Avaliação da Probabilidade Aberta do Poro de Transição de Permeabilidade Mitocondrial na Configuração do Coenzyme Q Excesso

Resumo

Este método explora a contribuição do poro de transição de permeabilidade mitocondrial para o vazamento de prótons de baixa condução para determinar o limiar de tensão para abertura de poros em camundongos neonatais frágeis da síndrome X com aumento do teor de coenzyme mitocondrial de cardiomiocrata Q em comparação com o controle do tipo selvagem.

Resumo

O pore de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP) é um megacancanal de membrana mitocondrial interna (IMM) de tensão. O mPTP media o vazamento de prótons em todo o IMM durante a abertura de baixa condutância e é especificamente inibido pela ciclosporina A (CsA). Coenzyme Q (CoQ) é um regulador do mPTP, e diferenças específicas de tecido foram encontradas no conteúdo coq e probabilidade aberta do mPTP no cérebro e mitocôndrias cardíacas em um modelo de rato recém-nascido de síndrome X frágil (FXS, Fmr1 nocaute). Desenvolvemos uma técnica para determinar o limiar de tensão para abertura de mPTP nesta cepa mutante, explorando o papel do mPTP como um canal de vazamento de prótons.

Para isso, o consumo de oxigênio e o potencial de membrana (ΔΦ) foram medidos simultaneamente em mitocôndrias isoladas usando polarografia e um eletrodo seletivo de íons (TPP⁺) durante a respiração do vazamento. O limiar para abertura de MPTP foi determinado pelo início da inibição mediada por CsA do vazamento de prótons em potenciais específicos da membrana. Utilizando essa abordagem, as diferenças na tensão do mPTP foram precisamente definidas no contexto do excesso de CoQ. Esta nova técnica permitirá futura investigação para aprimorar a compreensão da regulação fisiológica e patológica da abertura de baixa condutura do MPTP.

Introdução

O mPTP media a transição de permeabilidade (PT), pela qual o IMM torna-se abruptamente permeável para pequenas moléculas e solutos ^1,2. Este fenômeno marcante é uma partida distinta da impermeabilidade característica do IMM, que é fundamental para o estabelecimento do gradiente eletroquímico necessário para a fosforilação oxidativa³. Pt, ao contrário de outros mecanismos de transporte mitocondrial, é um processo de alta condução, não específico e não seletivo, permitindo a passagem de uma gama de moléculas de até 1,5 kDa ^4,5. O mPTP é um canal fechado de tensão dentro do IMM cuja abertura altera ΔΦ, produção de ATP, homeostase de cálcio, produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e viabilidade celular⁴.

No extremo patológico, a abertura de alta condutância patológica e prolongada de mPTP leva ao colapso do gradiente eletroquímico, inchaço matricial, esgotamento de nucleotídeos matriciais de piridina, ruptura da membrana externa, liberação de proteínas intermembranas (incluindo citocromo c), e, finalmente, morte celular ^4,6. Essa abertura patológica de MPTP foi implicada em lesão de isquemia cardíaca- reperfusão, insuficiência cardíaca, lesão cerebral traumática, várias doenças neurodegenerativas e diabetes ^1,7. No entanto, a abertura de MPTP de baixa condução é de natureza fisiológica e, ao contrário da abertura de alta condução, não leva a uma profunda despolarização ou inchaço mitocondrial⁴.

A abertura de baixa condução do poro restringe a permeabilidade a ~300 Da, permite a passagem de prótons independentes da síntese de ATP, e é uma fonte potencial de vazamento fisiológico de^{prótons 5}. A abertura fisiológica de MPTP causa um declínio controlado em ΔΦ, aumenta o fluxo de elétrons através da cadeia de transporte respiratório, e resulta em uma pequena explosão ou flash de superóxido, contribuindo para a sinalização ROS⁸. A regulação dessa abertura transitória de MPTP é importante para a homeostase de cálcio e desenvolvimento celular normal e maturação^de 4,9,10,11. A abertura transitória de poros no desenvolvimento de neurônios, por exemplo, desencadeia diferenciação, enquanto o fechamento do mPTP induz o amadurecimento em cardiomiócitos imaturos ^4,5.

