АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот метод использует вклад поры перехода митохондриальной проницаемости в утечку протонов с низкой проводимостью для определения порога напряжения для открытия пор у неонатальных хрупких мышей с синдромом X с повышенным содержанием митохондриального коэнзима Q кардиомиоцитов по сравнению с контролем дикого типа.

Аннотация

Переходная пора митохондриальной проницаемости (mPTP) представляет собой мегаканал с напряжением, неселективный мегаканал внутренней митохондриальной мембраны (ИММ), важный для здоровья и болезней. mPTP опосредует утечку протонов через ИММ во время открытия с низкой проводимостью и специфически ингибируется циклоспорином А (CsA). Коэнзим Q (CoQ) является регулятором mPTP, и были обнаружены тканеспецифические различия в содержании CoQ и открытой вероятности mPTP в митохондриях переднего мозга и сердца у новорожденной мышиной модели синдрома хрупкого X (FXS, нокаут Fmr1 ). Мы разработали методику определения порога напряжения для открытия mPTP в этом мутантном штамме, используя роль mPTP в качестве канала утечки протонов.

Для этого потребление кислорода и мембранный потенциал (ΔΨ) одновременно измеряли в изолированных митохондриях с использованием полярографии и ионселективного электрода тетрафенилфосфония (TPP+) во время утечного дыхания. Порог вскрытия mPTP определяли по началу CsA-опосредованного ингибирования утечки протонов при специфических мембранных потенциалах. Используя этот подход, различия в напряжении затвора mPTP были точно определены в контексте превышения CoQ. Этот новый метод позволит в будущем проводить исследования для улучшения понимания физиологической и патологической регуляции низкопроводящего открытия mPTP.

Введение

mPTP опосредует переход проницаемости (PT), в результате чего IMM становится резко проницаемым для малых молекул ирастворяет 1,2. Это поразительное явление является явным отходом от характерной непроницаемости ИММ, которая имеет основополагающее значение для установления электрохимического градиента, необходимого для окислительного фосфорилирования3. ПТ, в отличие от других митохондриальных транспортных механизмов, представляет собой высокопроводящий, неспецифический и неселективный процесс, позволяющий проходить в диапазоне молекул до 1,5 кДа 4,5. mPTP представляет собой канал с напряжением внутри IMM, открытие которого изменяет ΔΨ, выработку АТФ, гомеостаз кальция, выработку активных форм кислорода (АФК) и жизнеспособность клеток4.

В патологическом крайнем случае неконтролируемое и длительное высокопроводящее открытие mPTP приводит к коллапсу электрохимического градиента, набуханию матрицы, истощению матриксных пиридиновых нуклеотидов, разрыву наружной мембраны, высвобождению межмембранных белков (включая цитохром c) и, в конечном счете, гибели клеток 4,6. Такое патологическое открытие mPTP было связано с сердечной ишемией-реперфузионным повреждением, сердечной недостаточностью, черепно-мозговой травмой, различными нейродегенеративными заболеваниями и диабетом 1,7. Однако открытие mPTP с низкой проводимостью носит физиологический характер и, в отличие от открытия с высокой проводимостью, не приводит к глубокой деполяризации или митохондриальному отеку4.

Низкопроводящее открытие поры ограничивает проницаемость до ~300 Да, позволяет проходить протонам независимо от синтеза АТФ и является потенциальным источником физиологической утечки протонов5. Физиологическое открытие mPTP вызывает контролируемое снижение ΔΨ, увеличивает поток электронов через дыхательную транспортную цепь и приводит к короткому всплеску или вспышке супероксида, способствуя передаче сигналов АФК8. Регуляция такого переходного открытия mPTP важна для гомеостаза кальция и нормального клеточного развития и созревания 4,9,10,11. Транзиторное открытие пор в развивающихся нейронах, например, запускает дифференцировку, в то время как закрытие mPTP индуцирует созревание в незрелых кардиомиоцитах 4,5.

