Valutazione della probabilità aperta del poro di transizione della permeabilità mitocondriale nel setting dell'eccesso di coenzima Q

Riepilogo

Questo metodo sfrutta il contributo del poro di transizione della permeabilità mitocondriale alla perdita di protoni a bassa conduttanza per determinare la soglia di tensione per l'apertura dei pori nei topi neonatali con sindrome dell'X fragile con aumento del contenuto di coenzima Q mitocondriale dei cardiomiociti rispetto al controllo wildtype.

Abstract

Il poro di transizione della permeabilità mitocondriale (mPTP) è un mega-canale della membrana mitocondriale interna (IMM) voltaggio-dipendente, non selettivo, importante per la salute e la malattia. L'mPTP media la fuoriuscita di protoni attraverso l'IMM durante l'apertura a bassa conduttanza ed è specificamente inibito dalla ciclosporina A (CsA). Il coenzima Q (CoQ) è un regolatore dell'mPTP e sono state trovate differenze tessuto-specifiche nel contenuto di CoQ e nella probabilità aperta di mPTP nei mitocondri del proencefalo e del cuore in un modello murino neonato di sindrome dell'X fragile (FXS, Fmr1 knockout). Abbiamo sviluppato una tecnica per determinare la soglia di tensione per l'apertura di mPTP in questo ceppo mutante, sfruttando il ruolo dell'mPTP come canale di perdita di protoni.

Per fare ciò, il consumo di ossigeno e il potenziale di membrana (ΔΨ) sono stati misurati simultaneamente in mitocondri isolati utilizzando la polarografia e un elettrodo iono-selettivo tetrafenilfosfonio (TPP⁺) durante la respirazione delle perdite. La soglia per l'apertura di mPTP è stata determinata dall'insorgenza dell'inibizione mediata da CsA della perdita di protoni a specifici potenziali di membrana. Utilizzando questo approccio, le differenze di tensione di gating dell'mPTP sono state definite con precisione nel contesto dell'eccesso di CoQ. Questa nuova tecnica consentirà future indagini per migliorare la comprensione della regolazione fisiologica e patologica dell'apertura a bassa conduttanza del mPTP.

Introduzione

L'mPTP media la transizione di permeabilità (PT), per cui l'IMM diventa bruscamente permeabile a piccole molecole e soluti ^1,2. Questo fenomeno eclatante è un distinto allontanamento dall'impermeabilità caratteristica dell'IMM, che è fondamentale per stabilire il gradiente elettrochimico necessario per la fosforilazione ossidativa³. Il PT, a differenza di altri meccanismi di trasporto mitocondriale, è un processo ad alta conduttanza, non specifico e non selettivo, che consente il passaggio di una gamma di molecole fino a 1,5 kDa ^4,5. L'mPTP è un canale voltaggio-dipendente all'interno dell'IMM la cui apertura altera ΔΨ, la produzione di ATP, l'omeostasi del calcio, la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e la vitalità cellulare⁴.

All'estremo patologico, l'apertura ad alta conduttanza incontrollata e prolungata di mPTP porta al collasso del gradiente elettrochimico, al gonfiore della matrice, all'esaurimento dei nucleotidi piridinici della matrice, alla rottura della membrana esterna, al rilascio di proteine intermembrana (incluso il citocromo c) e, infine, alla morte cellulare ^4,6. Tale apertura patologica di mPTP è stata implicata in lesioni da ischemia-riperfusione cardiaca, insufficienza cardiaca, lesioni cerebrali traumatiche, varie malattie neurodegenerative e diabete ^1,7. Tuttavia, l'apertura mPTP a bassa conduttanza è di natura fisiologica e, a differenza dell'apertura ad alta conduttanza, non porta a una profonda depolarizzazione o gonfiore mitocondriale⁴.

L'apertura a bassa conduttanza del poro limita la permeabilità a ~ 300 Da, consente il passaggio di protoni indipendenti dalla sintesi di ATP ed è una potenziale fonte di perdita fisiologica di protoni⁵. L'apertura fisiologica di mPTP provoca un declino controllato di ΔΨ, aumenta il flusso di elettroni attraverso la catena di trasporto respiratoria e provoca un breve scoppio o lampo di superossido, contribuendo alla segnalazione ROS⁸. La regolazione di tale apertura transitoria di mPTP è importante per l'omeostasi del calcio e il normale sviluppo e maturazione cellulare ^4,9,10,11. L'apertura transitoria dei pori nei neuroni in via di sviluppo, ad esempio, innesca la differenziazione, mentre la chiusura del mPTP induce la maturazione nei cardiomiociti immaturi ^4,5.

