脛骨骨折ピンモデル:整形外科損傷の臨床的に関連性のあるマウスモデル

要約

脛骨骨折ピンモデルは、整形外科的外傷の臨床的に関連するモデルであり、髄内釘の内固定を伴う片側の開放脛骨骨折と、前脛骨筋への同時損傷が含まれます。このモデルの熱感度は、45秒のホットプレートパラダイムを使用して測定できます。

要約

脛骨骨折ピンモデルは、整形外科の外傷と手術のマウスモデルであり、このタイプの損傷でヒトに現れる複雑な筋肉、骨、神経、および結合組織の損傷を再現します。このモデルは、以前の整形外科的外傷モデルには、複数の組織タイプ(骨、筋肉、神経)への同時損傷が含まれておらず、人間の複雑な整形外科的外傷を真に代表していなかったために開発されました。したがって、著者たちは整形外科外傷の以前のモデルを修正し、脛骨骨折ピンモデルを開発した。この修正骨折モデルは、髄内釘 (IMN) 内固定と前脛骨筋 (TA) の同時損傷を伴う片側開放脛骨骨折で構成され、損傷後最大 5 週間続く機械的異痛症を引き起こします。この一連のプロトコルは、臨床的に関連する整形外科用外傷脛骨折ピンモデルを実行するための詳細な手順を概説し、その後、整形外科の損傷後の侵害受容性変化を調べるための修正ホットプレートアッセイが続きます。これらの詳細で再現性のあるプロトコルを組み合わせることで、疼痛研究者は整形外科の外傷誘発性疼痛を研究するためのツールキットを拡大することができます。

概要

整形外科の外傷は、世界中で毎年約5億人が受けているすべての怪我の25%を占めています^1,2,3。整形外科的外傷は、複雑な筋肉、骨、神経、および結合組織の損傷と関連している可能性があり、適切な回復を確保するために入院と手術が必要です^3,4。整形外科的外傷後の急性および慢性の痛みは、患者の生活の質に影響を与える重大な身体的、心理的、および財政的な負担をもたらす可能性があります^1,4。さらに、骨折を安定させて固定するための整形外科手術は、重度の急性および慢性の術後疼痛にも関連しています5,6,7,8,9。

急性および慢性のトラウマ関連疼痛の根底にあるメカニズムをより深く理解して、より良い治療法を開発する必要があります。これを達成するためには、信頼性が高く、再現性があり、臨床的に関連性のある前臨床モデルが必要です。整形外科的外傷のほとんどの動物モデルは、複数の組織タイプ(骨、筋肉、神経)への同時損傷を伴わなかったため、それらは人間の複雑な整形外科的外傷、例えば転倒後の外傷、自動車事故、または戦争関連の傷害を真に代表していなかった^10,11。そこで、骨や筋肉組織の損傷、急性および慢性疼痛など、このような損傷の主な症状を調べるために、脛骨骨折ピンマウスモデルを開発しました¹¹。脛骨骨折ピンモデルは、IMN 内固定による片側開放脛骨骨折と同時の TA 筋肉損傷で構成されています。TAの組織学的切片は、緻密な線維症が発症する筋肉の損傷を示し、損傷後2週間という早い時期に大きく成熟した筋線維が減少します。さらに、骨折カルスは、損傷後4週間のマイクロコンピューター断層撮影(microCT)で明らかになり、リモデリング¹¹を続けています。

さまざまな反射的および非反射的行動アッセイを使用して、脛骨骨折ピンモデルの痛みの感覚的および感情的要素を評価することができます。たとえば、このモデルでは、フォン・フレイ・フィラメントを使用して機械的過敏症を示すことができます。実際、マウスは、脛骨骨折ピン手術後、同側の後肢に長期にわたる機械的過敏症を発症します¹¹。もう1つの特に有用な行動パラダイムは、ホットプレートアッセイであり、これは伝統的に熱刺激に対する足の離脱までの待ち時間を測定します。このアッセイは何十年にもわたって使用されてきました^{が 12}、前臨床疼痛研究の真のゴールドスタンダードですが、再帰的行動の測定だけでは限界があります¹³。その結果、我々は、熱刺激¹⁴の設定において再帰的応答と非反射的応答の両方の要素を捕捉できる修正ホットプレートパラダイムを開発した。

この修正ホットプレートアッセイは、元のホットプレートテストと同様に初期応答遅延を決定し、追加の侵害行動を記録するための観察期間を延長します。これらの拡張された行動を明確なカテゴリ(ひるむ、舐める、守る、跳ねる)に分類することにより、熱刺激に対する非反射的な反応を捉えることができます。ひるみとは、足を素早く取り除いたり、指を広げたりすることですが、手足はすぐにホットプレートに戻されます。後足と前足を舐めたり噛んだりすることは、どちらも分析のために舐めると定義されています。ガードとは、求心性侵害受容情報が終了したときを超えて手足を上げ続けることです。最後に、ジャンプとは、ホットプレートの表面から4本の手足をすべて取り除くことです。これらの動作は個別に分析し、特別な注意を払ってグループ化して、最初の応答の遅延を引き続き記録できます。

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プロトコル

この研究の実施中に使用されたすべての方法は、米国獣医師会のガイドラインおよび国際疼痛学会に従って、スタンフォード大学実験動物管理委員会(APLAC #33114)の承認を得て実施されました。マウス(C57BL/6J、到着時9-11週齢、研究開始時11-12週齢)をケージあたり2-5匹飼育し、温度制御された環境で12時間の明暗サイクルで維持し、餌と水に 自由 にアクセスできる状態にしました。試験開始時の雄マウスの体重は約25gでした。この研究で使用されたすべての材料の詳細については、 材料の表 を参照してください。

1. ベースライン行動測定

1. マウスはホットプレートアッセイで迅速に学習するため、このアッセイではマウスのベースラインを記録しないでください。代わりに、マウスを無傷のコントロールと比較します。

2. 麻酔・準備

1. マウスを吸入イソフルラン2%〜4%で麻酔します。
2. 鉗子でつま先をつまみ、つま先のつまみ反射の喪失を利用して麻酔の深さを確認します。
3. 麻酔下での乾燥を防ぐために、マウスの目に目の潤滑剤をたっぷりと塗ります。
4. マウスの下にガーゼを置き、バリカンを使用してマウスの右脚から膝関節までの毛を取り除きます。
5. ガーゼを使用して手術部位の髪をきれいにしてから、ガーゼを捨てます。
6. ヨウ素溶液に浸した綿棒を使用して手術部位を消毒します。

3. 手術

1. 手術部位を洗浄し、麻酔の深さを確認した後、メスを使用して、右脚の内側表面の遠位脛骨から近位脛骨まで皮膚を切開し、下膝関節のレベルで停止します(図1A)。
2. 近位脛骨に特に注意して、綿棒を使用してその領域を乾かします。
3. 0.6 mm の丸バリ ドリル ビット付きのドリルを使用して、脛骨結節のレベルで脛骨の近位端に、関節線から ~2 mm 遠位の穴を開けます (図 1B)。
4. 次に、この穴/骨切り術を通して骨の髄軸に27Gの針を挿入してチャネルを確立し、針を取り外します(図1B)。
5. 次に、骨のこぎりを使用して、前脛骨筋に外傷を引き起こす外側側面から、中央三分筋と遠位三分の一(骨切り術部位から遠位5~6 mm)の接合部で脛骨に切り込みを入れます(図1D)。
   クリティカル:骨折への内側のアプローチは、筋肉の損傷を引き起こさない。
6. 脛骨の近位端をクランプし、脛骨の遠位端を親指と人差し指で保持し、逆圧を使用して骨折を完了します(図1C)。
7. 27 G の針を近位脛骨を通って髄内腔に再挿入し、骨折部位を横切って骨の遠位部分まで進めて骨折を整列させます。
   注:金属が望ましくないイメージングアプリケーションでは、27G針の代わりに同様のサイズのセラミックインプラントを挿入できます。ここでは行いませんが、検討すべきインプラントとして考えられるのはセラミックスクリューです( 材料の表を参照)。
8. 次に、ペンチを使用して針/プラスチックインプラントを脛骨皮質と同じ高さに切断します。
9. 血液をきれいにし、出血が止まったことを確認してから続行します。
10. 出血が止まったら、中断した5-0シルク縫合糸を使用して傷口を閉じます。
    クリティカル:手術のどの時点でも動物を放置しないでください。動物が独立して動員できるようになるまで動物を観察し、完全に回復してからカジェメートに戻します。

4. 手術後

1. 手術後、ブプレノルフィン 0.05 mg ^kg-1 をマウスに皮下注射で 1 日 2 回、局所プロトコルに従って 2 日間投与します。
2. 麻酔後の期間と研究期間のマウスを次のように監視します:最初の2日間は1日2回、その後3週間まで毎日、その後は毎週。
3. マウスの重度のストレスや病気を示す行動の変化(無気力、毛皮の乱れ、>20%の体重減少など)についてマウスを評価します。移動性や食料や水へのアクセスに関連する問題に注意してください。
   注:手術後およびケア後のログは、手術後および各チェックで記入し、施設の動物管理および使用委員会の監査のために無期限に維持する必要があります。

5.ホットプレート試験

注:損傷後の測定は、脛骨骨折ピン手術の7日後に開始できます。このパラダイムでの学習の影響を避けるために、手術後に一度テストを行い、無傷のコントロールと比較します。

1. セットアップ
   1. 照明が頭上にあり、プラスチック シリンダーがプレートの中央にある構成にホット プレートを配置します。
   2. 温度を50°Cに設定し、プレートの前にカメラを置き、密閉された領域全体が見えるように注意して配置します。
      クリティカル:この研究では、最大76fpsを記録する標準の8ビットカラー産業用カメラを使用しました。
2. 試験
   1. マウスを試験室内に少なくとも30分間置き、慣れさせます。
      注:結果が歪まないように、テストルームが暑すぎたり寒すぎたりしないようにしてください。
   2. マウスをシリンダーに置き、録音を開始します。
   3. マウスの足が最初に接触してから45秒間の動きを記録します。
   4. 手順5.2.1〜5.2.3を残りのコホートで繰り返し、後続の各試行の温度を維持します。
   5. 最初の応答(通常はひるむ)までのレイテンシー(秒単位)を測定しますが、これは古典的なホットプレートの結果です。
      注:この研究室で開発された次のプロトコルは、反射的(ひるむ)と非反射的(舐める、ガードする、ジャンプする)の両方を追加でスコアリングします。
3. 解析
   1. ミリ秒単位のタイムスタンプを提供する表示プログラムを使用して、ホットプレートセッションをスコアリングします。
      1. Mac OSでのNCH Prismソフトウェアの使用をご検討ください。このソフトウェアをオンラインで無料でダウンロードしてください( 図2 および 資料表を参照)。
      2. ダウンロードしたら、プログラムを開き、[ デモ版を引き続き使用する]オプションをクリックします。次に、大きな緑色のプラス記号をクリックして、ホットプレートの録音をアップロードします。
      3. アップロードしたら、個々のファイルをダブルクリックしてビデオ形式で開きます。ウィンドウの下部にあるカーソルを使用して、ビデオの長さをゆっくりとドラッグし、スコアリングを開始します。
         クリティカル:使用するソフトウェアに関係なく、タイムスタンプカーソルをビデオ内でドラッグするときに時間解像度が失われないように、できるだけ大きなウィンドウでビデオを視聴するようにしてください。
   2. スプレッドシートの書式を次のように設定します。
      1. 提供されている R スクリプトを適切に実行するには、列のタイトルを以下にリストされているとおりに正確に記述し、大文字やスペースを使用せず、mouseid、behavior、start、end の順に記述します。
      2. 開始列と終了列に、先頭にゼロやコロンを付けずに、小数点以下 3 桁までの時間でデータを入力します (例: 2.001)。
   3. ビデオごとに、痛みの行動の各インスタンスを (ミリ秒単位) 記録します。2つの後足による痛みの行動のインスタンスのみが記録されることに注意してください。2つの前足の行動を記録しないでください。
      1. ひるむ/はじくことは、足の急速な引き抜きや指の広がりなど、単に「ひるむ」と記録しますが、探索/歩行しない限り、手足はすぐにホットプレートに戻ります。実際に足全体を持ち上げずに指の広がりを数えることもひるむように。 500ミリ秒を超えてひるみ/フリック動作を記録しないでください。そのように記録されている場合は、このスパンでいくつかのひるみやガードが発生した可能性が高いため、この動作をできるだけゆっくりとカーソルをドラッグします。
      2. 求心性侵害受容情報が終了したときを超えて、手足の長期にわたる上昇/保護を探し、 それをガードとして記録します。
      3. 後足を舐める/噛むことを 舐めると記録します。
      4. ホットプレートから4本の手足を一度に取り外した様子をジャンプとして記録 します。
         注:マウスがひるんだ場合、その後、足を上げて、舐めたりガードしたりして出席し続け、タイムスタンプのオーバーラップなしで動作を分割します。実験グループごとに個別のスプレッドシートを作成します。
   4. 提供されている R スクリプトを使用して、データの分析を開始します。
      1. 「Behavior_Raster_v2を使用します。R」を使用して、全体的な動作を視覚化するためのラスタープロット(以下を参照)を生成します。
      2. 「Behavior_duration.R」を押すと、5 枚のシートを含むスプレッドシートが作業ディレクトリに書き込まれます。
         注:最初のシートには、すべての痛みの行動の合計時間、最初の痛みの行動までの遅延、および痛みの行動の総数が表示されます。後続の各シートには、個々の痛みの行動に関するこの情報が記載されています。
      3. 「Behavior_binsを使用します。R」で 2 つのスプレッドシートを書き込む。1 つは各時点での行動の累積持続時間を示す 500 ミリ秒のビンで、もう 1 つは各マウスの持続時間行動プロファイルの曲線下面積を示しています。
      4. 最後に、「Cumulative_Sums.R」を使用して 2 つのスプレッドシートを記述しますが、動作の累積的な合計を行います。

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結果

脛骨骨折ピンオルソ外傷モデルは、複雑なヒトの損傷に見られる骨、筋肉、および痛みのような行動を再現します。図1Cに示すように、脛骨骨折は時間の経過とともに治癒し、骨折部位にカルスを形成し、損傷後4週間でまだ見られます。上記の骨鋸による横方向のアプローチ(ステップ3.5)の結果、前脛骨筋が損傷し、組織全体にコラーゲンが沈?...

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ディスカッション

プロトコル内の重要なステップ
手術中も無菌状態を維持することが大切です。さらに、手術前、手術中、手術後の適切な動物の世話は、モデルの生成を成功させるために最も重要です。プロトコールで前述したように、手術を行う際には、筋肉の損傷を確実にするために、外側から骨を骨折します。脛骨を骨折しすぎると(脛骨の中央3分の1と遠位3分?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
27 G needles	Medsitis	305136	https://medsitis.com/products/bd-precisionglide-27-g-x-1-1-4-hypodermic-needles-305136?variant=39724583299
5-0 suture	esuture	SN5668	https://www.esutures.com/product/0-in-date/2-/132-/16552-medtronic-monosof-black-18-p-11-cutting-SN5668/
Alcohol swabs	Amazon	B00VS4F91W	https://www.amazon.com/Dynarex-Alcohol-Prep-Sterile-Medium/dp/B00VS4F91W
Alternative drill bits	Rio Grande	341602	https://www.riogrande.com/product/BuschTungstenVanadiumRoundBur Set0314mm/341602
Bone saw drill attachment	Amazon	B07DSXR3NY	https://www.amazon.com/dp/B07DSXR3NY
Buprenorphine	Fidelis Pharmaceuticals		https://ethiqaxr.com/ordering/
Ceramic implant (alternative to pin)	RISystem	RIS.221.103	https://risystem.com/platefixation/mousescrew
Chux (Absorbent Underpad)	Fisher Scientific	NC0059881	https://www.fishersci.com/shop/products/underpad-17x24-chux-300-cs/nc0059881#?keyword=true
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory	Jax #00664	https://www.jax.org/strain/000664
Cotton swabs	Uline	S-18991	https://www.uline.com/Product/Detail/S-18991/First-Aid/Cotton-Tipped-Applicators-Industrial-6
Cutting pliers	Amazon	B076XYVS6Y	https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y
Drill	Chewy	129044	https://www.chewy.com/dremel-cordless-dog-cat-rotary-nail/dp/156127
Drill bits	Amazon	B00HVIGSX2	https://www.amazon.com/Universal-Diamond-Dremel-Rotary-Tool/dp/B00HVIGSX2
Electric shaver	Kent Scientific	CL9990-KIT	https://www.kentscientific.com/products/trimmer-combo-kit/
Eye lube	Amazon	B07H2NLCX5	https://www.amazon.com/OptixCare-Lube-Plus-Hyaluron-Horses/dp/B07H2NLCX5
Gauze pads 2" x 2"	Amazon	B07GHDTB53	https://www.amazon.com/Covidien-Curity-Sterile-Peel-Back-Package/dp/B07GHDTB53
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High definition video camera	The Imaging Source	DFK 22AUC03	https://www.theimagingsource.com/products/industrial-cameras/usb-2.0-color/dfk22auc03/?adsdyn&gclid=Cj0KCQiA3-yQBhD3ARIsAHuHT64uIIlImBvh_ toh-3GFSgBcL_fRc1gQTDyXlqDEa Qu4n2_VbWEiRuIaAiueEALw_wcB
Inhalational anesthesia system	Kent Scientific		https://www.kentscientific.com/products/vaporizer-with-vetflo-single-channel-anesthesia-stand/
Iodine solution	Amazon	B005FR7XIK	https://www.amazon.com/Dynarex-Povidone-Iodine-Scrub-Solution/dp/B005FR7XIK
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Isoflurane	California pet pharmacy		https://www.californiapetpharmacy.com/fluriso-isoflurane-250ml.html
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Plastic Cylinder	Amazon	B08R5KM5B6	https://www.amazon.com/FixtureDisplays-Acrylic-Diameter-Thickness-15140-8-NPF/dp/B08R5KM5B6
Saline	Fisher Scientific	NC9054335	https://www.fishersci.com/shop/products/saline-injection-0-9-10ml/NC9054335
Scalpel	Fisher Scientific	12-000-162	https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-10-style-scalpel-blade/12000162#?keyword=
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Thermal place preference apparatus	BIOSEB	BIO-T2CT	https://www.bioseb.com/en/pain-thermal-allodynia-hyperalgesia/897-thermal-place-preference-2-temperatures-choice-nociception-test.html