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요약

경골 골절-핀 모델은 골수내 손톱 내부 고정과 경골 전방 근육의 동시 손상을 동반한 편측 개방 경골 골절을 포함하는 정형외과 외상의 임상적으로 관련된 모델입니다. 이 모델의 열 감도는 45초 핫 플레이트 패러다임을 사용하여 측정할 수 있습니다.

초록

경골 골절 핀 모델은 정형외과적 외상 및 수술에 대한 마우스 모델로, 인간에서 이러한 유형의 부상으로 나타나는 복잡한 근육, 뼈, 신경 및 결합 조직 손상을 요약합니다. 이 모델은 이전 정형외과적 외상 모델에는 여러 조직 유형(뼈, 근육, 신경)에 대한 동시 손상이 포함되지 않았고 인간의 복잡한 정형외과적 외상을 진정으로 대표하지 않았기 때문에 개발되었습니다. 따라서 저자들은 정형외과적 외상에 대한 이전 모델을 수정하고 경골 골절 핀 모델을 개발했습니다. 이 변형된 골절 모델은 골수내 손톱(IMN) 내부 고정과 동시 경골 전방(TA) 근육 손상을 동반한 편측 개방 경골 골절로 구성되어 있으며, 이로 인해 손상 후 최대 5주까지 지속되는 기계적 이질통이 발생합니다. 이 일련의 프로토콜은 임상적으로 관련된 정형외과 외상 경골 골절 핀 모델을 수행하기 위한 세부 단계를 간략하게 설명한 다음 정형외과 손상 후 통각 변화를 검사하기 위해 수정된 열판 분석을 수행합니다. 이러한 상세하고 재현 가능한 프로토콜을 종합하면 통증 연구자들은 정형외과적 외상으로 인한 통증을 연구하기 위한 툴킷을 확장할 수 있습니다.

서문

정형외과적 외상은 전 세계적으로 매년 약 5억 명이 입는 모든 부상의 25%를 차지합니다 1,2,3. 정형외과적 외상은 복잡한 근육, 뼈, 신경 및 결합 조직의 손상과 관련이 있을 수 있으며, 적절한 회복을 위해 입원과 수술이 필요할 수 있다 3,4. 정형외과적 외상 후 급성 및 만성 통증은 환자의 삶의 질에 영향을 미치는 상당한 신체적, 심리적, 재정적 부담을 초래할 수 있다 1,4. 또한 골절을 안정시키고 고정하기 위한 정형외과 수술은 심각한 급성 및 만성 수술 후 통증과도 관련이 있습니다 5,6,7,8,9.

더 나은 치료법을 개발하기 위해서는 급성 및 만성 외상 관련 통증의 기저에 있는 메커니즘을 더 잘 이해해야 합니다. 이를 위해서는 신뢰할 수 있고 재현 가능하며 임상적으로 관련성이 있는 전임상 모델이 필요합니다. 대부분의 정형외과적 외상에 대한 동물모델은 여러 조직 유형(뼈, 근육, 신경)에 대한 동시다발적인 손상을 포함하지 않았기 때문에 인간의 복잡한 정형외과적 외상(예: 낙상 후 외상, 자동차 충돌 또는 전쟁 관련 부상)을 진정으로 대표하지 않았다10,11. 따라서 우리는 뼈와 근육 조직 손상, 급성 및 만성 통증을 포함한 이러한 손상의 주요 징후를 조사하기 위해 경골 골절-핀 마우스 모델을 개발했다11. 경골 골절-핀 모델은 IMN 내부 고정과 동시 TA 근육 손상을 동반한 편측 개방 경골 골절로 구성됩니다. TA의 조직학적 단면은 근육 손상에서 밀집성 섬유화가 발생하고 손상 후 2주 이내에 크고 성숙한 근 섬유가 손실되는 것을 보여줍니다. 더욱이, 골절 굳은살은 부상 후 4주가 지난 후 마이크로컴퓨터 단층촬영(microCT)에서 뚜렷하게 나타나며 리모델링이 계속되고 있다11.

다양한 반사적 및 비반사적 행동 분석을 사용하여 경골 골절-핀 모델에서 통증의 감각 및 정서적 구성 요소를 평가할 수 있습니다. 예를 들어, Von Frey 필라멘트를 사용하여 이 모델에서 기계적 과민성을 입증할 수 있습니다. 실제로, 생쥐는 경골 골절 핀 수술 후 동측 뒷발에서 오래 지속되는 기계적 과민증을 발달시킵니다11. 특히 유용한 또 다른 행동 패러다임은 전통적으로 열 자극에 대한 발바닥 철회까지의 대기 시간을 측정하는 핫 플레이트 분석입니다. 이 분석법은 수십 년 동안 사용되어 왔지만12 전임상 통증 연구의 황금 표준이지만, 반사 행동을 측정하는 것만으로는 한계가 있습니다13. 결과적으로, 우리는 열 자극14의 설정에서 반사적 및 비반사적 반응의 요소를 모두 포착할 수 있는 수정된 핫 플레이트 패러다임을 개발했습니다.

이 수정된 핫 플레이트 분석은 원래 핫 플레이트 테스트에서와 같이 초기 응답 대기 시간을 결정하고 추가 유해 행동을 기록하기 위해 확장된 관찰 기간을 결정합니다. 이러한 확장된 행동을 뚜렷한 범주(움찔하기, 핥기, 지키기, 뛰기)로 분류함으로써 열 자극에 대한 비반사적 반응을 포착할 수 있습니다. 움찔거림은 발바닥의 빠른 제거 및/또는 손가락의 벌림이지만 팔다리는 빠르게 핫 플레이트로 돌아갑니다. 뒷발과 앞발을 핥거나 무는 것은 모두 분석을 위해 핥는 것으로 정의됩니다. 보호는 구심성 통각 정보가 끝날 때 팔다리를 계속 들어 올리는 것입니다. 마지막으로, 점프는 핫 플레이트 표면에서 네 개의 팔다리를 모두 제거하는 것입니다. 이러한 동작은 개별적으로 분석하고 초기 응답 대기 시간을 기록하기 위해 특별한 주의를 기울여 함께 그룹화할 수 있습니다.

프로토콜

이 연구를 수행하는 동안 사용된 모든 방법은 미국 수의학 협회 지침 및 국제 통증 연구 협회에 따라 Stanford University Administrative Panel on Laboratory Animal Care(APLAC #33114)의 승인을 받아 수행되었습니다. 마우스(C57BL/6J, 도착 시 생후 9-11주, 연구 시작 시 생후 11-12주)는 케이지당 2-5마리를 수용하고 음식과 물에 임시 로 접근할 수 있는 온도 제어 환경에서 12시간의 명암/암흑 주기로 유지되었습니다. 연구 시작 시 수컷 마우스의 체중은 약 25g이었습니다. 이 연구에 사용된 모든 재료에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 기준 행동 측정

  1. 마우스는 핫 플레이트 분석에서 빠르게 학습하므로 이 분석에서 마우스에 대한 기준선을 기록하지 마십시오. 대신, 마우스를 다치지 않은 대조군과 비교하십시오.

2. 마취/준비

  1. 흡입 이소 플루란 2 % -4 %로 마우스를 마취하십시오.
  2. 집게로 발가락을 꼬집고 발가락 핀치 반사의 상실을 사용하여 마취 깊이를 확인합니다.
  3. 마취 상태에서 건조함을 방지하기 위해 마우스의 눈에 눈 윤활제를 넉넉하게 바르십시오.
  4. 마우스 아래에 거즈 조각을 놓고 이발기를 사용하여 마우스의 오른쪽 다리에서 무릎 관절까지 머리카락을 제거합니다.
  5. 거즈를 사용하여 수술 부위의 모발을 청소한 다음 거즈를 버립니다.
  6. 요오드 용액에 적신 면봉을 사용하여 수술 부위를 소독합니다.

3. 수술

  1. 수술 부위를 세척하고 마취 깊이를 확인한 후 메스를 사용하여 원위 경골에서 근위 경골까지 오른쪽 다리의 내측 표면을 절개하고 아래쪽 무릎 관절 수준에서 멈춥니다(그림 1A).
  2. 면봉을 사용하여 근위 경골에 특히 주의하면서 해당 부위를 말리십시오.
  3. 0.6mm 원형 버 드릴 비트가 있는 드릴을 사용하여 관절 선에서 원위부로 ~2mm 떨어진 경골 결절 수준에서 경골의 근위 끝에 구멍을 뚫습니다(그림 1B).
  4. 그런 다음 이 구멍/절골술을 통해 뼈의 수질 축을 따라 27G 바늘을 삽입하여 채널을 만든 다음 바늘을 제거합니다(그림 1B).
  5. 다음으로, 뼈톱을 사용하여 경골 전방 근육에 외상을 입히는 측면에서 중간 및 원위 3분의 1(절골 부위 원위부 ~5-6mm)의 접합부에서 경골에 점수를 매깁니다(그림 1D).
    치명적: 골절에 대한 내측 접근은 근육 손상을 일으키지 않습니다.
  6. 경골의 근위부 끝을 고정하고 엄지와 검지 사이에 경골의 원위부 끝을 잡고 반대 압력을 사용하여 뼈 골절을 완료합니다(그림 1C).
  7. 27G 바늘을 근위 경골을 통해 골수내 공간으로 다시 삽입하고 골절 부위를 가로질러 뼈의 원위 분절로 전진시켜 골절을 정렬합니다.
    참고: 금속이 바람직하지 않은 이미징 응용 분야에서는 27G 바늘 대신 유사한 크기의 세라믹 임플란트를 삽입할 수 있습니다. 여기에서 수행되지는 않지만 고려할 수 있는 임플란트는 세라믹 나사입니다( 재료 표 참조).
  8. 그런 다음 절단 펜치를 사용하여 바늘/플라스틱 보형물을 경골 피질과 같은 높이로 자릅니다.
  9. 진행하기 전에 모든 혈액을 청소하고 출혈이 멈췄는지 확인하십시오.
  10. 출혈이 멈추면 중단된 5-0 실크 봉합사를 사용하여 상처를 봉합합니다.
    중요: 수술 중 어느 시점에서도 동물을 방치하지 마십시오. 동물이 독립적으로 움직일 수 있을 때까지 관찰하고 완전히 회복된 후에만 우리 동료에게 돌려줍니다.