Хотя функциональное значение mPTP в здоровье и болезнях хорошо известно, его точная молекулярная идентичность остается спорной. Прогресс в области молекулярной структуры и функции mPTP был всесторонне рассмотрен в другом месте12. Вкратце, в настоящее время предполагается, что состояния mPTP с высокой и низкой проводимостью опосредованы различными сущностями12. Ведущими кандидатами являются F1/F0 АТФ-синтаза (АТФ-синтаза) и транспортер адениннуклеотидов (ANT) для режимов высокой и низкой проводимости соответственно12.

Несмотря на отсутствие консенсуса относительно точной идентичности порообразующего компонента mPTP, некоторые ключевые характеристики были детализированы. Хорошо известной особенностью mPTP является то, что он регулируется электрохимическим градиентом таким образом, что деполяризация ИММ приводит к открытию пор13. Предыдущая работа показала, что окислительно-восстановительное состояние вицинальных тиольных групп изменяет напряжение мПТП, так что окисление открывает поры при относительно более высоких ΔΨs, а восстановление тиольной группы приводит к закрытой вероятности mPTP14. Однако идентичность белкового датчика напряжения неизвестна.

Были идентифицированы различные малые молекулы, которые модулируют открытую вероятность поры. Например, mPTP может быть стимулирован к открытию кальцием, неорганическими фосфатами, жирными кислотами и АФК и может ингибироваться адениннуклеотидами (особенно АДФ), магнием, протонами и CsA 5,12. Выяснены механизмы действия некоторых из этих регуляторов. Митохондриальный кальций вызывает открытие mPTP, по меньшей мере, частично путем связывания с β субъединицей АТФ-синтазы15. АФК может активировать mPTP, уменьшая его сродство к АДФ и усиливая его сродство к циклофилину D (CypD), наиболее изученному белковому активатору mPTP16. Механизм активации mPTP неорганическими фосфатами и жирными кислотами менее ясен. Что касается эндогенных ингибиторов, считается, что АДФ ингибирует mPTP путем связывания в ANT или АТФ-синтазе, в то время как магний оказывает свое ингибирующее действие, вытесняя кальций из его сайта связывания 15,17,18,19.

Низкий рН ингибирует открытие mPTP путем протонирования гистидина 112 регуляторной субъединицы белка, придающего чувствительность к олигомицину (OSCP) АТФ-синтазы 12,20,21. Прототип фармакологического ингибитора mPTP, CsA, действует путем связывания CypD и предотвращения его ассоциации с OSCP22,23. Предыдущая работа также показала, что различные аналоги CoQ взаимодействуют с mPTP, ингибируя его или активируя его24. В недавней работе мы обнаружили доказательства патологически открытого mPTP, чрезмерной утечки протонов и неэффективного окислительного фосфорилирования из-за дефицита CoQ в митохондриях переднего мозга новорожденных щенков мышей FXS25.

Закрытие пор экзогенным CoQ блокировало патологическую утечку протонов и индуцировало морфологическую зрелость дендритных шипов25. Интересно, что у тех же животных кардиомиоциты FXS имели чрезмерные уровни CoQ и закрытую вероятность mPTP по сравнению с контрольной группой дикого типа26. Хотя причина этих тканеспецифических различий в уровнях CoQ неизвестна, результаты подчеркивают концепцию, что эндогенный CoQ, вероятно, является ключевым регулятором mPTP. Тем не менее, существует большой пробел в наших знаниях, потому что механизм CoQ-опосредованного ингибирования mPTP остается неизвестным.

Регуляция mPTP является критическим фактором, определяющим клеточную сигнализацию и выживаемость4. Таким образом, обнаружение открытия mPTP в митохондриях является ключевым при рассмотрении конкретных патофизиологических механизмов. Как правило, порог для открытия пор с высокой проводимостью определяется с использованием кальция для запуска перехода проницаемости. Такая кальциевая нагрузка приводит к коллапсу мембранного потенциала, быстрому разъединению окислительного фосфорилирования и митохондриальному набуханию27,28. Мы стремились разработать метод обнаружения открытия mPTP in situ с низкой проводимостью, не вызывая его как такового.

