Évaluation de la probabilité ouverte du pore de transition de perméabilité mitochondriale dans le cadre de l’excès de coenzyme Q

Résumé

Cette méthode exploite la contribution du pore de transition de perméabilité mitochondriale à la fuite de protons à faible conductance pour déterminer le seuil de tension pour l’ouverture des pores chez les souris atteintes du syndrome de l’X fragile néonatal avec une teneur accrue en coenzyme Q mitochondriale cardiomyocytaire par rapport au contrôle wildtype.

Résumé

Le pore de transition de perméabilité mitochondriale (mPTP) est un méga-canal de membrane mitochondriale interne (IMM) voltage-dépendant, non sélectif et important pour la santé et la maladie. Le mPTP médie la fuite de protons à travers l’IMM lors de l’ouverture à faible conductance et est spécifiquement inhibé par la cyclosporine A (CsA). La coenzyme Q (CoQ) est un régulateur de la mPTP, et des différences spécifiques aux tissus ont été trouvées dans la teneur en CoQ et la probabilité ouverte de la mPTP dans le cerveau antérieur et les mitochondries cardiaques dans un modèle murin nouveau-né du syndrome de l’X fragile (FXS, Fmr1 knockout). Nous avons développé une technique pour déterminer le seuil de tension pour l’ouverture mPTP dans cette souche mutante, en exploitant le rôle du mPTP en tant que canal de fuite de protons.

Pour ce faire, la consommation d’oxygène et le potentiel membranaire (ΔΨ) ont été mesurés simultanément dans des mitochondries isolées à l’aide de la polarographie et d’une électrode sélective d’ions tétraphénylphosphonium (TPP⁺) pendant la respiration des fuites. Le seuil d’ouverture du mPTP a été déterminé par l’apparition d’une inhibition médiée par la CsA de la fuite de protons à des potentiels membranaires spécifiques. En utilisant cette approche, les différences de tension gating du mPTP ont été définies avec précision dans le contexte de l’excès de CoQ. Cette nouvelle technique permettra d’étudier à l’avenir la compréhension de la régulation physiologique et pathologique de l’ouverture à faible conductance du mPTP.

Introduction

Le mPTP médie la transition de perméabilité (PT), par laquelle l’IMM devient brusquement perméable aux petites molécules et solutés ^1,2. Ce phénomène frappant s’écarte nettement de l’imperméabilité caractéristique de l’IMM, qui est fondamentale pour établir le gradient électrochimique nécessaire à la phosphorylation oxydative³. La PT, contrairement à d’autres mécanismes de transport mitochondrial, est un processus à haute conductance, non spécifique et non sélectif, permettant le passage d’une gamme de molécules jusqu’à 1,5 kDa ^4,5. Le mPTP est un canal dépendant de la tension au sein de l’IMM dont l’ouverture modifie ΔΨ, la production d’ATP, l’homéostasie du calcium, la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et la viabilité cellulaire⁴.

À l’extrême pathologique, l’ouverture incontrôlée et prolongée à haute conductance du mPTP entraîne l’effondrement du gradient électrochimique, le gonflement de la matrice, l’épuisement des nucléotides pyridine de la matrice, la rupture de la membrane externe, la libération de protéines intermembranaires (y compris le cytochrome c) et, finalement, la mort cellulaire ^4,6. Une telle ouverture pathologique de la PTP a été impliquée dans une ischémie cardiaque-reperfusion, une insuffisance cardiaque, une lésion cérébrale traumatique, diverses maladies neurodégénératives et le diabète ^1,7. Cependant, l’ouverture mPTP à faible conductance est de nature physiologique et, contrairement à l’ouverture à haute conductance, ne conduit pas à une dépolarisation profonde ou à un gonflement mitochondrial⁴.

