Beurteilung der offenen Wahrscheinlichkeit der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore im Setting des Coenzym-Q-Überschusses

Zusammenfassung

Diese Methode nutzt den Beitrag der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore zum Protonenleck mit niedriger Leitfähigkeit, um die Spannungsschwelle für die Porenöffnung bei neonatalen Fragile-X-Syndrom-Mäusen mit erhöhtem mitochondrialem Coenzym-Q-Gehalt im Vergleich zur Wildtypkontrolle zu bestimmen.

Zusammenfassung

Die mitochondriale Permeabilitätsübergangspore (mPTP) ist ein spannungsgesteuerter, nicht selektiver, innerer mitochondrialer Membran (IMM) Megakanal, der für Gesundheit und Krankheit wichtig ist. Das mPTP vermittelt das Austreten von Protonen über das IMM während der Öffnung mit niedriger Leitfähigkeit und wird spezifisch durch Cyclosporin A (CsA) gehemmt. Coenzym Q (CoQ) ist ein Regulator des mPTP, und gewebespezifische Unterschiede wurden im CoQ-Gehalt und in der offenen Wahrscheinlichkeit des mPTP in Vorderhirn- und Herzmitochondrien in einem neugeborenen Mausmodell des fragilen X-Syndroms (FXS, Fmr1-Knockout ) gefunden. Wir haben eine Technik entwickelt, um die Spannungsschwelle für die mPTP-Öffnung in diesem mutierten Stamm zu bestimmen, wobei wir die Rolle des mPTP als Protonenleckkanal ausnutzen.

Dazu wurden Sauerstoffverbrauch und Membranpotential (ΔΨ) gleichzeitig in isolierten Mitochondrien mittels Polarographie und einer Tetraphenylphosphonium (TPP⁺⁾ ionenselektiven Elektrode während der Leckatmung gemessen. Der Schwellenwert für die mPTP-Öffnung wurde durch den Beginn der CsA-vermittelten Hemmung des Protonenlecks bei spezifischen Membranpotentialen bestimmt. Mit diesem Ansatz wurden Unterschiede im Spannungs-Gating des mPTP im Kontext des CoQ-Exzesses genau definiert. Diese neuartige Technik wird zukünftige Untersuchungen ermöglichen, um das Verständnis der physiologischen und pathologischen Regulation der Öffnung des mPTP mit niedriger Leitfähigkeit zu verbessern.

Einleitung

Das mPTP vermittelt den Permeabilitätsübergang (PT), wobei das IMM abrupt durchlässig für kleine Moleküle und gelöste^{Stoffe 1,2} wird. Dieses auffällige Phänomen ist eine deutliche Abkehr von der charakteristischen Undurchlässigkeit des IMM, die für die Bestimmung des für die oxidative Phosphorylierung notwendigen elektrochemischen Gradienten von grundlegender Bedeutung ist³. PT ist im Gegensatz zu anderen mitochondrialen Transportmechanismen ein unspezifisches und nichtselektives Verfahren mit hoher Leitfähigkeit, das die Passage einer Reihe von Molekülen bis zu 1,5 kDa ^4,5 ermöglicht. Der mPTP ist ein spannungsgesteuerter Kanal innerhalb des IMM, dessen Öffnung ΔΨ, ATP-Produktion, Calciumhomöostase, Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und Zelllebensfähigkeit⁴ verändert.

Im pathologischen Extrem führt die unkontrollierte und verlängerte Öffnung von mPTP mit hoher Leitfähigkeit zum Kollaps des elektrochemischen Gradienten, zur Matrixschwellung, zum Abbau der Matrixpyridinnukleotide, zum äußeren Membranbruch, zur Freisetzung von Intermembranproteinen (einschließlich Cytochrom c) und schließlich zum Zelltod ^4,6. Eine solche pathologische mPTP-Öffnung wurde mit Herzischämie-Reperfusionsverletzung, Herzinsuffizienz, traumatischer Hirnverletzung, verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen und Diabetes ^1,7 in Verbindung gebracht. Die mPTP-Öffnung mit niedrigem Leitwert ist jedoch physiologischer Natur und führt im Gegensatz zur Öffnung mit hoher Leitfähigkeit nicht zu einer tiefgreifenden Depolarisation oder mitochondrialen Schwellung⁴.

Die geringe Leitfähigkeitsöffnung der Pore schränkt die Permeabilität auf ~ 300 Da ein, ermöglicht die Passage von Protonen unabhängig von der ATP-Synthese und ist eine potenzielle Quelle für physiologisches Protonenleck⁵. Die physiologische mPTP-Öffnung verursacht einen kontrollierten Rückgang von ΔΨ, erhöht den Elektronenfluss durch die Atemtransportkette und führt zu einem kurzen Ausbruch oder Blitz von Superoxid, was zur ROS-Signalgebung⁸ beiträgt. Die Regulation einer solchen vorübergehenden mPTP-Öffnung ist wichtig für die Calciumhomöostase und die normale Zellentwicklung und -reifung 4,9,10,11. Die vorübergehende Porenöffnung in sich entwickelnden Neuronen löst beispielsweise eine Differenzierung aus, während der Verschluss des mPTP die Reifung in unreifen Kardiomyozyten^{induziert 4,5}.

Obwohl die funktionelle Bedeutung des mPTP für Gesundheit und Krankheit gut etabliert ist, bleibt seine genaue molekulare Identität umstritten. Die Fortschritte bei der molekularen Struktur und Funktion des mPTP wurden an anderer Stelle^{umfassend überprüft 12}. Kurz gesagt, derzeit wurde angenommen, dass Hoch- und Niedrigleitfähigkeitszustände des mPTP durch verschiedene Entitäten^{vermittelt werden sollen 12}. Die führenden Kandidaten sind die F1/F0-ATP-Synthase (ATP-Synthase) und der Adenin-Nukleotidtransporter (ANT) für Hoch- bzw. Low-Conductance-Modi¹².

Trotz des fehlenden Konsenses über die genaue Identität der porenbildenden Komponente des mPTP wurden bestimmte Schlüsselmerkmale detailliert beschrieben. Ein etabliertes Merkmal des mPTP ist, dass es durch den elektrochemischen Gradienten so reguliert wird, dass die Depolarisation des IMM zur Porenöffnung¹³ führt. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass der Redoxzustand von vizinalen Thiolgruppen das Spannungsgating des mPTP so verändert, dass die Oxidation die Pore bei relativ höheren ΔΨs öffnet und die Reduktion der Thiolgruppe zu einer geschlossenen mPTP-Wahrscheinlichkeit^{von 14} führt. Die Identität des proteinhaltigen Spannungssensors ist jedoch unbekannt.

Verschiedene kleine Moleküle, die die offene Wahrscheinlichkeit der Pore modulieren, wurden identifiziert. Zum Beispiel kann das mPTP stimuliert werden, sich mit Kalzium, anorganischem Phosphat, Fettsäuren und ROS zu öffnen und kann durch Adeninnukleotide (insbesondere ADP), Magnesium, Protonen und CsA ^5,12 gehemmt werden. Die Wirkmechanismen einiger dieser Regulierungsbehörden wurden aufgeklärt. Mitochondriales Calcium löst die mPTP-Öffnung zumindest teilweise aus, indem es an die β-Untereinheit der^{ATP-Synthase 15} bindet. ROS kann das mPTP aktivieren, indem es seine Affinität für ADP verringert und seine Affinität für Cyclophilin D (CypD), den am besten untersuchten proteinhaltigen mPTP-Aktivator¹⁶, erhöht. Der Mechanismus der Aktivierung des mPTP durch anorganisches Phosphat und Fettsäuren ist weniger klar. Bei endogenen Inhibitoren wird angenommen, dass ADP das mPTP durch Bindung an die ANT- oder ATP-Synthase hemmt, während Magnesium seine hemmende Wirkung ausübt, indem es Kalzium von seiner Bindungsstelle verdrängt^15,17,18,19.

Ein niedriger pH-Wert hemmt die mPTP-Öffnung durch Protonierung von Histidin 112 der regulatorischen OSCP-Untereinheit (^Oligomycin Sensitivity-Conferring Protein) der ATP-Synthase 12,20,21. Der prototypische pharmakologische Inhibitor des mPTP, CsA, wirkt, indem er CypD bindet und seine Assoziation mit OSCP^22,23 verhindert. Frühere Arbeiten haben auch gezeigt, dass eine Vielzahl von CoQ-Analoga mit dem mPTP interagieren, es hemmen oder aktivieren²⁴. In neueren Arbeiten fanden wir Hinweise auf ein pathologisch offenes mPTP, ein übermäßiges Protonenleck und eine ineffiziente oxidative Phosphorylierung aufgrund eines CoQ-Mangels in den Mitochondrien des Vorderhirns von neugeborenen FXS-Mauswelpen²⁵.

Der Verschluss der Pore mit exogenem CoQ blockierte das pathologische Protonenleck und induzierte die morphologische Reife der dendritischen Stacheln²⁵. Interessanterweise wiesen FXS-Kardiomyozyten bei denselben Tieren im Vergleich zu Wildtypkontrollen übermäßige CoQ-Spiegel und eine geschlossene mPTP-Wahrscheinlichkeit auf²⁶. Obwohl die Ursache für diese gewebespezifischen Unterschiede in den CoQ-Spiegeln unbekannt ist, unterstreichen die Ergebnisse das Konzept, dass endogenes CoQ wahrscheinlich ein Schlüsselregulator des mPTP ist. Es gibt jedoch eine große Lücke in unserem Wissen, da der Mechanismus der CoQ-vermittelten Hemmung des mPTP unbekannt bleibt.

Die Regulation des mPTP ist eine kritische Determinante der Zellsignalisierung und des Überlebens⁴. Daher ist der Nachweis der mPTP-Öffnung in den Mitochondrien der Schlüssel zur Berücksichtigung spezifischer pathophysiologischer Mechanismen. Typischerweise wird der Schwellenwert für die Porenöffnung mit hoher Leitfähigkeit unter Verwendung von Kalzium bestimmt, um den Permeabilitätsübergang auszulösen. Eine solche Kalziumbelastung führt zum Kollaps des Membranpotentials, zur schnellen Entkopplung der oxidativen Phosphorylierung und zur mitochondrialen Schwellung^27,28. Wir haben versucht, eine Methode zu entwickeln, um die mPTP-Öffnung mit niedrigem Leitwert in situ nachzuweisen, ohne sie per se zu induzieren.

Der Ansatz nutzt die Rolle des mPTP als Protonenleckkanal aus. Zu diesem Zweck wurden Ionenselektivelektroden vom Clark-Typ und TPP⁺ verwendet, um gleichzeitig den Sauerstoffverbrauch bzw. das Membranpotential in isolierten Mitochondrien während der Leckatmung zu messen²⁹. Der Schwellenwert für die mPTP-Öffnung wurde durch den Beginn der CsA-vermittelten Hemmung des Protonenlecks bei spezifischen Membranpotentialen bestimmt. Mit diesem Ansatz wurden Unterschiede im Spannungs-Gating des mPTP im Kontext des CoQ-Überschusses genau definiert.

Protokoll

Das Institutional Animal Care and Use Committee des Columbia University Medical Center erhielt die Zulassung für alle beschriebenen Methoden. FXS (Fmr1 KO) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyr c-ch Fmr1 ^tm1Cgr/J) und Kontrollmäuse (FVB) (FVB.129P2-Pde6b⁺ Tyr^c-ch/AntJ), die als Modellsysteme für diese Studie verwendet wurden, wurden kommerziell erworben (siehe Materialtabelle). In jeder Versuchsgruppe wurden fünf bis elf Tiere eingesetzt. Postnatale Tag 10 (P10) Mäuse wurden verwendet, um für einen Zeitpunkt in der menschlichen Kindheit zu modellieren.

1. Mitochondriale Isolierung vom Mausherzen

1. Bereiten Sie Puffer für mitochondriale Isolierungs- und Atmungsexperimente vor, wie in Tabelle 1 beschrieben. Bei 4 °C lagern, wenn dies im Voraus erfolgt.
   1. Bereiten Sie ein Dichtegradientenmedium mit 15 % vor: Verdünnen Sie das handelsübliche Dichtegradientenmedium auf 80 % Volumen/Volumen (v/v) mit einem Dichtegradientenverdünnungsmittel. Weiter verdünnen Sie 80% Dichtegradient medium 15% v/v durch Zugabe von mitochondrialem Isolationspuffer (MI)/Rinderserumalbumin (BSA).
2. Isolieren Sie Mitochondrien aus frischem, nicht gefrorenem Gewebe für diese Experimente und verwenden Sie es am Tag der Vorbereitung, typischerweise innerhalb von fünf Stunden²⁶. Führen Sie alle Isolationsschritte auf Eis durch.
   1. Enthaupten Sie die Maus und entfernen Sie das Herz. Sofort 1-2 mal in einer Petrischale mit eiskaltem MI/BSA waschen. Schneiden Sie den Vorhof ab und zerkleinern Sie das Gewebe.
   2. Überführen Sie das gehackte Herzgewebe in einen Glas-Glas-Homogenisator, der 1 ml MI/BSA enthält. Homogenisieren Sie mit einem lockereren (A) Stößel (10 Schläge), dann mit einem engeren (B) Stößel (10 Schläge).
   3. Zentrifen Sie das Homogenat bei 1.100 × g für 2 min bei 4 °C, um nukleare und zelluläre Ablagerungen zu entfernen.
   4. Nehmen Sie den Überstand vorsichtig, ohne ein flauschiges Pellet zu berühren, und schichten Sie ihn vorsichtig auf 700 μL 15% Dichtegradientenmedium in einem Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 18.500 × g für 15 min bei 4 °C.
   5. Resuspendiert das Pellet in 1 ml Saccharosepuffer (SB)/BSA und zentrifugiert bei 10.000 × g für 10 min bei 4 °C.
   6. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand vollständig. Resuspendiert das Pellet in SB/BSA auf ein Endvolumen von 55 μL.
   7. Quantifizieren Sie den mitochondrialen Proteingehalt mit einem Standardassay wie dem Bicinchoninsäure (BCA) Protein-Assay.

2. Mitochondrialer Sauerstoffverbrauch (_O2) und ΔΨ

1. Montage und Kalibrierung von Sauerstoffelektroden
   1. Richten Sie die Sauerstoffelektrode (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers ein und kalibrieren Sie sie.
      1. Geben Sie einen Tropfen 50% Kaliumchlorid (KCl) -Elektrolytlösung auf die Kuppel der Elektrodenscheibe.
      2. Legen Sie ein kleines Stück ~ 2 cm² Zigarettenpapier Abstandshalter, der mit einem etwas größeren Stück der mitgelieferten Polytetrafluorethylen (PTFE) -Membran bedeckt ist, über den Elektrolyttropfen.
      3. Schieben Sie mit dem mitgelieferten Applikatorwerkzeug den O-Ring der kleinen Elektrodenscheibe über die Kuppel der Elektrode.
         HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind und dass die Membran glatt ist.
   2. Füllen Sie das Reservoir gut mit der Elektrolytlösung auf.
   3. Platzieren Sie den größeren O-Ring in der Aussparung um die Elektrodenscheibe.
   4. Installieren Sie die Disc in der Elektrodenkammer und schließen Sie sie an die Steuereinheit an.
   5. Geben Sie 2 ml luftgesättigtes deionisiertes Wasser in die Reaktionskammer und den PTFE-beschichteten Magneten in die Kammer.
   6. Verbinden Sie die Kammer mit der Rückseite der Steuereinheit.
   7. Stellen Sie die Temperatur auf 37 °C und die Rührgeschwindigkeit auf 100 ein.
   8. Es kann 10 Minuten dauern, bis sich die Systemtemperatur ausgleicht, bevor mit der Kalibrierung begonnen wird.
   9. Wählen Sie auf der Registerkarte Kalibrierung die Option Flüssigphasenkalibrierung aus, um eine Flüssigphasenkalibrierung durchzuführen. Vergewissern Sie sich, dass die Temperatur auf 37 °C, die Rührgeschwindigkeit 100 und der Druck auf den atmosphärischen Druck (101,32 kPa) eingestellt ist.
   10. Drücken Sie OK und warten Sie , bis das Signal ein Plateau erreicht hat.
   11. Wenn ein Plateau erreicht ist, drücken Sie OK.
   12. Etablieren Sie Null O2 in der Kammer, indem Sie eine kleine Menge (~ 20 mg)_{Natriumdithionit} hinzufügen.
   13. Drücken Sie OK und warten Sie , bis das Signal ein Plateau erreicht hat.
   14. Wenn ein Plateau erreicht ist, drücken Sie Speichern , um die Kalibrierung zu akzeptieren.
2. TPP⁺-selektive Elektrodenmontage
   1. Füllen Sie die TPP⁺- selektive Elektrodenspitze mit 10 mM TPP-Lösung unter Verwendung der mitgelieferten Spritze und flexiblen Nadel und achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden.
   2. Montieren Sie die TPP⁺-selektive Elektrodenvorrichtung einschließlich der Referenzelektrode und des Elektrodenhalters (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   3. Lösen Sie kurz die Elektrodenhalterkappe und setzen Sie die interne Referenzelektrode in die TPP^+-Spitze ein. Ziehen Sie die Kappe fest, um die Spitze zu sichern. Schließen Sie das mitgelieferte Kabel an den Elektrodenhalter und den Hilfsanschluss der Steuerbox an.
   4. Setzen Sie die TPP⁺-selektive Elektrode und Referenzelektroden in die angepasste Kolbenbaugruppe für ionenselektive Elektroden ein. Schließen Sie die Referenzelektrode an den Referenzport der Steuerbox an.
   5. Setzen Sie die TPP⁺-selektiven und Referenzelektroden in die angepasste Kolbenbaugruppe für ionenselektive Elektroden ein.
3. Vorbereitung der Reaktionskammer
   1. Geben Sie das Reaktionsgemisch in die Reaktionskammer: 10 mM Succinat (Komplex-II-Substrat), 5 μM Rotenon (Komplex-I-Hemmer), 80 ng ml⁻¹ Nigericin (um den pH-Gradienten über IMM zu kollabieren), 2,5 μg mL-1 Oligomycin (um die Atmung im Zustand 4 zu induzieren) und den Atmungspuffer (RB) / ^{BSA-Reaktionspuffer} zu einem Endvolumen von 1 ml. Achten Sie darauf, dass keine Luftblasen in die Kammer gelangen.
   2. Schließen Sie die Kammer mit der angepassten Kolbenbaugruppe mit der TPP⁺-selektiven und der Referenzelektrode an Ort und Stelle. Wählen Sie GO aus, um die Aufnahme zu starten. Sobald die Kammer geschlossen ist, führen Sie zusätzliche Reagenzien direkt in die Reaktionslösung ein, indem Sie separate Mikrospritzen verwenden, die mit Kunststoffschläuchen modifiziert wurden, um die Nadellänge einzustellen.
4. TPP⁺ Kalibrierung
   1. Sobald ein stabiles Spannungssignal erhalten wurde, kalibrieren Sie die TPP⁺-selektive Elektrode, indem Sie 1 μM-Schritte einer 0,1 mM TPP-Lösung zu einer Endkonzentration von 3 μM hinzufügen. Beachten Sie, dass das TPP⁺ -Spannungssignal mit jedem Zusatz logarithmisch abnimmt.
      HINWEIS: Kalibrieren Sie die TPP⁺-selektive Elektrode zu Beginn jedes Experiments.
5. Datenerfassung
   1. Lassen Sie die_O2- und TPP⁺-Spuren stabilisieren und fügen Sie 100 μg frisch zubereitete Kardiomyozytenmitochondrien in die Reaktionskammer zu einer Endkonzentration von 0,1 mg ^ml-1 über den Reagenzzugabeanschluss in der Kolbenbaugruppe hinzu. Beobachten Sie die Abnahme der O2-Spiegel in der Kammer, wenn die Mitochondrien unter Strom gesetzt werden und_{O2 verbrauchen}, und den abrupten Anstieg des TPP^+-Spannungssignals, wenn die Mitochondrien ein Membranpotential erzeugen und TPP⁺ aus der Lösung aufnehmen.
   2. Fügen Sie 2,5 μg ^mL-1 Oligomycin hinzu, um die Atmung des Zustands 4 zu induzieren.
      HINWEIS: Die_{O2-Verbrauchsraten} stellen nun die Rate der Protonenleckatmung dar. ^Oligomycin kann alternativ vor TPP+ in die Reaktionskammer gegeben werden.
6. Beurteilung der offenen Wahrscheinlichkeit des mPTP
   1. Beachten Sie, dass ΔΨ im Laufe der Zeit während der Leckatmung abnimmt. Sobald das gewünschte ΔΨ erreicht ist, fügen Sie 1 μM CsA (mPTP-Inhibitor) in die Reaktionskammer hinzu, um die offene Wahrscheinlichkeit des mPTP bei diesem spezifischen ΔΨ zu bewerten.
   2. Messung der Wirkung von CsA auf den_O2-Verbrauch und ΔΨ vor und nach der CsA-Addition
   3. Bestimmen Sie die Spannungsabhängigkeit der mPTP-Öffnung, indem Sie die ΔΨ variieren, bei der CsA in aufeinanderfolgenden Experimenten hinzugefügt wird.

Ergebnisse

Typische_{O2-Verbrauchs}- und ΔΨ-Kurven, die in diesen Experimenten erzeugt wurden, sind dargestellt (Abbildung 1A,B). Der logarithmische Rückgang des Spannungssignals mit TPP^+-Kalibrierung wird zu Beginn jedes Experiments angezeigt. Das Fehlen dieses logarithmischen Musters kann auf ein Problem mit der selektiven TPP⁺-Elektrode hindeuten. Mitochondrien erzeugen typischerweise ΔΨ unmittelbar nach Zugabe zum Atmungspuffer. ΔΨ kann aus Änd...

Diskussion

Dieses Papier beschreibt eine Methode zur Beurteilung der offenen Wahrscheinlichkeit des mPTP. Insbesondere wurde die Spannungsschwelle für die mPTP-Öffnung mit niedriger Leitfähigkeit bestimmt, indem die Wirkung der CsA-Hemmung auf das Protonenleck über einen Bereich von ΔΨs bewertet wurde. Mit dieser Technik konnten wir Unterschiede im Spannungs-Gating des mPTP zwischen FXS-Mäusen und FVB-Kontrollen identifizieren, die mit ihren Unterschieden im gewebespezifischen CoQ-Gehalt übereinstimmen. Entscheidend für de...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Fisher Scientific	15630080
Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1	PP systems	941039
BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft.	Fisher Scientific	14-170-11B	to modify the length of the hamilton synringe as needed
Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free	Sigma	A7030-10G
Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm	World Precision Inst. LLC	DRIREF-2
Electrode Holder for KWIK-Tips	World Precision Inst. LLC	KWIK-2	ion selective electrode holder
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid  (EGTA)	Sigma	324626
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME		FXS mice, Fmr1 KO
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME		FVB mice
Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk	Cole-Parmer	EW-07938-30	microsyringe
Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle	Cole-Parmer	EW-07938-02	microsyringe
Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete	PP systems	OXYTHERM+R	oxygen electrode and software
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma	1374248
Mannitol	Sigma	M9546-250G
P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A)	Sigma	D4022-10MG
Percoll	Sigma	P1644	medium for density gradient separation
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P3911
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	Sigma	5.43841
Sucrose	Sigma	S0389
TPP+ Electrode Tips (3)	World Precision Inst. LLC	TIPTPP