Этот подход использует роль mPTP в качестве канала утечки протонов. Для этого были использованы ионселективные электроды Типа Кларка и TPP+ для одновременного измерения потребления кислорода и мембранного потенциала, соответственно, в изолированных митохондриях во время утечного дыхания29. Порог вскрытия mPTP определяли по началу CsA-опосредованного ингибирования утечки протонов при специфических мембранных потенциалах. Используя этот подход, были точно определены различия в напряжении платы mPTP в контексте превышения CoQ.

протокол

Для всех описанных методов было получено одобрение Институционального комитета по уходу за животными и их использованию Медицинского центра Колумбийского университета. FXS (Fmr1 KO) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J) и контрольные (FVB) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ) мыши, используемые в качестве модельных систем для этого исследования, были коммерчески приобретены (см. Таблицу материалов). От пяти до одиннадцати животных использовались в каждой экспериментальной группе. Послеродовые мыши 10-го дня (P10) использовались для моделирования временной точки в младенчестве человека.

1. Изоляция митохондрий от сердца мыши

  1. Подготовьте буферы для экспериментов с митохондриальной изоляцией и дыханием, как описано в таблице 1. Хранить при температуре 4 °C, если это сделано заранее.
    1. Приготовьте 15% градиентную среду плотности: разбавьте коммерческую градиентную среду плотности до 80% объема/объема (v/v) разбавителем градиента плотности. Далее разбавляют 80% градиентную среду плотности 15% v/v путем добавления буфера изоляции митохондрий (MI)/бычьего сывороточного альбумина (BSA).
  2. Изолируйте митохондрии из свежей, не замороженной ткани для этих экспериментов и используйте в день приготовления, обычно в течение пяти часов26. Проведите все этапы изоляции на льду.
    1. Обезглавить мышь и иссечь сердце. Немедленно вымойте 1-2 раза в чашке Петри с ледяным MI/BSA. Отрежьте предсердие и измельчите ткань.
    2. Переложите измельченную сердечную ткань на гомогенизатор из стекла и стекла, содержащий 1 мл MI/BSA. Гомогенизировать более рыхлым (А) пестиком (10 ударов), затем более плотным (В) пестиком (10 ударов).
    3. Центрифугировать гомогенат при 1 100 × г в течение 2 мин при 4 °C для удаления ядерного и клеточного мусора.
    4. Возьмите супернатант осторожно, не прикасаясь к какой-либо пушистой грануле, и аккуратно нанесите его поверх 700 мкл среды 15% градиента плотности в центрифужной трубке. Центрифуга при 18 500 × г в течение 15 мин при 4 °C.
    5. Повторно суспендируют гранулу в 1 мл сахарозного буфера (SB)/BSA и центрифугируют при 10 000 × г в течение 10 мин при 4°С.
    6. Полностью удалите и выбросьте супернатант. Повторно суспендировать гранулы в SB/BSA до конечного объема 55 мкл.
    7. Количественная оценка содержания митохондриального белка с использованием стандартного анализа, такого как анализ белка бицинхониновой кислоты (BCA).

