El modelo de fractura tibial con clavo: un modelo de ratón clínicamente relevante de lesión ortopédica

Resumen

El modelo de clavo de fractura tibial es un modelo clínicamente relevante de trauma ortopédico que comprende una fractura tibial abierta unilateral con fijación interna del clavo intramedular y lesión simultánea del músculo tibial anterior. La sensibilidad térmica en este modelo se puede medir utilizando un paradigma de placa caliente de 45 s.

Resumen

El modelo de fractura tibial es un modelo de ratón de traumatismo y cirugía ortopédica que recapitula el daño complejo de músculos, huesos, nervios y tejido conectivo que se manifiesta con este tipo de lesión en los seres humanos. Este modelo se desarrolló porque los modelos anteriores de trauma ortopédico no incluían lesiones simultáneas en múltiples tipos de tejidos (hueso, músculo, nervios) y no eran verdaderamente representativos del trauma ortopédico complejo humano. Por lo tanto, los autores modificaron los modelos anteriores de trauma ortopédico y desarrollaron el modelo de fractura tibial-clavo. Este modelo de fractura modificado consiste en una fractura tibial abierta unilateral con fijación interna del clavo intramedular (IMN) y lesión muscular simultánea del tibial anterior (TA), lo que resulta en alodinia mecánica que dura hasta 5 semanas después de la lesión. Esta serie de protocolos describe los pasos detallados para realizar el modelo de clavo de fractura tibial de trauma ortopédico clínicamente relevante, seguido de un ensayo de placa caliente modificado para examinar los cambios nociceptivos después de una lesión ortopédica. En conjunto, estos protocolos detallados y reproducibles permitirán a los investigadores del dolor ampliar su conjunto de herramientas para estudiar el dolor inducido por el trauma ortopédico.

Introducción

Los traumatismos ortopédicos representan el 25% de todas las lesiones sufridas por casi 500 millones de personas cada año en todo el mundo^1,2,3. El traumatismo ortopédico puede asociarse con daño muscular complejo, óseo, nervioso y del tejido conectivo, lo que requiere hospitalización y cirugía para garantizar una recuperación adecuada ^3,4. El dolor agudo y crónico después de un traumatismo ortopédico puede resultar en cargas físicas, psicológicas y financieras significativas que afectan la calidad de vida del paciente ^1,4. Además, la cirugía ortopédica para estabilizar y reparar fracturas también se asocia con dolor posquirúrgico agudo y crónico severo 5,6,7,8,9.

Los mecanismos que subyacen al dolor agudo y crónico relacionado con el trauma deben comprenderse mejor para desarrollar mejores tratamientos. Para lograrlo, se requieren modelos preclínicos fiables, reproducibles y clínicamente relevantes. Dado que la mayoría de los modelos animales de trauma ortopédico no implicaban lesiones simultáneas en múltiples tipos de tejidos (hueso, músculo, nervios), no eran verdaderamente representativos del trauma ortopédico complejo humano, por ejemplo, trauma después de caídas, accidentes automovilísticos o lesiones relacionadas con la guerra^10,11. Por lo tanto, desarrollamos el modelo de ratón de fractura tibial para examinar las principales manifestaciones de dicha lesión, incluido el daño del tejido óseo y muscular y el dolor agudo y crónico¹¹. El modelo de fractura tibial consiste en una fractura tibial abierta unilateral con fijación interna IMN y lesión simultánea del músculo TA. Las secciones histológicas de la AT muestran una lesión del músculo en la que se desarrolla una fibrosis densa con pérdida asociada de fibras musculares grandes y maduras tan pronto como 2 semanas después de la lesión. Además, el callo de la fractura es evidente en la tomografía por microordenador (microCT) 4 semanas después de la lesión y continúa en remodelación¹¹.

Se pueden utilizar varios ensayos de comportamiento reflexivo y no reflexivo para evaluar los componentes sensoriales y afectivos del dolor en el modelo de fractura tibial con clavo. Por ejemplo, en este modelo se pueden utilizar los filamentos de Von Frey para demostrar la hipersensibilidad mecánica. De hecho, los ratones desarrollan hipersensibilidad mecánica de larga duración en la pata trasera ipsilateral después de la cirugía de fractura tibial¹¹. Otro paradigma conductual particularmente útil es el ensayo de placa caliente, que tradicionalmente mide la latencia hasta la retirada de la pata a un estímulo térmico. Si bien este ensayo se ha utilizado durante décadas¹², siendo un verdadero estándar de oro en la investigación preclínica del dolor, la medición del comportamiento reflexivo por sí sola tiene sus limitaciones¹³. Como resultado, hemos desarrollado un paradigma de placa caliente modificado que puede capturar elementos de respuestas reflexivas y no reflexivas en el entorno de un estímulo térmico¹⁴.

Este ensayo de placa caliente modificada determina la latencia de respuesta inicial como en la prueba de placa caliente original y un período de observación extendido para registrar comportamientos nocifensivos adicionales. Al categorizar estos comportamientos extendidos en categorías distintas (estremecerse, lamer, protegerse, saltar), se puede capturar la respuesta no reflexiva al estímulo térmico. El estremecimiento es la extracción rápida de la pata y/o la separación de los dedos, pero la extremidad se devuelve rápidamente a la placa caliente. Lamerse y morderse las patas traseras y delanteras se definen como lamido para análisis. La protección es la elevación continua de la extremidad más allá de cuando termina la información nociceptiva aferente. Finalmente, el salto es la eliminación de las cuatro extremidades de la superficie de la placa caliente. Estos comportamientos se pueden analizar individualmente y agrupar con especial cuidado para tener en cuenta la latencia de respuesta inicial.

Protocolo

Todos los métodos utilizados para llevar a cabo esta investigación se realizaron de acuerdo y con la aprobación del Panel Administrativo de Cuidado de Animales de Laboratorio de la Universidad de Stanford (APLAC #33114) de acuerdo con las pautas de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria y la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor. Los ratones (C57BL/6J, de 9 a 11 semanas de edad a su llegada, de 11 a 12 semanas de edad al inicio del estudio) se alojaron de 2 a 5 por jaula y se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas en un ambiente de temperatura controlada con acceso ad libitum a alimentos y agua. Los ratones machos pesaban aproximadamente 25 g al inicio del estudio. Consulte la Tabla de Materiales para obtener detalles sobre todos los materiales utilizados en este estudio.

1. Mediciones de comportamiento de referencia

1. Dado que los ratones aprenden rápidamente en el ensayo de placa caliente, no registre una línea de base para los ratones en este ensayo. En su lugar, compara los ratones con los controles ilesos.

2. Anestesia/preparación

1. Anestesiar al ratón con isoflurano inhalado al 2%-4%.
2. Pellizque el dedo del pie con pinzas y use la pérdida del reflejo de pellizco del dedo del pie para confirmar la profundidad de la anestesia.
3. Aplique lubricante ocular generosamente en los ojos del ratón para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia.
4. Coloque un trozo de gasa debajo del ratón y use una maquinilla para eliminar el vello desde la pierna derecha del ratón hasta la articulación de la rodilla.
5. Limpie el cabello del área quirúrgica con la gasa y luego deseche la gasa.
6. Desinfecte el área quirúrgica con un hisopo de algodón humedecido en una solución de yodo.

3. Cirugía

1. Después de limpiar el área quirúrgica y confirmar la profundidad de la anestesia, utilice un bisturí para realizar una incisión en la piel en la superficie medial de la pierna derecha desde la tibia distal hasta la tibia proximal, deteniéndose a nivel de la articulación inferior de la rodilla (Figura 1A).
2. Seque la zona con un bastoncillo de algodón, prestando especial atención a la tibia proximal.
3. Usando un taladro con una broca redonda de 0,6 mm, perfore un orificio en el extremo proximal de la tibia al nivel de la tuberosidad tibial, ~ 2 mm distal a la línea de la unión (Figura 1B).
4. A continuación, se introduce una aguja de 27 G a través de este orificio/osteotomía por el eje medular del hueso para establecer un canal y, a continuación, se retira la aguja (Figura 1B).
5. A continuación, utilice una sierra para huesos para marcar la tibia en la unión de los tercios medio y distal (~5-6 mm distal al sitio de la osteotomía) desde la cara lateral causando un traumatismo en el músculo tibial anterior (Figura 1D).
   CRÍTICO: Un abordaje medial de la fractura no producirá lesión muscular.
6. Pinza el extremo proximal de la tibia, sostenga el extremo distal de la tibia entre el pulgar y el índice, y use contrapresión para completar la fractura ósea (Figura 1C).
7. Vuelva a insertar la aguja de 27 G en el espacio intramedular, a través de la tibia proximal, y apéntela avanzar a través del sitio de la fractura hasta el segmento distal del hueso para alinear la fractura.
   NOTA: Se puede insertar un implante cerámico de tamaño similar en lugar de una aguja de 27 G en aplicaciones de diagnóstico por imágenes donde el metal no es deseable. Aunque no se realiza aquí, un posible implante a considerar es un tornillo cerámico (ver la Tabla de Materiales).
8. A continuación, corte la aguja/implante de plástico al ras de la corteza tibial con unos alicates de corte.
9. Limpie la sangre y confirme que el sangrado se haya detenido antes de continuar.
10. Una vez que el sangrado se haya detenido, cierre la herida con una sutura de seda 5-0 interrumpida.
    CRÍTICO: No deje al animal desatendido en ningún momento de la cirugía. Observe al animal hasta que sea capaz de movilizarse de forma independiente y devuélvalo a sus compañeros de jaula solo una vez que se haya recuperado por completo.

4. Después de la cirugía

1. Después de la cirugía, administrar buprenorfina 0,05 mg ^kg-1 por inyección subcutánea a los ratones dos veces al día durante dos días según los protocolos locales.
2. Monitoree a los ratones en el período posterior a la anestesia y durante la duración del estudio de la siguiente manera: dos veces al día durante los primeros 2 días, y luego diariamente hasta 3 semanas, y semanalmente a partir de entonces.
3. Evalúe a los ratones para detectar cambios de comportamiento indicativos de estrés o enfermedad graves, como letargo, pelaje alborotado o pérdida de peso del >20%. Tome nota de cualquier problema relacionado con la movilidad y el acceso a alimentos o agua.
   NOTA: Los registros quirúrgicos y posteriores al cuidado deben completarse después de la cirugía y en cada revisión y mantenerse indefinidamente para la auditoría del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.

5. Prueba de placa caliente

NOTA: Las mediciones posteriores a la lesión pueden comenzar 7 días después de la cirugía de fractura de tibia. Para evitar el efecto del aprendizaje en este paradigma, realice la prueba una vez después de la cirugía y compárela con los controles no lesionados.