Sebbene il significato funzionale dell'mPTP in salute e malattia sia ben stabilito, la sua precisa identità molecolare rimane dibattuta. I progressi sulla struttura molecolare e la funzione dell'mPTP sono stati esaminati in modo completo altrove¹². In breve, attualmente, gli stati di alta e bassa conduttanza del mPTP sono stati ipotizzati per essere mediati da entità distinte¹². I principali candidati sono la F1/F0 ATP sintasi (ATP sintasi) e il trasportatore nucleotidico adeninico (ANT) per modalità ad alta e bassa conduttanza, rispettivamente¹².

Nonostante la mancanza di consenso sull'esatta identità della componente di formazione dei pori dell'mPTP, alcune caratteristiche chiave sono state dettagliate. Una caratteristica ben consolidata dell'mPTP è che è regolato dal gradiente elettrochimico tale che la depolarizzazione dell'IMM porta all'apertura dei pori¹³. Lavori precedenti hanno dimostrato che lo stato redox dei gruppi tiolici vicinili altera la tensione di gating del mPTP, in modo tale che l'ossidazione apre il poro a ΔΨs relativamente più alti, e la riduzione del gruppo tiolico si traduce in probabilità mPTP chiusa¹⁴. Tuttavia, l'identità del sensore di tensione proteica è sconosciuta.

Sono state identificate varie piccole molecole che modulano la probabilità aperta del poro. Ad esempio, l'mPTP può essere stimolato ad aprirsi con calcio, fosfato inorganico, acidi grassi e ROS e può essere inibito da nucleotidi adeninici (in particolare ADP), magnesio, protoni e CsA ^5,12. I meccanismi d'azione di alcuni di questi regolatori sono stati chiariti. Il calcio mitocondriale innesca l'apertura di mPTP almeno in parte legandosi alla subunità β dell'ATP sintasi¹⁵. ROS può attivare l'mPTP diminuendo la sua affinità per aDP e migliorando la sua affinità per la ciclofilina D (CypD), l'attivatore mPTP proteico più studiato¹⁶. Il meccanismo di attivazione dell'mPTP da parte del fosfato inorganico e degli acidi grassi è meno chiaro. Per quanto riguarda gli inibitori endogeni, si ritiene che l'ADP inibisca l'mPTP legandosi all'ANT o all'ATP sintasi, mentre il magnesio esercita il suo effetto inibitorio spostando il calcio dal suo sito di legame 15,17,18,19.

Il basso pH inibisce l'apertura di mPTP protonando l'istidina 112 della subunità della proteina regolatrice che conferisce la sensibilità all'oligomicina (OSCP) dell'ATP sintasi 12,20,21. Il prototipo di inibitore farmacologico del mPTP, CsA, agisce legando CypD e impedendo la sua associazione con OSCP ^22,23. Lavori precedenti hanno anche dimostrato che una varietà di analoghi Del CoQ interagiscono con l'mPTP, inibendolo o attivandolo²⁴. In lavori recenti, abbiamo trovato prove di un mPTP patologicamente aperto, eccessiva perdita di protoni e fosforilazione ossidativa inefficiente a causa di una carenza di CoQ nei mitocondri del proencefalo dei cuccioli di topo FXS appena nati²⁵.

La chiusura del poro con CoQ esogena ha bloccato la perdita patologica di protoni e indotto la maturità morfologica delle spine dendritiche²⁵. È interessante notare che, negli stessi animali, i cardiomiociti FXS avevano livelli eccessivi di CoQ e probabilità di mPTP chiusa rispetto ai controlli wildtype²⁶. Sebbene la causa di queste differenze tessuto-specifiche nei livelli di CoQ sia sconosciuta, i risultati sottolineano il concetto che il CoQ endogeno è probabilmente un regolatore chiave del mPTP. Tuttavia, c'è una grande lacuna nelle nostre conoscenze perché il meccanismo di inibizione mediata dal CoQ dell'mPTP rimane sconosciuto.

