Модель перелома большеберцового пальца: клинически значимая мышиная модель ортопедической травмы

Резюме

Модель перелома большеберцового пальца является клинически значимой моделью ортопедической травмы, включающей односторонний открытый перелом большеберцовой кости с внутренней фиксацией интрамедуллярного стержня и одновременным повреждением передней мышцы большеберцовой кости. Тепловая чувствительность в этой модели может быть измерена с помощью парадигмы нагревательной пластины 45 с.

Аннотация

Модель перелома большеберцового пальца — это мышиная модель ортопедической травмы и хирургии, которая повторяет сложное повреждение мышц, костей, нервов и соединительных тканей, которое проявляется при этом типе травмы у людей. Эта модель была разработана, потому что предыдущие модели ортопедической травмы не включали одновременное повреждение нескольких типов тканей (костей, мышц, нервов) и не были по-настоящему репрезентативными для сложной ортопедической травмы человека. Поэтому авторы модифицировали предыдущие модели ортопедической травмы и разработали модель перелома большеберцовой кости и штифта. Эта модифицированная модель перелома состоит из одностороннего открытого перелома большеберцовой кости с внутренней фиксацией интрамедуллярного гвоздя (IMN) и одновременного повреждения передней большеберцовой мышцы (TA), что приводит к механической аллодинии, которая длится до 5 недель после травмы. В этой серии протоколов подробно описаны шаги по выполнению клинически значимой модели перелома большеберцовой кости при ортопедической травме с последующим модифицированным анализом горячей пластины для изучения ноцицептивных изменений после ортопедической травмы. В совокупности эти подробные, воспроизводимые протоколы позволят исследователям боли расширить свой инструментарий для изучения ортопедической боли, вызванной травмой.

Введение

Ортопедические травмы составляют 25% всех травм, ежегодно получаемых почти 500 миллионами человек во всем мире ^1,2,3. Ортопедическая травма может быть связана со сложным повреждением мышц, костей, нервов и соединительной ткани, что требует госпитализации и хирургического вмешательства для обеспечения адекватного восстановления ^3,4. Острая и хроническая боль после ортопедической травмы может привести к значительным физическим, психологическим и финансовым нагрузкам, которые влияют на качество жизни пациента ^1,4. Кроме того, ортопедическая хирургия для стабилизации и фиксации переломов также связана с тяжелой острой и хронической послеоперационной болью 5,6,7,8,9.

Механизмы, лежащие в основе острой и хронической боли, связанной с травмой, должны быть лучше изучены для разработки более эффективных методов лечения. Для достижения этой цели необходимы надежные, воспроизводимые и клинически значимые доклинические модели. Поскольку большинство животных моделей ортопедической травмы не включали одновременное повреждение нескольких типов тканей (костей, мышц, нервов), они не были действительно репрезентативными для сложных ортопедических травм человека, например, травм после падений, автомобильных аварий или травм, связанных с войной. Поэтому мы разработали мышиную модель перелома большеберцового пальца для изучения основных проявлений такой травмы, включая повреждение костной и мышечной ткани, а также острую и хроническую боль¹¹. Модель перелома большеберцовой кости состоит из одностороннего открытого перелома большеберцовой кости с внутренней фиксацией IMN и одновременной травмой мышцы ТА. Гистологические срезы ТА показывают повреждение мышцы, в котором развивается плотный фиброз с сопутствующей потерей крупных, зрелых мышечных волокон уже через 2 недели после травмы. Кроме того, костная мозоль перелома видна на микрокомпьютерной томографии (микрокомпьютерной томографии) через 4 недели после травмы и продолжает подвергаться ремоделированию11.

Различные анализы рефлексивного и нерефлексивного поведения могут быть использованы для оценки сенсорных и аффективных компонентов боли в модели перелома большеберцового пальца. Например, в этой модели можно использовать нити фон Фрея для демонстрации механической гиперчувствительности. Фактически, у мышей развивается длительная механическая гиперчувствительность в ипсилатеральной задней лапе после операции по перелому большеберцового пальца¹¹. Еще одной особенно полезной поведенческой парадигмой является анализ горячей пластины, который традиционно измеряет латентность отхождения лапы от теплового стимула. Несмотря на то, что этот анализ используется уже несколько десятилетий^и является поистине золотым стандартом в доклинических исследованиях боли, измерение рефлексивного поведения само по себе^{имеет свои ограничения}. В результате мы разработали модифицированную парадигму горячей пластины, которая может захватывать элементы как рефлексивных, так и нерефлексивных реакций в условиях теплового^{стимула.}

Этот модифицированный анализ горячей пластины определяет задержку первоначального ответа, как и в исходном тесте горячей пластины, и увеличенный период наблюдения для регистрации дополнительных ноцифенсивных свойств. Классифицируя эти расширенные модели поведения по отдельным категориям (вздрагивание, облизывание, защита, прыжки), можно зафиксировать нерефлексивную реакцию на тепловой стимул. Вздрагивание – это быстрое удаление лапы и/или растопырение пальцев, но конечность быстро возвращается к горячей пластине. Облизывание и укус задних и передних лап определяются как вылизывание для анализа. Охрана — это непрерывное поднятие конечности за пределы момента, когда заканчивается афферентная ноцицептивная информация. Наконец, прыжки — это удаление всех четырех конечностей с поверхности горячей пластины. Эти модели поведения можно анализировать по отдельности и группировать вместе с особой тщательностью, чтобы по-прежнему отмечать начальную задержку отклика.

протокол

Все методы, использованные при проведении данного исследования, были выполнены в соответствии с рекомендациями и одобрением Административной группы Стэнфордского университета по уходу за лабораторными животными (APLAC #33114) в соответствии с рекомендациями Американской ветеринарной медицинской ассоциации и Международной ассоциации по изучению боли. Мышей (C57BL/6J, возраст 9-11 недель на момент поступления, возраст 11-12 недель на момент начала исследования) содержали по 2-5 человек в клетке и содержали в течение 12-часового цикла свет/темнота в контролируемой температуре среде с ограниченным доступом к пище и воде. Самцы мышей весили около 25 г в начале исследования. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, использованных в этом исследовании.

1. Базовые измерения поведения

1. Поскольку мыши быстро учатся на горячей пластине, не записывайте исходный уровень для мышей в этом анализе. Вместо этого сравните мышей с контрольной группой, не получившей травм.

2. Анестезия/подготовка

1. Обезболить мышь ингаляционным изофлураном 2%-4%.
2. Защемление пальца ноги щипцами и использование рефлекса выпадения пальца ноги для подтверждения глубины анестезии.
3. Обильно нанесите глазную смазку на глаза мыши, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
4. Подложите под мышь кусок марли и с помощью машинки для стрижки удалите волосы с правой ноги мыши до коленного сустава.
5. Очистите волосы от хирургической области с помощью марли, а затем выбросьте марлю.
6. Продезинфицируйте операционную область с помощью ватного тампона, смоченного в растворе йода.

3. Хирургия

1. После очистки операционной области и подтверждения глубины анестезии с помощью скальпеля сделайте разрез кожи на медиальной поверхности правой ноги от дистального отдела большеберцовой кости до проксимального отдела большеберцовой кости, остановившись на уровне нижнего коленного сустава (рисунок 1А).
2. Высушите участок с помощью ватного тампона, уделяя особое внимание проксимальному отделу большеберцовой кости.
3. С помощью сверла с круглым сверлом 0,6 мм просверлите отверстие на проксимальном конце большеберцовой кости на уровне бугристости большеберцовой кости, на ~2 мм дистальнее линии сустава (рис. 1B).
4. Затем введите иглу 27 G через это отверстие/остеотомию вниз по медуллярной оси кости, чтобы установить канал, а затем извлеките иглу (Рисунок 1B).
5. Затем с помощью костной пилы надрежьте большеберцовую кость на стыке средней и дистальной третей (~5-6 мм дистальнее места остеотомии) с латеральной стороны, вызвав травму передней мышцы большеберцовой кости (Рисунок 1D).
   ВАЖНО: Медиальный доступ к перелому не приведет к мышечной травме.
6. Зажмите проксимальный конец большеберцовой кости, удерживайте дистальный конец большеберцовой кости между большим и указательным пальцами и используйте противодавление для завершения перелома кости (Рисунок 1C).
7. Повторно введите иглу 27 G в интрамедуллярное пространство через проксимальный отдел большеберцовой кости и продвигайте ее через место перелома к дистальному сегменту кости, чтобы выровнять перелом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Керамический имплантат аналогичного размера может быть вставлен вместо иглы 27 G в областях визуализации, где металл нежелателен. Несмотря на то, что здесь имплантат не выполняется, возможным имплантатом является керамический винт (см. Таблицу материалов).
8. Затем разрежьте иглу/пластиковый имплантат вровень с корой большеберцовой кости с помощью режущих плоскогубцев.
9. Уберите кровь и убедитесь, что кровотечение остановилось, прежде чем продолжить.
10. Как только кровотечение остановится, закройте рану прерывистым шелковым швом 5-0.
    ВАЖНО: Ни в коем случае не оставляйте животное без присмотра на любом этапе операции. Наблюдайте за животным до тех пор, пока оно не сможет самостоятельно мобилизоваться, и возвращайте его в кагематы только после того, как оно полностью выздоровеет.

4. После операции

1. После операции вводите мышам бупренорфин 0,05 мг ^кг-1 путем подкожной инъекции два раза в день в течение двух дней в соответствии с местными протоколами.
2. Наблюдайте за мышами в постнаркозном периоде и на протяжении исследования следующим образом: два раза в день в течение первых 2 дней, а затем ежедневно до 3 недель, а затем еженедельно.
3. Оцените поведенческие изменения мышей, указывающие на сильный стресс или болезнь, такие как вялость, взъерошенная шерсть или потеря веса на >20%. Обратите внимание на любые вопросы, связанные с мобильностью и доступом к еде или воде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургические журналы и журналы после ухода должны заполняться после операции и при каждом осмотре и храниться в течение неопределенного времени для аудита Комитета по уходу за животными и их использованию в учреждениях.

5. Испытание горячей плиты

ПРИМЕЧАНИЕ: Посттравматические измерения можно начинать через 7 дней после операции по перелому большеберцового пальца. Чтобы избежать эффекта обучения в этой парадигме, проведите тест один раз после операции и сравните с контрольной группой без травм.

1. Настройка
   1. Поместите конфорку в конфигурацию так, чтобы освещение находилось над головой, а пластиковый цилиндр находился по центру пластины.
   2. Установите температуру на 50 °C и поместите камеру перед панелью, осторожно следя за тем, чтобы вся закрытая территория была в поле зрения.
      ВАЖНО: В этом исследовании использовалась стандартная 8-битная цветная промышленная камера, которая записывает до 76 кадров в секунду.
2. Проба
   1. Поместите мышей в комнату для тестирования не менее чем на 30 минут, чтобы они привыкли.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в помещении для тестирования не слишком жарко или холодно, чтобы не исказить результаты.
   2. Поместите мышь в цилиндр и начните запись.
   3. Записывайте движения в течение 45 секунд после первого контакта ног мыши.
   4. Повторите шаги 5.2.1-5.2.3 с остальными членами когорты, поддерживая температуру при каждом последующем испытании.
   5. Измерьте задержку (в секундах) до первого отклика (обычно вздрагивания), что является классическим результатом работы горячей плиты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол, разработанный в этой лаборатории, дополнительно оценивает как рефлексивные (вздрагивание), так и нерефлексивные (облизывание, защита и прыжки).
3. Анализ
   1. Оценивайте сеансы горячей плиты с помощью программы просмотра, которая предоставляет временную метку с миллисекундами.
      1. Рассмотрите возможность использования программного обеспечения NCH Prism на Mac OS. Загрузите это программное обеспечение бесплатно через Интернет (см. Рисунок 2 и Таблицу материалов).
      2. После загрузки откройте программу и нажмите на опцию «Продолжить использование демо-версии». Затем нажмите на большой зеленый знак плюса, чтобы загрузить записи с горячей пластины.
      3. После загрузки дважды щелкните по отдельному файлу, чтобы открыть его в формате видео. Используйте курсор в нижней части окна, чтобы медленно перетащить видео по всей длине и начать озвучивание.
         ВАЖНО: Независимо от используемого программного обеспечения, обязательно смотрите видео в максимально возможном окне, чтобы избежать потери временного разрешения при перетаскивании курсора временной метки по видео.
   2. Отформатируйте таблицу следующим образом.
      1. Чтобы правильно запустить предоставленные скрипты R, напишите заголовки столбцов точно так, как указано ниже, без заглавных букв и пробелов, и в указанном порядке: mouseid, behavior, start, end.
      2. Вводите данные в начальный и конечный столбцы с точностью до трех знаков после запятой без ведущих нулей и двоеточий (например: 2,001)
   3. Для каждого видео запишите каждый случай болевого поведения (с точностью до мс). Обратите внимание, что регистрируются только случаи болевого поведения со стороны двух задних лап. Не записывайте поведение двух передних лап.
      1. Записывайте вздрагивание/щелчок просто как «вздрагивание», включая быстрое отведение лапы и/или разведение пальцев, но конечность быстро возвращается к горячей пластине, если они не исследуют/не ходят. Считайте вздрагивание пальцев без фактического поднятия всей лапы также вздрагиванием. Не записывайте поведение вздрагивания/пролистывания дольше 500 мс. Если запись записана как таковая, перетащите курсор через это поведение как можно медленнее, так как вполне вероятно, что в этом промежутке произошло несколько вздрагиваний и/или защит.
      2. Ищите длительное поднятие/защиту конечности за пределами того момента, когда заканчивается афферентная ноцицептивная информация, и запишите это как защиту.
      3. Записывайте вылизывание/кусание задней лапы как вылизывание.
      4. Запишите снятие сразу всех четырех конечностей с горячей плиты как прыжк.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если мышь вздрагивает, а затем, подняв лапу, продолжает ухаживать за ней, облизывая/защищая, а затем разделяет поведение без наложения временных меток. Создайте отдельную таблицу для каждой экспериментальной группы.
   4. Используйте предоставленные скрипты R, чтобы начать анализ данных.
      1. Используйте "Behavior_Raster_v2. R" для создания растрового графика (как показано ниже) для визуализации общего поведения.
      2. Используйте "Behavior_duration. R" для записи таблицы, содержащей пять листов, в рабочий каталог.
         ПРИМЕЧАНИЕ: На первом листе указана общая продолжительность всех болевых поведений, задержка до первого болевого поведения и общее количество болевых поведений. Каждый последующий лист предоставляет эту информацию для индивидуального болевого поведения.
      3. Используйте "Behavior_bins. R" для написания двух электронных таблиц; один с ячейками по 500 мс, показывающими совокупную продолжительность поведения в каждой временной точке, а другой с областью под кривой для профиля продолжительности поведения каждой мыши.
      4. Наконец, используйте "Cumulative_Sums.R" для написания двух электронных таблиц, но для кумулятивного суммирования поведения.

Результаты

Модель ортотравмы перелома большеберцового пальца воспроизводит костное, мышечное и болевое поведение, наблюдаемое при сложной травме человека. Как показано на рисунке 1C, перелом большеберцовой кости со временем заживает, образуя мозоль на месте пер...