2. Потребление митохондриального кислорода (O2) и ΔΨ

  1. Сборка и калибровка кислородных электродов
    1. Установите и откалибруйте кислородный электрод (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
      1. Поместите каплю 50% раствора электролита хлорида калия (KCl) поверх купола электродного диска.
      2. Поместите небольшой кусочек ~2см2 сигаретной бумаги, покрытый немного большим куском предоставленной политетрафторэтиленовой (PTFE) мембраны над каплей электролита.
      3. Используя прилагаемый инструмент аппликатора, нажмите на уплотнительное кольцо небольшого электродного диска над куполом электрода.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что нет пузырьков воздуха и что мембрана гладкая.
    2. Залейте резервуар раствором электролита.
    3. Поместите большее уплотнительное кольцо в углубление вокруг электродного диска.
    4. Установите диск в электродную камеру и подключите его к блоку управления.
    5. Добавьте 2 мл насыщенной воздухом деионизированной воды в реакционную камеру и магнит с ptfe-покрытием в камеру.
    6. Подключите камеру к задней части блока управления.
    7. Установите температуру на 37 °C и скорость перемешивания на 100.
    8. Подождите 10 минут, чтобы температура системы уравновешивалась перед началом калибровки.
    9. На вкладке Калибровка выберите Калибровка жидкой фазы , чтобы выполнить калибровку жидкой фазы. Убедитесь, что температура установлена на уровне 37 °C, скорость перемешивания равна 100, а давление установлено на атмосферное давление (101,32 кПа).
    10. Нажмите OK и дождитесь выхода сигнала на плато.
    11. Когда плато будет достигнуто, нажмите OK.
    12. Установите нольO2 в камере, добавив небольшое количество (~20 мг) дитионита натрия.
    13. Нажмите OK и дождитесь выхода сигнала на плато.
    14. Когда плато будет достигнуто, нажмите кнопку Сохранить , чтобы принять калибровку.
  2. TPP+-селективная электродная сборка
    1. Заполните селективный электродный наконечник TPP+ раствором TPP 10 мМ, используя прилагаемый шприц и гибкую иглу, заботясь о том, чтобы избежать пузырьков воздуха.
    2. Смонтируйте TPP+-селективный электродный аппарат, включая электрод сравнения и держатель электрода, (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
    3. Вкратце, ослабьте крышку держателя электрода и вставьте внутренний опорный электрод в наконечник TPP+. Затяните колпачок, чтобы закрепить наконечник. Подключите прилагаемый кабель к держателю электрода и вспомогательному порту блока управления.
    4. Вставьте TPP+-селективный электрод и электроды сравнения в адаптированный плунжерный узел для ионоселективных электродов. Подключите опорный электрод к опорному порту блока управления.
    5. Вставьте электроды TPP+ и электроды сравнения в адаптированный плунжерный узел для ионселективных электродов.
  3. Подготовка реакционной камеры
    1. Добавьте реакционную смесь в реакционную камеру: 10 мМ сукцината (субстрат комплекса II), 5 мкМ ротенона (ингибитор комплекса I), 80 нг мл−1 нигерицина (для коллапса градиента рН через ИММ), 2,5 мкг мл-1 олигомицина (для индуцирования дыхания в состоянии 4) и буфера дыхания (RB)/BSA реакционного буфера до конечного объема 1 мл. Позаботьтесь о том, чтобы избежать введения пузырьков воздуха в камеру.
    2. Закройте камеру адаптированным плунжерным узлом с TPP+-селективным и опорным электродом на месте. Выберите GO , чтобы начать запись. Как только камера закрыта, вводят дополнительные реагенты непосредственно в реакционный раствор с помощью отдельных микрошприцев, модифицированных пластиковой трубкой, для регулировки длины иглы.
  4. Калибровка TPP+
    1. Как только будет получен сигнал стабильного напряжения, откалибруйте TPP+-селективный электрод, добавив 1 мкМ приращения раствора ТЭС 0,1 мМ к конечной концентрации 3 мкМ. Обратите внимание, что с каждым добавлением происходит логарифмическое снижение сигнала напряжения TPP+ .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Калибруйте TPP+-селективный электрод в начале каждого эксперимента.
  5. Сбор данных
    1. Позвольте следам O2 и TPP+ стабилизироваться и добавьте 100 мкг свежеприготовленных митохондрий кардиомиоцитов в реакционную камеру до конечной концентрации 0,1 мг мл-1 через порт добавления реагента в плунжерном сборе. Наблюдайте за снижением уровней O2 в камере, когда митохондрии становятся энергичными и потребляют O2 , и резкое увеличение сигнала напряжения TPP+ , поскольку митохондрии генерируют мембранный потенциал и поглощают TPP+ из раствора.
    2. Добавьте 2,5 мкг мл-1 олигомицина, чтобы вызвать состояние дыхания 4.
      ПРИМЕЧАНИЕ:Коэффициенты потребления O 2 теперь будут представлять скорость дыхания утечки протонов. Олигомицин может быть добавлен в реакционную камеру до TPP+ в качестве альтернативы.
  6. Оценка открытой вероятности mPTP
    1. Обратите внимание, что ΔΨ снижается с течением времени во время утечек дыхания. Как только желаемый ΔΨ достигнут, добавьте 1 мкМ CsA (ингибитор mPTP) в реакционную камеру для оценки открытой вероятности mPTP при этом конкретном ΔΨ.
    2. Измерение влияния CsA на потреблениеO2 и ΔΨ до и после добавления CsA
    3. Определите зависимость напряжения открытия mPTP путем изменения ΔΨ, при котором CsA добавляется в последовательных экспериментах.