Embora a significância funcional do PMP em saúde e doença seja bem estabelecida, sua identidade molecular precisa permanece debatida. O progresso na estrutura molecular e na função do MPTP foi amplamente revisto em outros lugares¹². Resumidamente, atualmente, os estados de alta e baixa condução do MPTP têm sido considerados mediados por entidades distintas¹². Os principais candidatos são o ATP de F1/F0 synthase (ATP synthase) e o transporte de nucleotídeos de adenina (ANT) para modos de alta e baixa condução, respectivamente¹².

Apesar da falta de consenso quanto à identidade exata do componente formador de poros do MPTP, algumas características-chave foram detalhadas. Uma característica bem estabelecida do mPTP é que ele é regulado pelo gradiente eletroquímico de tal forma que a despolarização do IMM leva à abertura de poros¹³. Trabalhos anteriores mostraram que o estado redox dos grupos de thiol vicinal altera a tensão do mPTP, de tal forma que a oxidação abre o poro em ΔΦs relativamente maior, e a redução do grupo thiol resulta na probabilidade de mPTP¹⁴. No entanto, a identidade do sensor de tensão proteinácea é desconhecida.

Várias pequenas moléculas que modulam a probabilidade aberta do poro foram identificadas. Por exemplo, o mPTP pode ser estimulado a abrir com cálcio, fosfato inorgânico, ácidos graxos e ROS e pode ser inibido por nucleotídeos de adenina (particularmente ADP), magnésio, prótons e CsA ^5,12. Os mecanismos de ação de alguns desses reguladores foram elucidados. O cálcio mitocondrial desencadeia a abertura do MPTP pelo menos em parte, vinculando-se à subunidade β do ATP synthase¹⁵. A ROS pode ativar o mPTP diminuindo sua afinidade com a ADP e aumentando sua afinidade com a ciclofilina D (CypD), o ativador mPTP proteináceo mais bem estudado¹⁶. O mecanismo de ativação do mPTP por fosfato inorgânico e ácidos graxos é menos claro. Quanto aos inibidores endógenos, acredita-se que a ADP iniba o mPTP por vinculação na ant ou atp synthase, enquanto o magnésio exerce seu efeito inibidor deslocando o cálcio de seu local de ligação 15,17,18,19.

O pH baixo inibe a abertura de mPTP protonando histidina 112 da subunidade de proteína de sensibilidade à oligomicina regulatória (OSCP) da ATP synthase 12,20,21. O prototípico inibidor farmacológico do mPTP, CsA, atua por vinculação de CypD e impedindo sua associação com a OSCP^22,23. Trabalhos anteriores também mostraram que uma variedade de análogos de CoQ interagem com o mPTP, inibindo-o ou ativando-o²⁴. Em trabalhos recentes, encontramos evidências de um mPTP patologicamente aberto, vazamento excessivo de prótons e fosforilação oxidativa ineficiente devido a uma deficiência de CoQ em mitocôndrias de cérebros de filhotes de camundongos FXS recém-nascidos²⁵.

O fechamento do poro com CoQ exógeno bloqueou o vazamento patológico de prótons e induziu a maturidade morfológica das espinhas dendríticas²⁵. Curiosamente, nos mesmos animais, os cardiomiócitos FXS apresentaram níveis excessivos de CoQ e probabilidade de MPTP fechado em comparação com os controles do tipo selvagem²⁶. Embora a causa dessas diferenças específicas do tecido nos níveis de CoQ seja desconhecida, os achados ressaltam o conceito de que o CoQ endógeno é provavelmente um regulador-chave do mPTP. No entanto, há uma grande lacuna em nosso conhecimento porque o mecanismo de inibição mediada pelo CoQ do MPTP permanece desconhecido.

A regulação do MPTP é um determinante crítico da sinalização celular e sobrevivência⁴. Assim, detectar a abertura de MPTP dentro das mitocôndrias é fundamental quando se considera mecanismos fisiodicos específicos. Normalmente, o limiar para abertura de poros de alta condução é determinado usando cálcio para desencadear a transição de permeabilidade. Esse carregamento de cálcio leva ao colapso do potencial da membrana, ao desacoplamento rápido da fosforilação oxidativa e ao inchaço mitocondrial^27,28. Buscamos desenvolver um método para detectar abertura de MPTP de baixa condução in situ, sem induzi-la por si só.

A abordagem explora o papel do mPTP como um canal de vazamento de prótons. Para isso, foram empregados eletrodos seletivos Clark-Type e TPP⁺ para medir simultaneamente o consumo de oxigênio e o potencial da membrana, respectivamente, em mitocôndrias isoladas durante a respiração^{do vazamento 29}. O limiar para abertura de MPTP foi determinado pelo início da inibição mediada por CsA do vazamento de prótons em potenciais específicos da membrana. Utilizando essa abordagem, foram precisamente definidas as diferenças de tensão do mPTP no contexto do excesso de CoQ.

Protocolo

A aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro Médico da Universidade de Columbia foi obtida para todos os métodos descritos. FXS (Fmr1 KO) (FVB.129P2-Pde6b⁺ Tyr^c-ch Fmr1^tm1Cgr/J) e controle (FVB.129P2-Pde6b⁺ Tyr^c-ch/AntJ) foram adquiridos comercialmente (ver a Tabela dos Materiais). Cinco a onze animais foram utilizados em cada grupo experimental. Ratos pós-natal 10 (P10) foram usados para modelar por um ponto de tempo na infância humana.

1. Isolamento mitocondrial do coração do rato

1. Prepare buffers para experimentos de isolamento mitocondrial e respiração, conforme descrito na Tabela 1. Armazene a 4 °C se for feita com antecedência.
   1. Prepare 15% de gradiente de densidade: diluir o gradiente de densidade comercial médio a 80% de volume/volume (v/v) com diluente gradiente de densidade. Diluir ainda mais 80% de gradiente de densidade médio 15% v/v adicionando tampão de isolamento mitocondrial (MI)/albumina de soro bovino (BSA).
2. Isole mitocôndrias de tecido fresco, não congelado para esses experimentos e use no dia da preparação, normalmente dentro de cinco horas²⁶. Realize todos os passos de isolamento no gelo.
   1. Decapite o rato e extiria o coração. Lave imediatamente 1-2 vezes em uma placa de Petri com MI/BSA gelada. Corte o átrio e pique o tecido.
   2. Transfira o tecido cardíaco picado para um homogeneizador de vidro contendo 1 mL de MI/BSA. Homogeneize com um pilão (A) mais solto (10 traçados), depois um pilão (B) mais apertado (10 traçados).
   3. Centrifugar a homogeneidade a 1.100 × g por 2 min a 4 °C para remover detritos nucleares e celulares.
   4. Pegue o supernatante suavemente sem tocar em nenhuma pelota macia, e cuidadosamente coloque-o em cima de 700 μL de 15% de gradiente de densidade em um tubo de centrífuga. Centrifugar a 18.500 × g para 15 min a 4 °C.
   5. Resuspenha a pelota em 1 mL de tampão de sacarose (SB)/BSA e centrifugado a 10.000 × g por 10 min a 4 °C.
   6. Remova e descarte completamente o supernatante. Resuspenha a pelota em SB/BSA para um volume final de 55 μL.
   7. Quantifique o teor de proteína mitocondrial usando um ensaio padrão, como o ensaio proteico bicinchonínico (BCA).