Обсуждение

Критические шаги в рамках протокола
Крайне важно поддерживать стерильные условия на протяжении всей операции. Кроме того, правильный уход за животными до, во время и после операции имеет первостепенное значение для успешного создания модели. Как упоминало...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
27 G needles	Medsitis	305136	https://medsitis.com/products/bd-precisionglide-27-g-x-1-1-4-hypodermic-needles-305136?variant=39724583299
5-0 suture	esuture	SN5668	https://www.esutures.com/product/0-in-date/2-/132-/16552-medtronic-monosof-black-18-p-11-cutting-SN5668/
Alcohol swabs	Amazon	B00VS4F91W	https://www.amazon.com/Dynarex-Alcohol-Prep-Sterile-Medium/dp/B00VS4F91W
Alternative drill bits	Rio Grande	341602	https://www.riogrande.com/product/BuschTungstenVanadiumRoundBur Set0314mm/341602
Bone saw drill attachment	Amazon	B07DSXR3NY	https://www.amazon.com/dp/B07DSXR3NY
Buprenorphine	Fidelis Pharmaceuticals		https://ethiqaxr.com/ordering/
Ceramic implant (alternative to pin)	RISystem	RIS.221.103	https://risystem.com/platefixation/mousescrew
Chux (Absorbent Underpad)	Fisher Scientific	NC0059881	https://www.fishersci.com/shop/products/underpad-17x24-chux-300-cs/nc0059881#?keyword=true
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory	Jax #00664	https://www.jax.org/strain/000664
Cotton swabs	Uline	S-18991	https://www.uline.com/Product/Detail/S-18991/First-Aid/Cotton-Tipped-Applicators-Industrial-6
Cutting pliers	Amazon	B076XYVS6Y	https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y
Drill	Chewy	129044	https://www.chewy.com/dremel-cordless-dog-cat-rotary-nail/dp/156127
Drill bits	Amazon	B00HVIGSX2	https://www.amazon.com/Universal-Diamond-Dremel-Rotary-Tool/dp/B00HVIGSX2
Electric shaver	Kent Scientific	CL9990-KIT	https://www.kentscientific.com/products/trimmer-combo-kit/
Eye lube	Amazon	B07H2NLCX5	https://www.amazon.com/OptixCare-Lube-Plus-Hyaluron-Horses/dp/B07H2NLCX5
Gauze pads 2" x 2"	Amazon	B07GHDTB53	https://www.amazon.com/Covidien-Curity-Sterile-Peel-Back-Package/dp/B07GHDTB53
Gauze pads 4" x 4"	Amazon	B00KJ6YFTC	https://www.amazon.com/Covidien-6309-Curity-Gauze-Pads/dp/B00KJ6YFTC
High definition video camera	The Imaging Source	DFK 22AUC03	https://www.theimagingsource.com/products/industrial-cameras/usb-2.0-color/dfk22auc03/?adsdyn&gclid=Cj0KCQiA3-yQBhD3ARIsAHuHT64uIIlImBvh_ toh-3GFSgBcL_fRc1gQTDyXlqDEa Qu4n2_VbWEiRuIaAiueEALw_wcB
Inhalational anesthesia system	Kent Scientific		https://www.kentscientific.com/products/vaporizer-with-vetflo-single-channel-anesthesia-stand/
Iodine solution	Amazon	B005FR7XIK	https://www.amazon.com/Dynarex-Povidone-Iodine-Scrub-Solution/dp/B005FR7XIK
Iodine swab sticks	Amazon	B001V9QKMG	https://www.amazon.com/POVIDONE-IODINE-SWAB-1202-25Box/dp/B001V9QKMG
Isoflurane	California pet pharmacy		https://www.californiapetpharmacy.com/fluriso-isoflurane-250ml.html
NCH Prism Software			https://www.nchsoftware.com/prism/index.html
Plastic Cylinder	Amazon	B08R5KM5B6	https://www.amazon.com/FixtureDisplays-Acrylic-Diameter-Thickness-15140-8-NPF/dp/B08R5KM5B6
Saline	Fisher Scientific	NC9054335	https://www.fishersci.com/shop/products/saline-injection-0-9-10ml/NC9054335
Scalpel	Fisher Scientific	12-000-162	https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-10-style-scalpel-blade/12000162#?keyword=
Scalpel handle	Amazon	B0056ZX1R8	https://www.amazon.com/Swann-Morton-Scalpel-Handle-blades/dp/B0056ZX1R8
Thermal place preference apparatus	BIOSEB	BIO-T2CT	https://www.bioseb.com/en/pain-thermal-allodynia-hyperalgesia/897-thermal-place-preference-2-temperatures-choice-nociception-test.html