Результаты

Показаны типичные кривые потребленияO2 и ΔΨ, полученные в этих экспериментах (рисунок 1A,B). Логарифмическое снижение сигнала напряжения при калибровке TPP+ показано в начале каждого эксперимента. Отсутствие этой логарифмической картины может указыва?...

Обсуждение

В данной работе описан метод оценки открытой вероятности mPTP. В частности, порог напряжения для открытия mPTP с низкой проводимостью определяли путем оценки влияния ингибирования CsA на утечку протонов в диапазоне ΔΨs. Используя этот метод, мы смогли бы идентифицировать различия в напряжен...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Эта работа поддерживается следующими грантами: NIH/ NIGMS T32GM008464 (K.K.G.), Премия Медицинского центра Ирвинга Колумбийского университета Цель возможностей Provost для отделения анестезиологии (K.K.G.), Общество детской анестезии Young Investigator Research Award (K.K.G.) и NIH / NINDS R01NS112706 (R.J.L.)

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Fisher Scientific15630080
Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1PP systems941039
BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft.Fisher Scientific14-170-11Bto modify the length of the hamilton synringe as needed
Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid freeSigmaA7030-10G
Dri-Ref Reference Electrode, 2 mmWorld Precision Inst. LLCDRIREF-2
Electrode Holder for KWIK-TipsWorld Precision Inst. LLCKWIK-2 ion selective electrode holder
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid  (EGTA)Sigma324626
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/JJackson Laboratory, Bar Harbor, MEFXS mice, Fmr1 KO 
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJJackson Laboratory, Bar Harbor, MEFVB mice
Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pkCole-ParmerEW-07938-30microsyringe
Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-NeedleCole-ParmerEW-07938-02microsyringe
Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) CompletePP systemsOXYTHERM+Roxygen electrode and software
Magnesium Chloride (MgCl2)Sigma1374248
MannitolSigmaM9546-250G
P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A)SigmaD4022-10MG
PercollSigmaP1644medium for density gradient separation
Potassium chloride (KCl)SigmaP3911
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)Sigma5.43841
SucroseSigmaS0389
TPP+ Electrode Tips (3)World Precision Inst. LLCTIPTPP