La regolazione dell'mPTP è un determinante critico della segnalazione cellulare e della sopravvivenza⁴. Pertanto, rilevare l'apertura di mPTP all'interno dei mitocondri è fondamentale quando si considerano specifici meccanismi fisiopatologici. Tipicamente, la soglia per l'apertura dei pori ad alta conduttanza viene determinata utilizzando il calcio per innescare la transizione di permeabilità. Tale carico di calcio porta al collasso del potenziale di membrana, al rapido disaccoppiamento della fosforilazione ossidativa e al gonfiore mitocondriale^27,28. Abbiamo cercato di sviluppare un metodo per rilevare l'apertura mPTP a bassa conduttanza in situ, senza indurlo di per sé.

L'approccio sfrutta il ruolo dell'mPTP come canale di perdita di protoni. Per fare ciò, sono stati impiegati elettrodi iono-selettivi di tipo Clark e TPP⁺ per misurare simultaneamente il consumo di ossigeno e il potenziale di membrana, rispettivamente, nei mitocondri isolati durante la respirazione delle perdite²⁹. La soglia per l'apertura di mPTP è stata determinata dall'insorgenza dell'inibizione mediata da CsA della perdita di protoni a specifici potenziali di membrana. Utilizzando questo approccio, le differenze di tensione di gating dell'mPTP nel contesto dell'eccesso di CoQ sono state definite con precisione.

Protocollo

L'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Columbia University Medical Center è stata ottenuta per tutti i metodi descritti. FXS (Fmr1 KO) (FVB.129P2-Pde6b⁺ Tyr^c-ch Fmr1^tm1Cgr/J) e controllo (FVB) (FVB.129P2-Pde6b⁺ Tyr^c-ch/AntJ) mouse utilizzati come sistemi modello per questo studio sono stati acquisiti commercialmente (vedere la Tabella dei materiali). Da cinque a undici animali sono stati utilizzati in ogni gruppo sperimentale. I topi del giorno 10 postnatale (P10) sono stati usati per modellare un punto temporale nell'infanzia umana.

1. Isolamento mitocondriale dal cuore di topo

1. Preparare tamponi per l'isolamento mitocondriale e gli esperimenti di respirazione come descritto nella Tabella 1. Conservare a 4 °C se fatto in anticipo.
   1. Preparare il mezzo con gradiente di densità del 15%: diluire il gradiente di densità commerciale medio all'80% di volume/volume (v/v) con diluente di gradiente di densità. Diluire ulteriormente il gradiente di densità dell'80% medio 15% v/v aggiungendo tampone di isolamento mitocondriale (MI)/albumina sierica bovina (BSA).
2. Isolare i mitocondri da tessuti freschi e non congelati per questi esperimenti e utilizzarli il giorno della preparazione, in genere entro cinque ore²⁶. Eseguire tutte le fasi di isolamento sul ghiaccio.
   1. Decapitare il topo ed asportare il cuore. Lavare immediatamente 1-2 volte in una capsula di Petri con MI/BSA ghiacciato. Tagliare l'atrio e tritare il tessuto.
   2. Trasferire il tessuto cardiaco tritato in un omogeneizzatore vetro-vetro contenente 1 mL di MI/BSA. Omogeneizzare con un pestello più sciolto (A) (10 colpi), quindi un pestello più stretto (B) (10 colpi).
   3. Centrifugare l'omogeneizzato a 1.100 × g per 2 min a 4 °C per rimuovere i detriti nucleari e cellulari.
   4. Prendere delicatamente il surnatante senza toccare alcun pellet soffice e sovrapporlo con cura sopra 700 μL di mezzo gradiente di densità del 15% in un tubo di centrifuga. Centrifugare a 18.500 × g per 15 min a 4 °C.
   5. Risospesare il pellet in 1 mL di tampone di saccarosio (SB)/BSA e centrifugare a 10.000 × g per 10 min a 4 °C.
   6. Rimuovere completamente e scartare il surnatante. Risospesso il pellet in SB/BSA ad un volume finale di 55 μL.
   7. Quantificare il contenuto proteico mitocondriale utilizzando un test standard come il test proteico dell'acido bicinchoninico (BCA).