2. Consumo de oxigênio mitocondrial (O₂) e ΔΦ

1. Montagem e calibração do eletrodo de oxigênio
   1. Configure e calibrar o eletrodo de oxigênio (veja a Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
      1. Coloque uma queda de 50% da solução de cloreto de potássio (KCl) em cima da cúpula do disco de eletrodo.
      2. Coloque um pequeno pedaço ~2 cm² espaçador de papel de cigarro coberto com um pedaço ligeiramente maior da membrana de politetrafluoroetileno (PTFE) fornecida sobre a gota de eletrólito.
      3. Usando a ferramenta aplicadora fornecida, empurre o pequeno disco de eletrodo O-ring sobre a cúpula do eletrodo.
         NOTA: Certifique-se de que não há bolhas de ar e que a membrana é lisa.
   2. Cubra bem o reservatório com a solução de eletrólitos.
   3. Coloque bem o o-ring maior no recreio ao redor do disco de eletrodos.
   4. Instale o disco na câmara de eletrodos e conecte-o à unidade de controle.
   5. Adicione 2 mL de água desomada de ar à câmara de reação e ao ímã revestido de PTFE à câmara.
   6. Conecte a câmara à parte traseira da unidade de controle.
   7. Coloque a temperatura em 37 °C e a velocidade de agitação para 100.
   8. Deixe 10 min para que a temperatura do sistema se equilibre antes de iniciar a calibração.
   9. Na guia Calibração , selecione Calibração de fase líquida para realizar a calibração da fase líquida. Confirme se a temperatura está definida para 37 °C , a velocidade de agitação é de 100, e a pressão é definida para pressão atmosférica (101,32 kPa).
   10. Pressione OK e espere o sinal para planar.
   11. Quando um planalto é alcançado, pressione OK.
   12. Estabeleça zero O₂ na câmara adicionando uma pequena quantidade (~20 mg) de dithionite de sódio.
   13. Pressione OK e espere o sinal para planar.
   14. Quando um platô é atingido, pressione Salvar para aceitar a calibração.
2. Conjunto de eletrodos TPP⁺-seletivo
   1. Encha a ponta de eletrodo seletivo TPP⁺- com solução TPP de 10 mM utilizando a seringa fornecida e agulha flexível, tomando cuidado para evitar bolhas de ar.
   2. Monte o aparelho de eletrodo TPP⁺-seletivo, incluindo o eletrodo de referência e o suporte de eletrodos, (ver Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
   3. Brevemente, solte a tampa do suporte do eletrodo e insira o eletrodo de referência interna na ponta TPP⁺. Aperte a tampa para fixar a ponta. Conecte o cabo fornecido ao suporte do eletrodo e à porta auxiliar da caixa de controle.
   4. Insira o eletrodo seletivo TPP⁺e os eletrodos de referência no conjunto adaptado do êmbolo para eletrodos seletivos de íons. Conecte o eletrodo de referência à porta de referência da caixa de controle.
   5. Insira os eletrodos de abseleição e referência TPP⁺no conjunto adaptado do êmbolo para eletrodos seletivos de íons.
3. Preparação da câmara de reação
   1. Adicione a mistura de reação à câmara de reação: 10 mM de succinato (substrato complexo II), rotenona de 5 μM (inibidor complexo I), 80 ng mL⁻¹ nigericin (para colapsar pH gradiente em IMM), 2,5 μg ^mL-1 oligomicina (para induzir a respiração do estado 4) e tampão de reação de respiração (RB)/BSA tampão de reação a um volume final de 1 mL. Tome cuidado para evitar a introdução de bolhas de ar na câmara.
   2. Feche a câmara com o conjunto de êmbolo adaptado com o TPP⁺-seletivo e o eletrodo de referência no lugar. Selecione GO para começar a gravar. Uma vez que a câmara esteja fechada, introduza reagentes adicionais diretamente na solução de reação usando microsiringes separados modificados com tubos plásticos para ajustar o comprimento da agulha.
4. Calibração TPP⁺
   1. Uma vez obtido um sinal de tensão estável, calibrar o eletrodo TPP⁺-seletivo adicionando incrementos de 1 μM de uma solução TPP de 0,1 mM a uma concentração final de 3 μM. Observe que há um declínio logarítmico no sinal de tensão TPP⁺ a cada adição.
      NOTA: Calibrar o eletrodo TPP⁺-seletivo no início de cada experimento.
5. Aquisição de dados
   1. Permita que os traços O₂ e TPP⁺ se estabilizem e adicione 100 μg de mitocôndrias de cardiomiocócito recém-preparadas à câmara de reação a uma concentração final de 0,1 mg ^mL-1 através da porta de adição de reagente no conjunto do êmbolo. Observe a diminuição dos níveis de O₂ na câmara à medida que as mitocôndrias se energizam e consomem O₂ e o aumento abrupto do sinal de tensão TPP⁺ à medida que as mitocôndrias geram um potencial de membrana e tomam TPP⁺ da solução.
   2. Adicione 2,5 μg ^mL-1 oligomicina para induzir a respiração do estado 4.
      NOTA: As taxas de consumo O₂ agora representarão a taxa de respiração de vazamento de prótons. A oligomicina pode ser adicionada à câmara de reação antes do TPP⁺ como alternativa.
6. Avaliando a probabilidade aberta do mPTP
   1. Observe que ΔΦ declina ao longo do tempo durante a respiração do vazamento. Uma vez alcançado o ΔΦ desejado, adicione 1 μM CsA (inibidor de mPTP) à câmara de reação para avaliar a probabilidade aberta do mPTP naquele ΔΦ específico.
   2. Meça o efeito do CsA no consumo de O₂ e ΔΦ antes e depois da adição de CsA
   3. Determine a dependência de tensão da abertura de mPTP variando o ΔΦ no qual csA é adicionado em experimentos sucessivos.

