辅酶Q过量设置下线粒体通透性转变孔隙的开放概率评估

摘要

该方法利用线粒体通透性转变孔隙对低导质子泄漏的贡献，确定与野生型对照相比，心肌细胞线粒体辅酶Q含量增加的新生儿脆性X综合征小鼠孔隙开放的电压阈值。

摘要

线粒体通透性转变孔（mPTP）是一种电压门控，非选择性，线粒体内膜（IMM）巨型通道，在健康和疾病中很重要。mPTP介导质子在低电导开口期间通过IMM泄漏，并被环孢菌素A（CsA）特异性抑制。辅酶Q（CoQ）是mPTP的调节因子，在脆性X综合征（FXS， Fmr1 敲除）的新生小鼠模型中，已经发现前脑和心脏线粒体中CoQ含量和mPTP开放概率的组织特异性差异。我们开发了一种技术来确定这种突变应变中mPTP开口的电压阈值，利用mpTPP作为质子泄漏通道的作用。

为此，在泄漏呼吸期间，使用极谱法和四苯基膦（TPP ⁺）离子选择性电极在分离的线粒体中同时测量氧消耗量和膜电位（ΔΨ）。mPTP打开的阈值由CsA介导的对特定膜电位处质子泄漏的抑制的发作决定。使用这种方法，在辅酶Q过量的背景下精确定义了mpTPP的电压门控差异。这种新技术将允许未来的研究，以增强对mpTPP低电导开口的生理和病理调节的理解。

引言

mPTP介导渗透率转变（PT），由此IMM突然变得对小分子和溶质^1，2具有渗透性。这种惊人的现象明显背离了IMM的特征不渗透性，后者是建立氧化磷酸化³所需的电化学梯度的基础。与其他线粒体转运机制不同，PT是一种高电导，非特异性和非选择性过程，允许一系列分子通过高达1.5 kDa^4，5。mPTP是IMM内的电压门控通道，其开口会改变ΔΨ，ATP产生，钙稳态，活性氧（ROS）产生和细胞活力⁴。

在病理极端，mPTP的不受控制和长时间的高电导开放导致电化学梯度的塌陷，基质肿胀，基质吡啶核苷酸的消耗，外膜破裂，膜间蛋白（包括细胞色素c）的释放，最终导致细胞死亡^4，6。这种病理性 mPTP 开放与心肌缺血再灌注损伤、心力衰竭、创伤性脑损伤、各种神经退行性疾病和糖尿病有关^1，7。然而，低电导 mPTP 开孔本质上是生理性的，与高导通度开路相比，不会导致严重的去极化或线粒体肿胀⁴.

孔隙的低电导开口将渗透率限制在~300 Da，允许质子独立于ATP合成通过，并且是生理质子泄漏的潜在来源⁵。生理mPTP开放导致ΔΨ的受控下降，通过呼吸运输链增加电子通量，并导致超氧化物的短爆发或闪光，有助于ROS信号传导⁸。调节这种短暂的mPTP开放对于钙稳态和正常细胞发育和成熟很重要^{4，9，10，11}。例如，发育中神经元的瞬时孔隙打开触发分化，而mPTP的闭合诱导未成熟心肌细胞^4，5的成熟。

尽管mpTPP在健康和疾病中的功能意义已经确定，但其确切的分子身份仍然存在争议。mPTP的分子结构和功能研究进展已在别处进行了全面综述¹².简言之，目前，mPTP的高导率和低电导状态已被假设为由不同的实体介导¹²。主要候选者是F1 / F0 ATP合酶（ATP合酶）和腺嘌呤核苷酸转运蛋白（ANT），分别用于高导和低电导模式，分别为¹²。

尽管对mpTPP的孔隙形成成分的确切身份缺乏共识，但某些关键特征已经详细说明。mPTP的一个公认特征是它受电化学梯度调节，使得IMM的去极化导致孔隙开口¹³。先前的研究表明，副硫醇基团的氧化还原状态改变了mPTP的电压门控，使得氧化以相对较高的ΔΨs打开孔隙，硫醇基团还原导致闭合mPTP概率^为14。然而，蛋白质电压传感器的身份是未知的。

已经确定了调节孔隙开放概率的各种小分子。例如，mPTP可以被钙、无机磷酸盐、脂肪酸和ROS刺激打开，并且可以被腺嘌呤核苷酸（特别是ADP）、镁、质子和CsA^5，12抑制。其中一些监管机构的作用机制已经阐明。线粒体钙至少部分通过与ATP合酶¹⁵的β亚基结合来触发mPTP开放。ROS可以通过降低其对ADP的亲和力并增强其对亲和力环蛋白D（CypD）的亲和力来激活mpTPP，环蛋白D是研究最好的蛋白质mpTPP激活剂¹⁶。无机磷酸盐和脂肪酸活化mpTPP的机制尚不清楚。至于内源性抑制剂，ADP被认为通过在ANT或ATP合酶处结合来抑制mpTPP，而镁通过从其结合位点^{15，17，18，19}中取代钙来发挥其抑制作用。

低 pH 值通过质子化 ATP 合酶 12，20，21 的调节寡霉素敏感性赋予蛋白 （OSCP） 亚基的组氨酸^{112 来}抑制 mPTP ^开放。mPTP的典型药物抑制剂CsA通过结合CypD并阻止其与OSCP^22，23的关联起作用。先前的工作还表明，各种CoQ类似物与mpTPP相互作用，抑制它或激活它²⁴。在最近的研究中，我们发现由于新生FXS小鼠^幼崽的前脑线粒体CoQ缺乏而导致的病理性开放mPTP，过度质子泄漏和低效氧化磷酸化的证据。

用外源性辅酶Q闭合孔阻断了树突状棘的病理性质子泄漏并诱导了形态学成熟²⁵。有趣的是，在相同的动物中，与野生型对照组相比，FXS心肌细胞具有过量的CoQ水平和闭合的mPTP概率²⁶。虽然这些组织特异性CoQ水平差异的原因尚不清楚，但这些发现强调了内源性CoQ可能是mpTPP的关键调节因子的概念。然而，我们的知识存在重大差距，因为辅酶Q介导的mPTP抑制机制仍然未知。

mPTP的调节是细胞信号传导和存活的关键决定因素⁴。因此，在考虑特定的病理生理机制时，检测线粒体内的mPTP开放是关键。通常，高导电孔隙开口的阈值是使用钙来触发渗透性转变来确定的。这种钙负荷导致膜电位的塌陷，氧化磷酸化的快速解偶联和线粒体肿胀^27，28。我们试图开发一种方法来 检测原位 低电导的mPTP开口，而不会诱导它 本身。

该方法利用了mpTPP作为质子泄漏通道的作用。为此，采用Clark型和TPP⁺ 离子选择性电极分别在泄漏呼吸期间同时测量孤立线粒体中的耗氧量和膜电位²⁹。mPTP打开的阈值由CsA介导的对特定膜电位处质子泄漏的抑制的发作决定。使用这种方法，可以精确地定义在CoQ过量的情况下mPTP的电压门控差异。

研究方案

哥伦比亚大学医学中心机构动物护理和使用委员会批准了所有描述的方法。FXS （Fmr1 KO） （FVB.129P2-Pde6b⁺ Tyr^c-ch Fmr1^tm1Cgr/J） 和对照 （FVB） （FVB.129P2-Pde6b⁺ Tyr^c-ch/AntJ） 小鼠作为本研究的模型系统，在商业上获得（见 材料表）。每个实验组使用五到十一只动物。使用产后第10天（P10）小鼠模拟人类婴儿期的某个时间点。

1. 从小鼠心脏中分离线粒体

1. 制备用于线粒体分离和呼吸实验的缓冲液，如 表1所述。如果提前制作，请储存在4°C。
   1. 制备15%密度梯度培养基:用密度梯度稀释剂将商业密度梯度培养基稀释至80%体积/体积（v / v）。通过添加线粒体分离缓冲液（MI）/牛血清白蛋白（BSA），进一步稀释80%密度梯度培养基15%v / v。
2. 从新鲜，非冷冻组织中分离线粒体用于这些实验，并在制备当天使用，通常在5小时内²⁶。在冰上执行所有隔离步骤。
   1. 将鼠标斩首并切除心脏。立即在培养皿中用冰冷的MI / BSA清洗1-2次。切下心房并切碎组织。
   2. 将切碎的心脏组织转移到含有1 mL MI / BSA的玻璃玻璃均质器中。用较松的（A）杵（10冲程）均匀化，然后用较紧的（B）杵（10冲程）均匀化。
   3. 将匀浆物在4°C下以1，100× g 离心2分钟以除去核和细胞碎片。
   4. 轻轻地取上清液而不接触任何蓬松的沉淀，并小心地将其层放在离心管中700μL15%密度梯度培养基上。在4°C下以18，500× g 离心15分钟。
   5. 将沉淀重悬于1mL蔗糖缓冲液（SB）/ BSA中，并在4°C下以10，000× g 离心10分钟。
   6. 完全除去并丢弃上清液。将沉淀重悬于SB / BSA中至最终体积为55μL。
   7. 使用标准测定（例如双辛胆酸（BCA）蛋白质测定）定量线粒体蛋白质含量。

2. 线粒体氧 （O₂） 消耗量和 ΔΨ

1. 氧电极组装和校准
   1. 根据制造商的说明设置和校准氧电极（参见 材料表）。
      1. 将一滴50%氯化钾（KCl）电解质溶液放在电极盘圆顶的顶部。
      2. 在电解质滴上放置一小块〜^2厘米2 的香烟纸垫片，上面覆盖着一块稍大的提供的聚四氟乙烯（PTFE）膜。
      3. 使用提供的涂覆器工具，将小电极盘O形圈推过电极的圆顶。
         注意:确保没有气泡，并且膜是光滑的。
   2. 用电解质溶液充分补充储液槽。
   3. 将较大的O形圈放在电极盘周围的凹槽中。
   4. 将圆盘安装到电极室中，然后将其连接到控制单元。
   5. 向反应室中加入2 mL空气饱和去离子水，向反应室中加入PTFE涂层磁铁。
   6. 将腔室连接到控制单元的后部。
   7. 将温度设置为37°C，搅拌速度设置为100。
   8. 在开始校准之前，等待10分钟以使系统温度平衡。
   9. 在" 校准 "选项卡下，选择" 液相校准 "以执行液相校准。确认温度设置为37°C，搅拌速度为100，压力设置为大气压（101.32 kPa）。
   10. 按 确定 并等待信号稳定。
   11. 达到平台值时，按 OK。
   12. 通过加入少量（〜_20mg ）的连二亚硫酸钠在腔室中建立零O 2。
   13. 按 确定 并等待信号稳定。
   14. 达到平台值时，按 保存 接受校准。
2. TPP⁺选择性电极组件
   1. 使用提供的注射器和柔性针头用10 mM TPP溶液填充TPP ⁺-选择性电极头，注意避免气泡。
   2. 根据制造商的说明组装TPP⁺选择性电极装置，包括参比电极和电极支架（见 材料表）。
   3. 简单地拧松电极支架盖，然后将内部参比电极插入TPP⁺尖端。拧紧盖子以固定尖端。将提供的电缆连接到电极支架和控制盒的辅助端口。
   4. 将 TPP⁺ 选择性电极和参比电极插入适合的离子选择性电极的柱塞组件中。将参比电极连接到控制箱的参比端口。
   5. 将 TPP⁺ 选择性电极和参比电极插入适合的离子选择性电极的柱塞组件中。
3. 反应室制备
   1. 将反应混合物加入反应室:10mM琥珀酸酯（复合物II底物），5μM鱼藤酮（复合物I抑制剂），80ngmL-1尼日利亚霉素（使IMM上的pH梯度塌陷），2.5μgmL-1寡霉素（诱导4级呼吸）和呼吸缓冲液（RB）/ BSA反应缓冲液至最终体积为1mL。注意避免将气泡引入腔室。
   2. 使用经过调整的柱塞组件关闭腔室，并采用 TPP⁺ 选择性电极，并将参比电极就位。选择 GO 开始录制。一旦腔室关闭，使用用塑料管修饰的单独微量注射器将其他试剂直接引入反应溶液中，以调整针头长度。
4. TPP⁺ 校准
   1. 获得稳定的电压信号后，通过将0.1 mM TPP溶液的1 μM增量添加到3 μM的最终浓度来校准TPP ⁺选择性电极。观察到每次添加时，TPP⁺ 电压信号都会有对数下降。
      注意:在每个实验开始时校准TPP⁺选择性电极。
5. 数据采集
   1. 让O₂ 和TPP ⁺ 痕量稳定，并通过柱塞组件中的试剂加成端口将100μg新鲜制备的心肌细胞线粒体加入反应室至终浓度为^{0.1mg mL-1} 。观察当线粒体通电并消耗O₂ 时腔室中O₂ 水平的降低，以及当线粒体产生膜电位并从溶液中吸收TPP ⁺ 时TPP ⁺ 电压信号的突然增加。
   2. 加入2.5μgmL-1寡霉素诱导4状态呼吸。
      注意:O₂ 消耗率现在将表示质子泄漏呼吸的速率。寡霉素可以在TPP⁺ 之前加入反应室作为替代。
6. 评估 mPTP 的开放概率
   1. 观察ΔΨ在泄漏呼吸期间随时间下降。一旦达到所需的ΔΨ，向反应室中加入1μM CsA（mPTP抑制剂）以评估mPTP在该特定ΔΨ处的开放概率。
   2. 测量CsA对加入CsA之前和之后的O₂ 消耗和ΔΨ的影响
   3. 通过改变连续实验中加入CsA的ΔΨ来确定mPTP开路的电压依赖性。