2. Consumo di ossigeno mitocondriale (O₂) e ΔΨ

1. Assemblaggio e calibrazione di elettrodi di ossigeno
   1. Impostare e calibrare l'elettrodo di ossigeno (vedere la tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
      1. Posizionare una goccia di soluzione di elettrolita di cloruro di potassio al 50% (KCl) sopra la cupola del disco dell'elettrodo.
      2. Posizionare un piccolo pezzo ~ 2 cm² distanziatore di carta per sigarette coperto con un pezzo leggermente più grande della membrana di politetrafluoroetilene (PTFE) fornita sopra la goccia di elettrolita.
      3. Utilizzando lo strumento applicatore fornito, spingere il piccolo disco dell'elettrodo O-ring sopra la cupola dell'elettrodo.
         NOTA: Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria e che la membrana sia liscia.
   2. Riempire bene il serbatoio con la soluzione elettrolitica.
   3. Posizionare bene l'O-ring più grande nella rientranza attorno al disco dell'elettrodo.
   4. Installare il disco nella camera degli elettrodi e collegarlo all'unità di controllo.
   5. Aggiungere 2 mL di acqua deionizzata satura d'aria alla camera di reazione e il magnete rivestito in PTFE alla camera.
   6. Collegare la camera alla parte posteriore dell'unità di controllo.
   7. Impostare la temperatura a 37 °C e la velocità di agitazione a 100.
   8. Attendere 10 minuti affinché la temperatura del sistema si equilibri prima di iniziare la calibrazione.
   9. Nella scheda Calibrazione selezionare Calibrazione fase liquida per eseguire la calibrazione in fase liquida. Confermare che la temperatura è impostata su 37 °C, la velocità di agitazione è 100 e la pressione è impostata sulla pressione atmosferica (101,32 kPa).
   10. Premere OK e attendere che il segnale si stabilizzi.
   11. Quando viene raggiunto un plateau, premere OK.
   12. Stabilire zero O₂ nella camera aggiungendo una piccola quantità (~ 20 mg) di ditionite di sodio.
   13. Premere OK e attendere che il segnale si stabilizzi.
   14. Quando viene raggiunto un plateau, premere Salva per accettare la calibrazione.
2. Assemblaggio elettrodo selettivo TPP⁺
   1. Riempire la punta dell'elettrodo selettivo TPP⁺ con una soluzione TPP da 10 mM utilizzando la siringa e l'ago flessibile forniti, avendo cura di evitare bolle d'aria.
   2. Assemblare l'apparecchiatura per elettrodi selettivi TPP⁺, compresi l'elettrodo di riferimento e il supporto per elettrodi, (vedere Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
   3. In breve, allentare il cappuccio del supporto dell'elettrodo e inserire l'elettrodo di riferimento interno ^{nella punta} TPP+. Stringere il cappuccio per fissare la punta. Collegare il cavo in dotazione al supporto dell'elettrodo e alla porta ausiliaria della scatola di controllo.
   4. Inserire l'elettrodo TPP⁺ selettivo e gli elettrodi di riferimento nel gruppo stantuffo adattato per elettrodi iono-selettivi. Collegare l'elettrodo di riferimento alla porta di riferimento della scatola di controllo.
   5. Inserire gli elettrodi TPP⁺ selettivi e di riferimento nel gruppo stantuffo adattato per elettrodi iono-selettivi.
3. Preparazione della camera di reazione
   1. Aggiungere la miscela di reazione alla camera di reazione: 10 mM di succinato (substrato del complesso II), 5 μM di rotenone (inibitore del complesso I), 80 ng mL⁻¹ nigericina (per far collassare il gradiente di pH attraverso IMM), 2,5 μg di oligomicina ^mL-1 (per indurre la respirazione allo stato 4) e tampone di reazione respiratorio (RB)/BSA a un volume finale di 1 mL. Fare attenzione ad evitare di introdurre bolle d'aria nella camera.
   2. Chiudere la camera con il gruppo stantuffo adattato con il TPP^+-selettivo e l'elettrodo di riferimento in posizione. Seleziona VAI per avviare la registrazione. Una volta chiusa la camera, introdurre reagenti aggiuntivi direttamente nella soluzione di reazione utilizzando microsiringhe separate modificate con tubi di plastica per regolare la lunghezza dell'ago.
4. Calibrazione TPP⁺
   1. Una volta ottenuto un segnale di tensione stabile, calibrare l'elettrodo TPP⁺ selettivo aggiungendo incrementi di 1 μM di una soluzione TPP da 0,1 mM a una concentrazione finale di 3 μM. Osservare che c'è un declino logaritmico nel segnale di tensione TPP ⁺ con ogni aggiunta.
      NOTA: calibrare l'elettrodo TPP⁺-selettivo all'inizio di ogni esperimento.
5. Acquisizione dati
   1. Lasciare stabilizzare le tracce di O₂ e TPP⁺ e aggiungere 100 μg di mitocondri cardiomiocitari appena preparati alla camera di reazione fino a una concentrazione finale di 0,1 mg ^mL-1 tramite la porta di aggiunta del reagente nel gruppo stantuffo. Osservare la diminuzione dei livelli di O₂ nella camera quando i mitocondri diventano energizzati e consumano O₂ e il brusco aumento del segnale di tensione TPP ⁺ mentre i mitocondri generano un potenziale di membrana e assorbono TPP ⁺ dalla soluzione.
   2. Aggiungere 2,5 μg di oligomicina ^mL-1 per indurre la respirazione allo stato 4.
      NOTA: i tassi di consumo di O₂ rappresenteranno ora il tasso di respirazione della perdita di protoni. L'oligomicina può essere aggiunta alla camera di reazione prima di TPP⁺ come alternativa.
6. Valutare la probabilità aperta dell'mPTP
   1. Osservare che ΔΨ diminuisce nel tempo durante la respirazione delle perdite. Una volta raggiunto il ΔΨ desiderato, aggiungere 1 μM CsA (inibitore mPTP) alla camera di reazione per valutare la probabilità aperta dell'mPTP a quello specifico ΔΨ.
   2. Misurare l'effetto di CsA sul consumo di O₂ e ΔΨ prima e dopo l'aggiunta di CsA
   3. Determinare la dipendenza dalla tensione dell'apertura mPTP variando il ΔΨ a cui viene aggiunto CsA in esperimenti successivi.

Risultati

Vengono mostrati il consumo tipico di O₂ e le curve ΔΨ generate in questi esperimenti (Figura 1A,B). Il declino logaritmico del segnale di tensione con calibrazione TPP⁺ viene mostrato all'inizio di ogni esperimento. L'assenza di questo pattern logaritmico può suggerire un problema con l'elettrodo ^selettivo TPP+. I mitocondri in genere generano ΔΨ immediatamente dopo l'aggiunta al tampone respiratorio. ΔΨ può essere interpretato dalle...

Discussione

Questo documento descrive un metodo per valutare la probabilità aperta dell'mPTP. In particolare, la soglia di tensione per l'apertura mPTP a bassa conduttanza è stata determinata valutando l'effetto dell'inibizione del CsA sulla perdita di protoni su un intervallo di ΔΨs. Usando questa tecnica, abbiamo potuto identificare le differenze nel gating di tensione dell'mPTP tra i topi FXS e i controlli FVB coerenti con le loro differenze nel contenuto di CoQ specifico del tessuto. Fondamentale per il successo di questa me...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Fisher Scientific	15630080
Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1	PP systems	941039
BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft.	Fisher Scientific	14-170-11B	to modify the length of the hamilton synringe as needed
Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free	Sigma	A7030-10G
Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm	World Precision Inst. LLC	DRIREF-2
Electrode Holder for KWIK-Tips	World Precision Inst. LLC	KWIK-2	ion selective electrode holder
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid  (EGTA)	Sigma	324626
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME		FXS mice, Fmr1 KO
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME		FVB mice
Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk	Cole-Parmer	EW-07938-30	microsyringe
Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle	Cole-Parmer	EW-07938-02	microsyringe
Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete	PP systems	OXYTHERM+R	oxygen electrode and software
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma	1374248
Mannitol	Sigma	M9546-250G
P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A)	Sigma	D4022-10MG
Percoll	Sigma	P1644	medium for density gradient separation
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P3911
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	Sigma	5.43841
Sucrose	Sigma	S0389
TPP+ Electrode Tips (3)	World Precision Inst. LLC	TIPTPP