L’ouverture à faible conductance du pore limite la perméabilité à ~300 Da, permet le passage de protons indépendamment de la synthèse de l’ATP et constitue une source potentielle de fuite physiologique de^{protons 5}. L’ouverture physiologique de la mPTP provoque un déclin contrôlé de ΔΨ, augmente le flux d’électrons à travers la chaîne de transport respiratoire et entraîne une courte rafale ou un flash de superoxyde, contribuant à la signalisation ROS⁸. La régulation d’une telle ouverture transitoire de mPTP est importante pour l’homéostasie du calcium et le développement et la maturation cellulaires normaux ^4,9,10,11. L’ouverture transitoire des pores dans les neurones en développement, par exemple, déclenche la différenciation, tandis que la fermeture du mPTP induit la maturation dans les cardiomyocytes immatures ^4,5.

Bien que l’importance fonctionnelle du PTPm dans la santé et la maladie soit bien établie, son identité moléculaire précise reste débattue. Les progrès réalisés dans la structure moléculaire et la fonction du PTPNm ont fait l’objet d’un examen approfondi ailleurs¹². Brièvement, à l’heure actuelle, les états de conductance élevée et faible du PTP ont été supposés être médiés par des entités distinctes¹². Les principaux candidats sont l’ATP synthase F1/F0 (ATP synthase) et le transporteur de nucléotides d’adénine (ANT) pour les modes de conductance élevée et faible, respectivement¹².

Malgré l’absence de consensus concernant l’identité exacte de la composante formant des pores du PTP, certaines caractéristiques clés ont été détaillées. Une caractéristique bien établie du mPTP est qu’il est régulé par le gradient électrochimique tel que la dépolarisation de l’IMM conduit à l’ouverture des pores¹³. Des travaux antérieurs ont montré que l’état redox des groupes thiol vicinaux modifie la grille de tension du mPTP, de sorte que l’oxydation ouvre le pore à des ΔΨs relativement plus élevés, et que la réduction du groupe thiol entraîne une probabilité mPTP fermée¹⁴. Cependant, l’identité du capteur de tension protéique est inconnue.

Diverses petites molécules qui modulent la probabilité d’ouverture du pore ont été identifiées. Par exemple, le mPTP peut être stimulé pour s’ouvrir avec du calcium, du phosphate inorganique, des acides gras et des ROS et peut être inhibé par les nucléotides d’adénine (en particulier l’ADP), le magnésium, les protons et le CsA ^5,12. Les mécanismes d’action de certains de ces régulateurs ont été élucidés. Le calcium mitochondrial déclenche l’ouverture de la mPTP au moins en partie en se liant à la sous-unité β de l’ATP synthase¹⁵. Ros peut activer le mPTP en diminuant son affinité pour l’ADP et en améliorant son affinité pour la cyclophiline D (CypD), l’activateur protéique mPTP le mieux étudié¹⁶. Le mécanisme d’activation du mPTP par le phosphate inorganique et les acides gras est moins clair. En ce qui concerne les inhibiteurs endogènes, on pense que l’ADP inhibe le mPTP en se liant à l’ANT ou à l’ATP synthase, tandis que le magnésium exerce son effet inhibiteur en déplaçant le calcium de son site de liaison ^15,17,18,19.

Un pH bas inhibe l’ouverture de la mPTP en protonant l’histidine 112 de la sous-unité de la protéine régulatrice de la sensibilité à l’oligomycine (OSCP) de l’ATP synthase 12,20,21. L’inhibiteur pharmacologique prototypique du mPTP, CsA, agit en liant CypD et en empêchant son association avec OSCP^22,23. Des travaux antérieurs ont également montré qu’une variété d’analogues de la CoQ interagissent avec le mPTP, l’inhibant ou l’activant²⁴. Dans des travaux récents, nous avons trouvé des preuves d’une mPTP pathologiquement ouverte, d’une fuite excessive de protons et d’une phosphorylation oxydative inefficace due à un déficit en CoQ dans les mitochondries du cerveau antérieur des bébés souris FXS^{nouveau-nés 25}.