Resultados

São mostradas as curvas típicas de consumo O₂ e ΔΦ geradas nesses experimentos (Figura 1A,B). O declínio logarítmico no sinal de tensão com calibração TPP⁺ é mostrado no início de cada experimento. A ausência deste padrão logarítmico pode sugerir um problema com o eletrodo seletivo TPP⁺. Mitocôndrias normalmente geram ΔΦ imediatamente após a adição ao tampão respiratório. ΔΦ pode ser interpretado a partir de alteraçõ...

Discussão

Este artigo descreve um método para avaliar a probabilidade aberta do mPTP. Especificamente, o limiar de tensão para abertura de mPTP de baixa condução foi determinado pela avaliação do efeito da inibição de CsA no vazamento de prótons sobre uma gama de ΔΦs. Usando esta técnica, pudemos identificar diferenças na tensão do mPTP entre camundongos FXS e controles FVB consistentes com suas diferenças no conteúdo coQ específico do tecido. Fundamental para o sucesso dessa metodologia é que as mitocôndrias s?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Fisher Scientific	15630080
Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1	PP systems	941039
BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft.	Fisher Scientific	14-170-11B	to modify the length of the hamilton synringe as needed
Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free	Sigma	A7030-10G
Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm	World Precision Inst. LLC	DRIREF-2
Electrode Holder for KWIK-Tips	World Precision Inst. LLC	KWIK-2	ion selective electrode holder
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid  (EGTA)	Sigma	324626
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME		FXS mice, Fmr1 KO
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME		FVB mice
Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk	Cole-Parmer	EW-07938-30	microsyringe
Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle	Cole-Parmer	EW-07938-02	microsyringe
Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete	PP systems	OXYTHERM+R	oxygen electrode and software
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma	1374248
Mannitol	Sigma	M9546-250G
P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A)	Sigma	D4022-10MG
Percoll	Sigma	P1644	medium for density gradient separation
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P3911
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	Sigma	5.43841
Sucrose	Sigma	S0389
TPP+ Electrode Tips (3)	World Precision Inst. LLC	TIPTPP