结果

显示了这些实验中产生的典型O₂ 消耗和ΔΨ曲线（图1A，B）。TPP⁺ 校准时电压信号的对数下降显示在每个实验开始时。没有这种对数模式可能表明TPP⁺ 选择性电极存在问题。线粒体通常在加入呼吸缓冲液后立即产生ΔΨ。ΔΨ可以从基于能斯特方程（[线粒体基质内TPP⁺ 的对数比]到[外部TPP⁺ ]）的TPP⁺电压变化来解释为

讨论

本文介绍了一种评估mpTPP开放概率的方法。具体而言，通过评估CsA抑制对ΔΨs范围内质子泄漏的影响来确定低电导mPTP开路的电压阈值。使用这种技术，我们可以识别FXS小鼠和FVB对照之间mpTPP电压门控的差异，这与它们在组织特异性辅酶Q含量的差异一致。这种方法成功的关键是线粒体在使用前新鲜分离并且质量良好。在分离过程中受损或太老的线粒体将无法产生适当的ΔΨ，并且通常会解耦。请注意?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Fisher Scientific	15630080
Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1	PP systems	941039
BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft.	Fisher Scientific	14-170-11B	to modify the length of the hamilton synringe as needed
Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free	Sigma	A7030-10G
Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm	World Precision Inst. LLC	DRIREF-2
Electrode Holder for KWIK-Tips	World Precision Inst. LLC	KWIK-2	ion selective electrode holder
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid  (EGTA)	Sigma	324626
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME		FXS mice, Fmr1 KO
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME		FVB mice
Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk	Cole-Parmer	EW-07938-30	microsyringe
Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle	Cole-Parmer	EW-07938-02	microsyringe
Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete	PP systems	OXYTHERM+R	oxygen electrode and software
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma	1374248
Mannitol	Sigma	M9546-250G
P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A)	Sigma	D4022-10MG
Percoll	Sigma	P1644	medium for density gradient separation
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P3911
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	Sigma	5.43841
Sucrose	Sigma	S0389
TPP+ Electrode Tips (3)	World Precision Inst. LLC	TIPTPP