La fermeture du pore avec de la CoQ exogène a bloqué la fuite pathologique de protons et induit la maturité morphologique des épines dendritiques²⁵. Fait intéressant, chez les mêmes animaux, les cardiomyocytes FXS avaient des niveaux excessifs de CoQ et une probabilité de mPTP fermée par rapport aux témoins de type sauvage²⁶. Bien que la cause de ces différences spécifiques aux tissus dans les niveaux de CoQ soit inconnue, les résultats soulignent le concept selon lequel la CoQ endogène est probablement un régulateur clé de la mPTP. Cependant, il existe une lacune majeure dans nos connaissances car le mécanisme d’inhibition médiée par la CoQ de la PTPm reste inconnu.

La régulation du mPTP est un déterminant essentiel de la signalisation cellulaire et de la survie⁴. Ainsi, la détection de l’ouverture de la mPTP dans les mitochondries est essentielle lorsque l’on considère des mécanismes physiopathologiques spécifiques. En règle générale, le seuil d’ouverture des pores à haute conductance est déterminé à l’aide de calcium pour déclencher la transition de perméabilité. Une telle charge en calcium entraîne l’effondrement du potentiel membranaire, le découplage rapide de la phosphorylation oxydative et le gonflement mitochondrial^27,28. Nous avons cherché à développer une méthode pour détecter l’ouverture mPTP à faible conductance in situ, sans l’induire en soi.

L’approche exploite le rôle du mPTP en tant que canal de fuite de protons. Pour ce faire, des électrodes sélectives d’ions de type Clark et TPP⁺ ont été utilisées pour mesurer simultanément la consommation d’oxygène et le potentiel membranaire, respectivement, dans des mitochondries isolées pendant la respiration des fuites²⁹. Le seuil d’ouverture du mPTP a été déterminé par l’apparition d’une inhibition médiée par la CsA de la fuite de protons à des potentiels membranaires spécifiques. En utilisant cette approche, les différences de tension du mPTP dans le contexte de l’excès de CoQ ont été définies avec précision.

Protocole

L’approbation du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Columbia University Medical Center a été obtenue pour toutes les méthodes décrites. Les souris FXS (Fmr1 KO) (FVB.129P2-Pde6b⁺ Tyr^c-ch Fmr1^tm1Cgr/J) et de contrôle (FVB) (FVB.129P2-Pde6b⁺ Tyr^c-ch/AntJ) utilisées comme systèmes modèles pour cette étude ont été acquises commercialement (voir la Table des matériaux). Cinq à onze animaux ont été utilisés dans chaque groupe expérimental. Des souris postnatales de jour 10 (P10) ont été utilisées pour modéliser un point temporel dans la petite enfance humaine.

1. Isolement mitochondrial du cœur de la souris

1. Préparer des tampons pour l’isolement mitochondrial et les expériences de respiration comme décrit dans le tableau 1. Conserver à 4 °C si c’est fait à l’avance.
   1. Préparer un milieu de gradient de densité de 15 % : diluer le milieu de gradient de densité commerciale à 80 % volume/volume (v/v) avec un diluant de gradient de densité. Diluer davantage le milieu de gradient de densité de 80 % à 15 % v/v en ajoutant un tampon d’isolement mitochondrial (IM)/albumine sérique bovine (BSA).
2. Isolez les mitochondries de tissus frais et non congelés pour ces expériences et utilisez-les le jour de la préparation, généralement dans les cinq heures²⁶. Effectuez toutes les étapes d’isolement sur la glace.
   1. Décapitez la souris et excisez le cœur. Laver immédiatement 1 à 2 fois dans une boîte de Petri avec du MI/BSA glacé. Coupez l’oreillette et hachez le tissu.
   2. Transférer le tissu cardiaque haché dans un homogénéisateur verre-verre contenant 1 mL de MI/BSA. Homogénéiser avec un pilon plus lâche (A) (10 coups), puis un pilon plus serré (B) (10 coups).
   3. Centrifuger l’homogénat à 1 100 × g pendant 2 min à 4 °C pour éliminer les débris nucléaires et cellulaires.
   4. Prenez le surnageant doucement sans toucher de granulés moelleux et superposez-le soigneusement sur 700 μL de milieu de gradient de densité de 15% dans un tube de centrifugeuse. Centrifuger à 18 500 × g pendant 15 min à 4 °C.
   5. Remettre la pastille dans 1 mL de tampon de saccharose (SB)/BSA et centrifuger à 10 000 × g pendant 10 min à 4 °C.
   6. Retirez et jetez complètement le surnageant. Remettre en suspension la pastille en SB/BSA jusqu’à un volume final de 55 μL.
   7. Quantifier la teneur en protéines mitochondriales à l’aide d’un test standard tel que le test de la protéine de l’acide bicinchoninique (BCA).