1. Arreglo
   1. Coloque la placa calefactora en una configuración en la que la iluminación esté en lo alto y el cilindro de plástico esté centrado en la placa.
   2. Ajuste la temperatura a 50 °C y coloque una cámara frente a la placa con cuidado para mantener a la vista la totalidad del área cerrada.
      CRÍTICO: En este estudio se utilizó una cámara industrial en color estándar de 8 bits, que graba hasta 76 fps.
2. Ensayo
   1. Coloque a los ratones dentro de la sala de pruebas durante al menos 30 minutos para que se habitúen.
      NOTA: Asegúrese de que la sala de pruebas no esté demasiado caliente o fría para evitar sesgar los resultados.
   2. Coloque el mouse en el cilindro y comience a grabar.
   3. Registre los movimientos durante 45 segundos después de que las patas del ratón hagan contacto por primera vez.
   4. Repita los pasos 5.2.1-5.2.3 con el resto de la cohorte mientras mantiene la temperatura para cada ensayo subsiguiente.
   5. Mida la latencia (en segundos) hasta la primera respuesta (generalmente estremecimiento), que es el resultado clásico de la placa caliente.
      NOTA: El siguiente protocolo desarrollado en este laboratorio también puntúa tanto el reflejo (estremecimiento) como el no reflejo (lamer, protegerse y saltar).
3. Análisis
   1. Puntúe las sesiones de placa caliente utilizando un programa de visualización que proporciona una marca de tiempo con milisegundos.
      1. Considere usar el software NCH Prism en un Mac OS. Descargue este software de forma gratuita en línea (consulte la Figura 2 y la Tabla de materiales).
      2. Una vez descargado, abra el programa y haga clic en la opción Continuar usando la versión de demostración. A continuación, haga clic en el signo más verde grande para cargar las grabaciones de la placa caliente.
      3. Una vez cargado, haga doble clic en un archivo individual para abrirlo en formato de video. Utilice el cursor en la parte inferior de la ventana para arrastrar lentamente a lo largo del video y comenzar a puntuar.
         CRÍTICO: Independientemente del software utilizado, asegúrese de ver los videos en la ventana más grande posible para evitar perder resolución de tiempo al arrastrar el cursor de la marca de tiempo a través del video.
   2. Formatee una hoja de cálculo de la siguiente manera.
      1. Para ejecutar correctamente los scripts de R proporcionados, escriba los títulos de las columnas exactamente como se enumeran a continuación, sin mayúsculas ni espacios y en el orden indicado: mouseid, comportamiento, inicio, fin.
      2. Introduzca los datos en las columnas inicial y final en tiempo en s a tres decimales sin ceros ni dos puntos a la izquierda (por ejemplo: 2,001)
   3. Para cada video, grabe cada instancia de un comportamiento de dolor (a ms). Tenga en cuenta que solo se registran los casos de comportamiento de dolor por parte de las dos patas traseras. No registre el comportamiento de las dos patas delanteras.
      1. Registre el estremecimiento/movimiento simplemente como "estremecimiento", que incluye la retirada rápida de la pata y/o la separación de los dedos, pero la extremidad se devuelve rápidamente a la placa caliente, siempre y cuando no estén explorando/caminando. Cuente la separación de los dedos sin levantar realmente toda la pata también como estremecimiento. No registre el comportamiento de temblor/parpadeo durante más de 500 ms. Si se registra como tal, arrastre el cursor a través de este comportamiento lo más lentamente posible, ya que es probable que se hayan producido varios temblores y/o protecciones en este intervalo.
      2. Busque la elevación/protección prolongada de una extremidad más allá del momento en que termina la información nociceptiva aferente y regístrela como protectora.
      3. Registre el lamido/mordida de una pata trasera como lamido.
      4. Registre la extracción de las cuatro extremidades de la placa caliente a la vez como un salto.
         NOTA: Si un ratón se estremece, y luego con la pata levantada, continúa atendiendo lamiendo / protegiendo, y luego divide el comportamiento sin ninguna superposición de marca de tiempo. Cree una hoja de cálculo separada para cada grupo experimental.
   4. Utilice los scripts de R proporcionados para comenzar a analizar los datos.
      1. Utilice "Behavior_Raster_v2. R" para generar un gráfico ráster (como se muestra a continuación) para visualizar el comportamiento general.
      2. Utilice "Behavior_duration. R" para escribir una hoja de cálculo que contenga cinco hojas en el directorio de trabajo.
         NOTA: La primera hoja proporciona la duración total de todas las conductas de dolor, la latencia hasta la primera conducta de dolor y el número total de conductas de dolor. Cada hoja subsiguiente proporciona esta información para las conductas de dolor individuales.
      3. Utilice "Behavior_bins. R" para escribir dos hojas de cálculo; uno con bins de 500 ms que muestran la duración acumulada del comportamiento en cada punto de tiempo, y el otro con el área bajo la curva para el perfil de comportamiento de duración de cada ratón.
      4. Finalmente, use "Cumulative_Sums.R" para escribir dos hojas de cálculo, pero para la suma acumulativa de un comportamiento.

Resultados

El modelo de ortotrauma de fractura tibial reproduce los comportamientos óseos, musculares y similares al dolor que se observan en las lesiones humanas complejas. Como se muestra en la Figura 1C, la fractura de tibia se cura con el tiempo, formando un callo en el sitio de la fractura que todavía se ve a las 4 semanas después de la lesión. Como resultado del abordaje lateral con la sierra ósea descrito anteriormente (paso 3.5), el músculo tibial anterio...

Discusión

Pasos críticos dentro del protocolo
Es crucial mantener las condiciones estériles durante toda la cirugía. Además, el cuidado adecuado de los animales antes, durante y después de la cirugía es primordial para el éxito de la generación del modelo. Como se mencionó anteriormente en el protocolo, al realizar la cirugía, fracturar el hueso del lado lateral para asegurar la lesión muscular. Tenga cuidado de no fracturar la tibia demasiado abajo (por debajo de la...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
27 G needles	Medsitis	305136	https://medsitis.com/products/bd-precisionglide-27-g-x-1-1-4-hypodermic-needles-305136?variant=39724583299
5-0 suture	esuture	SN5668	https://www.esutures.com/product/0-in-date/2-/132-/16552-medtronic-monosof-black-18-p-11-cutting-SN5668/
Alcohol swabs	Amazon	B00VS4F91W	https://www.amazon.com/Dynarex-Alcohol-Prep-Sterile-Medium/dp/B00VS4F91W
Alternative drill bits	Rio Grande	341602	https://www.riogrande.com/product/BuschTungstenVanadiumRoundBur Set0314mm/341602
Bone saw drill attachment	Amazon	B07DSXR3NY	https://www.amazon.com/dp/B07DSXR3NY
Buprenorphine	Fidelis Pharmaceuticals		https://ethiqaxr.com/ordering/
Ceramic implant (alternative to pin)	RISystem	RIS.221.103	https://risystem.com/platefixation/mousescrew
Chux (Absorbent Underpad)	Fisher Scientific	NC0059881	https://www.fishersci.com/shop/products/underpad-17x24-chux-300-cs/nc0059881#?keyword=true
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory	Jax #00664	https://www.jax.org/strain/000664
Cotton swabs	Uline	S-18991	https://www.uline.com/Product/Detail/S-18991/First-Aid/Cotton-Tipped-Applicators-Industrial-6
Cutting pliers	Amazon	B076XYVS6Y	https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y
Drill	Chewy	129044	https://www.chewy.com/dremel-cordless-dog-cat-rotary-nail/dp/156127
Drill bits	Amazon	B00HVIGSX2	https://www.amazon.com/Universal-Diamond-Dremel-Rotary-Tool/dp/B00HVIGSX2
Electric shaver	Kent Scientific	CL9990-KIT	https://www.kentscientific.com/products/trimmer-combo-kit/
Eye lube	Amazon	B07H2NLCX5	https://www.amazon.com/OptixCare-Lube-Plus-Hyaluron-Horses/dp/B07H2NLCX5
Gauze pads 2" x 2"	Amazon	B07GHDTB53	https://www.amazon.com/Covidien-Curity-Sterile-Peel-Back-Package/dp/B07GHDTB53
Gauze pads 4" x 4"	Amazon	B00KJ6YFTC	https://www.amazon.com/Covidien-6309-Curity-Gauze-Pads/dp/B00KJ6YFTC
High definition video camera	The Imaging Source	DFK 22AUC03	https://www.theimagingsource.com/products/industrial-cameras/usb-2.0-color/dfk22auc03/?adsdyn&gclid=Cj0KCQiA3-yQBhD3ARIsAHuHT64uIIlImBvh_ toh-3GFSgBcL_fRc1gQTDyXlqDEa Qu4n2_VbWEiRuIaAiueEALw_wcB
Inhalational anesthesia system	Kent Scientific		https://www.kentscientific.com/products/vaporizer-with-vetflo-single-channel-anesthesia-stand/
Iodine solution	Amazon	B005FR7XIK	https://www.amazon.com/Dynarex-Povidone-Iodine-Scrub-Solution/dp/B005FR7XIK
Iodine swab sticks	Amazon	B001V9QKMG	https://www.amazon.com/POVIDONE-IODINE-SWAB-1202-25Box/dp/B001V9QKMG
Isoflurane	California pet pharmacy		https://www.californiapetpharmacy.com/fluriso-isoflurane-250ml.html
NCH Prism Software			https://www.nchsoftware.com/prism/index.html
Plastic Cylinder	Amazon	B08R5KM5B6	https://www.amazon.com/FixtureDisplays-Acrylic-Diameter-Thickness-15140-8-NPF/dp/B08R5KM5B6
Saline	Fisher Scientific	NC9054335	https://www.fishersci.com/shop/products/saline-injection-0-9-10ml/NC9054335
Scalpel	Fisher Scientific	12-000-162	https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-10-style-scalpel-blade/12000162#?keyword=
Scalpel handle	Amazon	B0056ZX1R8	https://www.amazon.com/Swann-Morton-Scalpel-Handle-blades/dp/B0056ZX1R8
Thermal place preference apparatus	BIOSEB	BIO-T2CT	https://www.bioseb.com/en/pain-thermal-allodynia-hyperalgesia/897-thermal-place-preference-2-temperatures-choice-nociception-test.html