4. 수술 후

  1. 수술 후 부프레노르핀 0.05mg kg-1 을 현지 프로토콜에 따라 2일 동안 매일 2회 마우스에 피하 주사로 투여합니다.
  2. 마취 후 기간과 연구 기간 동안 생쥐를 다음과 같이 모니터링합니다: 처음 2일 동안은 매일 2회, 최대 3주까지는 매일, 그 이후에는 매주.
  3. 쥐를 대상으로 무기력증, 주름진 머리 털 또는 >20% 체중 감소와 같은 심각한 스트레스나 질병을 나타내는 행동 변화를 평가합니다. 이동성 및 음식 또는 물에 대한 접근과 관련된 모든 문제를 기록해 두십시오.
    참고: 수술 및 사후 관리 기록은 수술 후와 각 점검 시 작성해야 하며 기관 동물 관리 및 사용 위원회 감사를 위해 무기한 보관해야 합니다.

5. 열판 테스트

참고: 부상 후 측정은 경골 골절 핀 수술 후 7일 후에 시작할 수 있습니다. 이 패러다임에서 학습의 영향을 피하려면 수술 후 한 번 테스트를 수행하고 손상되지 않은 대조군과 비교하십시오.

  1. 설치
    1. 조명이 머리 위에 있고 플라스틱 실린더가 플레이트의 중앙에 있는 구성에 핫 플레이트를 놓습니다.
    2. 온도를 50°C로 설정하고 밀폐된 공간 전체를 볼 수 있도록 주의하여 플레이트 앞에 카메라를 놓습니다.
      중요: 이 연구에서는 최대 76fps를 기록하는 표준 8비트 컬러 산업용 카메라가 사용되었습니다.
  2. 시험
    1. 쥐가 익숙해지도록 최소 30분 동안 시험장 안에 두십시오.
      참고: 결과가 왜곡되지 않도록 시험장이 너무 덥거나 춥지 않은지 확인하십시오.
    2. 마우스를 실린더에 놓고 녹음을 시작합니다.
    3. 마우스의 발이 처음 닿은 후 45초 동안 움직임을 기록합니다.
    4. 나머지 코호트에 대해 5.2.1-5.2.3 단계를 반복하면서 각 후속 시도에서 온도를 유지합니다.
    5. 첫 번째 반응(일반적으로 움찔거림)에 대한 대기 시간(초)을 측정하며, 이는 고전적인 핫 플레이트 결과입니다.
      참고: 이 실험실에서 개발된 다음 프로토콜은 반사적(움찔함)과 비반사적(핥기, 보호하기, 점프)에 추가로 점수를 매깁니다.
  3. 분석
    1. 시간을 제공하는 프로그램을 사용하여 핫 플레이트 세션을 점수화합니다.amp밀리초 단위로 타임스탬프를 제공하는 프로그램.
      1. Mac OS에서 NCH Prism Software를 사용하는 것을 고려해 보십시오. 이 소프트웨어를 온라인에서 무료로 다운로드하십시오( 그림 2재료 표 참조).
      2. 다운로드가 완료되면 프로그램을 열고 데모 버전을 계속 사용하는 옵션을 클릭합니다. 그런 다음 큰 녹색 더하기 기호를 클릭하여 핫 플레이트 녹음을 업로드합니다.
      3. 업로드가 완료되면 개별 파일을 두 번 클릭하여 비디오 형식으로 엽니다. 창 아래쪽에 있는 커서를 사용하여 비디오 길이를 천천히 드래그하고 점수를 매기기 시작합니다.
        중요: 사용하는 소프트웨어에 관계없이 비디오를 통해 타임스탬프 커서를 드래그할 때 시간 해상도가 손실되지 않도록 가능한 가장 큰 창에서 비디오를 시청해야 합니다.
    2. 다음과 같이 스프레드시트 형식을 지정합니다.
      1. 제공된 R 스크립트를 올바르게 실행하려면 아래 나열된 대로 대문자나 공백 없이 나열된 순서대로 column: mouseid, behavior, start, end를 작성하십시오.
      2. 시작 및 끝 열에 데이터를 s의 시간으로 소수점 이하 세 자리까지 선행 0이나 콜론 없이 입력합니다(예: 2.001).
    3. 각 비디오에 대해 통증 행동의 각 인스턴스를 기록합니다(ms까지). 두 뒷발의 통증 행동만 기록된다는 점에 유의하십시오. 앞발 두 개의 동작을 기록하지 마십시오.
      1. 움찔거림/튕기는 발의 빠른 철회 및/또는 손가락의 벌리기를 포함하여 단순히 "움찔거림"으로 기록하지만, 탐색/걷지 않는 한 팔다리는 빠르게 핫 플레이트로 돌아갑니다. 실제로 발 전체를 들어 올리지 않고 손가락을 벌리는 것도 움찔하는 것으로 간주하십시오. 움찔거리거나 튕기는 동작을 500ms 이상 기록하지 마십시오. 이와 같이 기록되는 경우 이 범위에서 여러 번의 움찔거림 및/또는 보호가 발생했을 가능성이 있으므로 가능한 한 천천히 이 동작을 통해 커서를 드래그합니다.
      2. 구심성 통각 정보가 종료될 때 팔다리의 장시간 상승/보호를 찾고 이를 보호로 기록합니다.
      3. 뒷발을 핥거나 무는 것을 핥는 것으로 기록합니다.
      4. 핫 플레이트에서 네 개의 팔다리를 한 번에 모두 제거하는 것을 점프로 기록합니다.
        참고: 마우스가 움찔하다가 발을 위로 올린 상태에서 핥기/보호로 계속 참석한 다음 타임스탬프 겹침 없이 동작을 분할합니다. 각 실험 그룹에 대해 별도의 스프레드시트를 만듭니다.
    4. 제공된 R 스크립트를 활용하여 데이터 분석을 시작합니다.
      1. "Behavior_Raster_v2. R"을 사용하여 전체 동작을 시각화하기 위한 래스터 플롯(아래 그림 참조)을 생성합니다.
      2. "Behavior_duration. R"을 사용하여 5개의 시트가 포함된 스프레드시트를 작업 디렉토리에 씁니다.
        참고: 첫 번째 시트는 모든 통증 행동의 총 지속 시간, 첫 번째 통증 행동에 대한 대기 시간 및 총 통증 행동 수를 제공합니다. 이후의 각 시트는 개별 통증 행동에 대한 이 정보를 제공합니다.
      3. "Behavior_bins. R"을 사용하여 두 개의 스프레드시트를 작성합니다. 하나는 각 시점에서의 누적 동작 지속 시간을 보여주는 500ms bin이 있는 것이고, 다른 하나는 각 마우스의 지속 동작 프로파일에 대한 곡선 아래 영역이 있는 것입니다.
      4. 마지막으로 "Cumulative_Sums.R"을 사용하여 두 개의 스프레드시트를 작성하지만 동작의 누적 합계를 사용합니다.

결과

경골 골절-핀 orthotrauma 모델은 복잡한 인간 부상에서 볼 수 있는 뼈, 근육 및 통증과 유사한 행동을 재현합니다. 그림 1C에서 볼 수 있듯이 경골 골절은 시간이 지남에 따라 치유되어 골절 부위에 굳은살을 형성하며 부상 후 4주가 지난 후에도 여전히 볼 수 있습니다. 위에서 설명한 뼈톱을 사용한 측면 접근의 결과(3.5단계)로, 경골 전방근이 손상되어 ...

토론

프로토콜 내의 중요한 단계
수술 내내 무균 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 또한 수술 전, 수술 중, 수술 후에 적절한 동물 관리는 모델의 성공적인 생성을 위해 가장 중요합니다. 프로토콜에서 앞서 언급했듯이 수술을 할 때 근육 부상을 방지하기 위해 측면에서 뼈를 골절합니다. 경골이 너무 낮게 골절되지 않도록 주의해야 합니다(경골의 중간과 원위 ...

공개

저자는 공개할 관련 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

GM은 NDSEG 대학원 펠로우십과 Stanford Bio-X 명예 대학원 펠로우십의 지원을 받습니다. VLT는 NIH NIGMS 보조금 #GM137906 및 Rita Allen Foundation의 지원을 받습니다.

자료

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