2. Consommation mitochondriale d’oxygène (_O2) et ΔΨ

1. Assemblage et étalonnage des électrodes d’oxygène
   1. Installez et étalonnez l’électrode d’oxygène (voir le tableau des matériaux) conformément aux instructions du fabricant.
      1. Placez une goutte de solution d’électrolyte de chlorure de potassium (KCl) à 50% sur le dôme du disque d’électrode.
      2. Placez un petit morceau ~ 2 cm^{2 espaceur} de papier à cigarette recouvert d’un morceau légèrement plus grand de la membrane de polytétrafluoroéthylène (PTFE) fournie sur la goutte d’électrolyte.
      3. À l’aide de l’outil applicateur fourni, poussez le petit joint torique du disque d’électrode sur le dôme de l’électrode.
         REMARQUE: Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air et que la membrane est lisse.
   2. Remplissez bien le réservoir avec la solution d’électrolyte.
   3. Placez le joint torique plus grand dans le renfoncement autour du disque d’électrode.
   4. Installez le disque dans la chambre à électrodes et connectez-le à l’unité de commande.
   5. Ajouter 2 mL d’eau désionisée saturée d’air à la chambre de réaction et l’aimant revêtu de PTFE à la chambre.
   6. Connectez la chambre à l’arrière de l’unité de commande.
   7. Réglez la température à 37 °C et la vitesse d’agitation à 100.
   8. Prévoyez 10 minutes pour que la température du système s’équilibre avant de commencer l’étalonnage.
   9. Sous l’onglet Étalonnage , sélectionnez Étalonnage de phase liquide pour effectuer l’étalonnage de phase liquide. Vérifiez que la température est réglée sur 37 °C, que la vitesse d’agitation est de 100 et que la pression est réglée sur la pression atmosphérique (101,32 kPa).
   10. Appuyez sur OK et attendez que le signal plafonne.
   11. Lorsqu’un plateau est atteint, appuyez sur OK.
   12. Établissez zéro_O2 dans la chambre en ajoutant une petite quantité (~ 20 mg) de dithionite de sodium.
   13. Appuyez sur OK et attendez que le signal plafonne.
   14. Lorsqu’un plateau est atteint, appuyez sur Enregistrer pour accepter l’étalonnage.
2. Ensemble d’électrodes sélectives TPP⁺
   1. Remplissez l’embout de l’électrode sélective TPP⁺ avec une solution TPP de 10 mM à l’aide de la seringue et de l’aiguille flexible fournies, en prenant soin d’éviter les bulles d’air.
   2. Assemblez l’appareil à électrodes sélectives TPP⁺, y compris l’électrode de référence et le porte-électrode, (voir tableau des matériaux) conformément aux instructions du fabricant.
   3. En bref, desserrez le capuchon du porte-électrode et insérez l’électrode de référence interne dans ^{la pointe} TPP+. Serrez le capuchon pour fixer la pointe. Connectez le câble fourni au porte-électrode et au port auxiliaire du boîtier de commande.
   4. Insérez l’électrode sélective TPP⁺ et les électrodes de référence dans l’ensemble piston adapté pour électrodes sélectives d’ions. Connectez l’électrode de référence à l’orifice de référence du boîtier de commande.
   5. Insérez les électrodes sélectives TPP⁺ et de référence dans l’ensemble piston adapté pour électrodes sélectives d’ions.
3. Préparation de la chambre de réaction
   1. Ajouter le mélange réactionnel à la chambre de réaction : 10 mM de succinate (substrat du complexe II), 5 μM de roténone (inhibiteur du complexe I), 80 ng de nigericine mL⁻¹ (pour réduire le gradient de pH à travers l’IMM), 2,5 μg ^mL-1 oligomycine (pour induire une respiration à l’état 4) et tampon respiratoire (RB)/tampon de réaction BSA à un volume final de 1 mL. Veillez à éviter d’introduire des bulles d’air dans la chambre.
   2. Fermez la chambre avec l’ensemble piston adapté avec le TPP⁺-sélectif et l’électrode de référence en place. Sélectionnez GO pour démarrer l’enregistrement. Une fois la chambre fermée, introduisez des réactifs supplémentaires directement dans la solution réactionnelle à l’aide de microsyringes séparées modifiées avec des tubes en plastique pour ajuster la longueur de l’aiguille.
4. Calibrage TPP⁺
   1. Une fois qu’un signal de tension stable est obtenu, calibrer l’électrode sélective TPP⁺ en ajoutant des incréments de 1 μM d’une solution de TPP de 0,1 mM à une concentration finale de 3 μM. Observez qu’il y a une baisse logarithmique du signal de tension TPP⁺ à chaque ajout.
      REMARQUE: Calibrez l’électrode sélective TPP⁺ au début de chaque expérience.
5. Acquisition de données
   1. Laissez les traces_O2 et TPP⁺ se stabiliser et ajoutez 100 μg de mitochondries cardiomyocytaires fraîchement préparées à la chambre de réaction jusqu’à une concentration finale de 0,1 mg ^mL-1 via le port d’addition de réactif dans l’ensemble piston. Observez la diminution des niveaux d’O₂ dans la chambre à mesure que les mitochondries s’énergisent et consomment de l’O₂ et l’augmentation brusque du signal de tension TPP ⁺ à mesure que les mitochondries génèrent un potentiel membranaire et absorbent le TPP ⁺ de la solution.
   2. Ajouter 2,5 μg ^mL-1 d’oligomycine pour induire une respiration à l’état 4.
      REMARQUE: Les taux de consommation d’O₂ représenteront désormais le taux de respiration par fuite de protons. L’oligomycine peut être ajoutée à la chambre de réaction avant le TPP⁺ comme alternative.
6. Évaluation de la probabilité d’ouverture du mPTP
   1. Observez que ΔΨ diminue avec le temps pendant la respiration des fuites. Une fois que le ΔΨ désiré est atteint, ajouter 1 μM CsA (inhibiteur de mPTP) à la chambre de réaction pour évaluer la probabilité ouverte du mPTP à ce ΔΨ spécifique.
   2. Mesurer l’effet de la CsA sur la consommation d’O2 et de ΔΨ avant et après l’addition de CsA
   3. Déterminer la dépendance de tension de l’ouverture mPTP en faisant varier le ΔΨ auquel CsA est ajouté dans des expériences successives.

Résultats

La consommation typique d’O2 et les courbes ΔΨ générées dans ces expériences sont montrées (Figure 1A,B). La baisse logarithmique du signal de tension avec l’étalonnage TPP⁺ est montrée au début de chaque expérience. L’absence de ce schéma logarithmique peut suggérer un problème avec l’électrode ^sélective TPP+. Les mitochondries génèrent généralement ΔΨ immédiatement après l’ajout au tampon respiratoire. ΔