modello murino di frattura tibiale per esaminare le principali manifestazioni di tale lesione, tra cui il danno osseo e muscolare e il dolore acuto e cronico11. Il modello a perno per frattura tibiale consiste in una frattura tibiale aperta unilaterale con fissazione interna IMN e contemporanea lesione muscolare TA. Le sezioni istologiche dell'AT mostrano una lesione al muscolo in cui si sviluppa una fibrosi densa con conseguente perdita di fibre muscolari grandi e mature già 2 settimane dopo l'infortunio. Inoltre, il callo fratturale è evidente alla tomografia microcomputerizzata (microCT) 4 settimane dopo l'infortunio e continua a subire un rimodellamento11.
Vari saggi comportamentali riflessi e non riflessivi possono essere utilizzati per valutare le componenti sensoriali e affettive del dolore nel modello di perno per frattura tibiale. Ad esempio, in questo modello è possibile utilizzare i filamenti Von Frey per dimostrare l'ipersensibilità meccanica. Infatti, i topi sviluppano un'ipersensibilità meccanica di lunga durata nella zampa posteriore omolaterale dopo l'intervento chirurgico di frattura tibiale11. Un altro paradigma comportamentale particolarmente utile è il saggio su piastra calda, che tradizionalmente misura la latenza del ritiro della zampa a uno stimolo termico. Sebbene questo test sia stato utilizzato per decenni12, davvero un gold standard nella ricerca preclinica sul dolore, la misurazione del comportamento riflessivo da sola ha i suoi limiti13. Di conseguenza, abbiamo sviluppato un paradigma di piastra riscaldante modificato in grado di catturare elementi di risposte sia riflessive che non riflessive nell'impostazione di uno stimolo termico14.
Questo test su piastra calda modificato determina la latenza di risposta iniziale come nel test originale su piastra calda e un periodo di osservazione esteso per registrare ulteriori comportamenti nocifensivi. Classificando questi comportamenti estesi in categorie distinte (sussulto, leccamento, guardia, salto), è possibile catturare la risposta non riflessiva allo stimolo termico. Il sussulto è la rapida rimozione della zampa e/o l'apertura delle dita, ma l'arto viene rapidamente restituito alla piastra calda. Leccare e mordere le zampe posteriori e anteriori sono entrambi definiti come leccate per l'analisi. La guardia è il continuo sollevamento dell'arto oltre la fine dell'informazione nocicettiva afferente. Infine, il salto è la rimozione di tutti e quattro gli arti dalla superficie della piastra calda. Questi comportamenti possono essere analizzati singolarmente e raggruppati con particolare attenzione per annotare ancora la latenza della risposta iniziale.
Tutti i metodi utilizzati durante la conduzione di questa ricerca sono stati eseguiti in conformità e con l'approvazione del Comitato amministrativo dell'Università di Stanford sulla cura degli animali da laboratorio (APLAC #33114) in conformità con le linee guida dell'American Veterinary Medical Association e dell'International Association for the Study of Pain. I topi (C57BL/6J, 9-11 settimane di età all'arrivo, 11-12 settimane di età all'inizio dello studio) sono stati alloggiati 2-5 per gabbia e mantenuti su un ciclo luce/buio di 12 ore in un ambiente a temperatura controllata con accesso ad libitum a cibo e acqua. I topi maschi pesavano circa 25 g all'inizio dello studio. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali utilizzati in questo studio.
1. Misurazioni del comportamento di base
2. Anestesia/preparazione
3. Chirurgia
4. Dopo l'intervento chirurgico
5. Test della piastra riscaldante
NOTA: Le misurazioni post-infortunio possono iniziare 7 giorni dopo l'intervento chirurgico di frattura tibiale. Per evitare l'effetto dell'apprendimento in questo paradigma, eseguire il test una volta dopo l'intervento chirurgico e confrontarlo con i controlli illesi.
Il modello di ortotrauma con perno per frattura tibiale riproduce i comportamenti ossei, muscolari e dolorifici osservati nelle lesioni umane complesse. Come mostrato nella Figura 1C, la frattura tibiale guarisce nel tempo, formando un callo nel sito della frattura che è ancora visibile a 4 settimane dopo la lesione. Come risultato dell'approccio laterale con la sega ossea descritto sopra (passaggio 3.5), il muscolo tibiale anteriore viene danneggiato, dive...
Passaggi critici all'interno del protocollo
È fondamentale mantenere condizioni sterili durante l'intervento chirurgico. Inoltre, un'adeguata cura degli animali prima, durante e dopo l'intervento chirurgico è fondamentale per il successo della generazione del modello. Come accennato in precedenza nel protocollo, quando si esegue l'intervento chirurgico, fratturare l'osso dal lato laterale per garantire lesioni muscolari. Fare attenzione a non fratturare la tibia tro...
Gli autori non hanno conflitti di interesse rilevanti da rivelare.
GM è supportata da una NDSEG Graduate Fellowship e da una Stanford Bio-X Honorary Graduate Fellowship. VLT è supportato dal NIH NIGMS grant #GM137906 e dalla Rita Allen Foundation.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
27 G needles | Medsitis | 305136 | https://medsitis.com/products/bd-precisionglide-27-g-x-1-1-4-hypodermic-needles-305136?variant=39724583299 |
5-0 suture | esuture | SN5668 | https://www.esutures.com/product/0-in-date/2-/132-/16552-medtronic-monosof-black-18-p-11-cutting-SN5668/ |
Alcohol swabs | Amazon | B00VS4F91W | https://www.amazon.com/Dynarex-Alcohol-Prep-Sterile-Medium/dp/B00VS4F91W |
Alternative drill bits | Rio Grande | 341602 | https://www.riogrande.com/product/BuschTungstenVanadiumRoundBur Set0314mm/341602 |
Bone saw drill attachment | Amazon | B07DSXR3NY | https://www.amazon.com/dp/B07DSXR3NY |
Buprenorphine | Fidelis Pharmaceuticals | https://ethiqaxr.com/ordering/ | |
Ceramic implant (alternative to pin) | RISystem | RIS.221.103 | https://risystem.com/platefixation/mousescrew |
Chux (Absorbent Underpad) | Fisher Scientific | NC0059881 | https://www.fishersci.com/shop/products/underpad-17x24-chux-300-cs/nc0059881#?keyword=true |
C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | Jax #00664 | https://www.jax.org/strain/000664 |
Cotton swabs | Uline | S-18991 | https://www.uline.com/Product/Detail/S-18991/First-Aid/Cotton-Tipped-Applicators-Industrial-6 |
Cutting pliers | Amazon | B076XYVS6Y | https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y |
Drill | Chewy | 129044 | https://www.chewy.com/dremel-cordless-dog-cat-rotary-nail/dp/156127 |
Drill bits | Amazon | B00HVIGSX2 | https://www.amazon.com/Universal-Diamond-Dremel-Rotary-Tool/dp/B00HVIGSX2 |
Electric shaver | Kent Scientific | CL9990-KIT | https://www.kentscientific.com/products/trimmer-combo-kit/ |
Eye lube | Amazon | B07H2NLCX5 | https://www.amazon.com/OptixCare-Lube-Plus-Hyaluron-Horses/dp/B07H2NLCX5 |
Gauze pads 2" x 2" | Amazon | B07GHDTB53 | https://www.amazon.com/Covidien-Curity-Sterile-Peel-Back-Package/dp/B07GHDTB53 |
Gauze pads 4" x 4" | Amazon | B00KJ6YFTC | https://www.amazon.com/Covidien-6309-Curity-Gauze-Pads/dp/B00KJ6YFTC |
High definition video camera | The Imaging Source | DFK 22AUC03 | https://www.theimagingsource.com/products/industrial-cameras/usb-2.0-color/dfk22auc03/?adsdyn&gclid=Cj0KCQiA3-yQBhD3ARIsAHuHT64uIIlImBvh_ toh-3GFSgBcL_fRc1gQTDyXlqDEa Qu4n2_VbWEiRuIaAiueEALw_wcB |
Inhalational anesthesia system | Kent Scientific | https://www.kentscientific.com/products/vaporizer-with-vetflo-single-channel-anesthesia-stand/ | |
Iodine solution | Amazon | B005FR7XIK | https://www.amazon.com/Dynarex-Povidone-Iodine-Scrub-Solution/dp/B005FR7XIK |
Iodine swab sticks | Amazon | B001V9QKMG | https://www.amazon.com/POVIDONE-IODINE-SWAB-1202-25Box/dp/B001V9QKMG |
Isoflurane | California pet pharmacy | https://www.californiapetpharmacy.com/fluriso-isoflurane-250ml.html | |
NCH Prism Software | https://www.nchsoftware.com/prism/index.html | ||
Plastic Cylinder | Amazon | B08R5KM5B6 | https://www.amazon.com/FixtureDisplays-Acrylic-Diameter-Thickness-15140-8-NPF/dp/B08R5KM5B6 |
Saline | Fisher Scientific | NC9054335 | https://www.fishersci.com/shop/products/saline-injection-0-9-10ml/NC9054335 |
Scalpel | Fisher Scientific | 12-000-162 | https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-10-style-scalpel-blade/12000162#?keyword= |
Scalpel handle | Amazon | B0056ZX1R8 | https://www.amazon.com/Swann-Morton-Scalpel-Handle-blades/dp/B0056ZX1R8 |
Thermal place preference apparatus | BIOSEB | BIO-T2CT | https://www.bioseb.com/en/pain-thermal-allodynia-hyperalgesia/897-thermal-place-preference-2-temperatures-choice-nociception-test.html |
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