Ссылки

  1. Rasola, A., Bernardi, P. The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and in disease pathogenesis. Apoptosis. 12 (5), 815-833 (2007).
  2. Szabó, I., Zoratti, M. The mitochondrial megachannel is the permeability transition pore. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 24, 111-117 (1992).
  3. Brand, M., Ferguson, S., Nunnari, J., Kühlbrandt, W., Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. 14, 767-830 (2002).
  4. Perez, M. J., Quintanilla, R. A. Development or disease: duality of the mitochondrial permeability transition pore. Developmental Biology. 426 (1), 1-7 (2017).
  5. Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart. Cell Metabolism. 21 (2), 206-214 (2015).
  6. Javadov, S., Kuznetsov, A. Mitochondrial permeability transition and cell death: the role of cyclophilin d. Frontiers in Physiology. 4, 76 (2013).
  7. Dorn, G. W. Mechanisms of non-apoptotic programmed cell death in diabetes and heart failure. Cell Cycle. 9 (17), 3442-3448 (2010).
  8. Boyman, L., et al. Dynamics of the mitochondrial permeability transition pore: Transient and permanent opening events. Archives of Biochemistry and Biophysics. 666, 31-39 (2019).
  9. Hom, J. R., et al. The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte differentiation. Developmental Cell. 21 (3), 469-478 (2011).
  10. Hou, Y., et al. Mitochondrial superoxide production negatively regulates neural progenitor proliferation and cerebral cortical development. Stem Cells. 30 (11), 2535-2547 (2012).
  11. Elrod, J. W., et al. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca(2+) exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3680-3687 (2010).
  12. Bonora, M., Giorgi, C., Pinton, P. Molecular mechanisms and consequences of mitochondrial permeability transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2021).
  13. Bernardi, P. Modulation of the mitochondrial cyclosporin A-sensitive permeability transition pore by the proton electrochemical gradient. Evidence that the pore can be opened by membrane depolarization. Journal of Biological Chemistry. 267 (13), 8834-8839 (1992).
  14. Petronilli, V., et al. The voltage sensor of the mitochondrial permeability transition pore is tuned by the oxidation-reduction state of vicinal thiols. Increase of the gating potential by oxidants and its reversal by reducing agents. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16638-16642 (1994).
  15. Giorgio, V., et al. Ca(2+) binding to F-ATP synthase beta subunit triggers the mitochondrial permeability transition. European Molecular Biology Organization Reports. 18 (7), 1065-1076 (2017).
  16. Halestrap, A. P., Woodfield, K. Y., Connern, C. P. Oxidative stress, thiol reagents, and membrane potential modulate the mitochondrial permeability transition by affecting nucleotide binding to the adenine nucleotide translocase. Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3346-3354 (1997).
  17. Szabo, I., Bernardi, P., Zoratti, M. Modulation of the mitochondrial megachannel by divalent cations and protons. Journal of Biological Chemistry. 267 (5), 2940-2946 (1992).
  18. Karch, J., et al. Inhibition of mitochondrial permeability transition by deletion of the ANT family and CypD. Science Advances. 5 (8), (2019).
  19. Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 10580-10585 (2014).
  20. Antoniel, M., et al. The unique histidine in OSCP subunit of F-ATP synthase mediates inhibition of the permeability transition pore by acidic pH. European Molecular Biology Organization Reports. 19 (2), 257-268 (2018).
  21. Haworth, R. A., Hunter, D. R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Archives of Biochemistry and Biophysics. 195 (2), 460-467 (1979).
  22. Halestrap, A. P., Connern, C. P., Griffiths, E. J., Kerr, P. M. Cyclosporin A binding to mitochondrial cyclophilin inhibits the permeability transition pore and protects hearts from ischaemia/reperfusion injury. Molecular and Cellular Biochemistry. 174 (1-2), 167-172 (1997).
  23. Giorgio, V., Fogolari, F., Lippe, G., Bernardi, P. OSCP subunit of mitochondrial ATP synthase: role in regulation of enzyme function and of its transition to a pore. British Journal of Pharmacology. 176 (22), 4247-4257 (2019).
  24. Fontaine, E., Ichas, F., Bernardi, P. A ubiquinone-binding site regulates the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Biological Chemistry. 273 (40), 25734-25740 (1998).
  25. Griffiths, K. K., et al. Inefficient thermogenic mitochondrial respiration due to futile proton leak in a mouse model of fragile X syndrome. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 34 (6), 7404-7426 (2020).
  26. Barajas, M., et al. The newborn Fmr1 knockout mouse: a novel model of excess ubiquinone and closed mitochondrial permeability transition pore in the developing heart. Pediatric Research. 89 (3), 456-463 (2021).
  27. Parks, R. J., Murphy, E., Liu, J. C., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. . Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 187-196 (2018).
  28. Carraro, M., Bernardi, P. Measurement of membrane permeability and the mitochondrial permeability transition. Methods in Cell Biology. 155, 369-379 (2020).
  29. Affourtit, C., Wong, H., Brand, M. D., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. . Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 157-170 (2018).
  30. Teodoro, J. S., Palmeira, C. M., Rolo, A. P., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. . Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 109-119 (2018).
  31. Neginskaya, M. A., Pavlov, E. V., Sheu, S. S. Electrophysiological properties of the mitochondrial permeability transition pores: Channel diversity and disease implication. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1862 (3), 148357 (2021).
  32. Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241 (2), 139-176 (1995).
  33. Yajuan, X., Xin, L., Zhiyuan, L. A comparison of the performance and application differences between manual and automated patch-clamp techniques. Current Chemical Genomics. 6, 87-92 (2012).
  34. Petronilli, V., et al. Transient and long-lasting openings of the mitochondrial permeability transition pore can be monitored directly in intact cells by changes in mitochondrial calcein fluorescence. Biophysical Journal. 76 (2), 725-734 (1999).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены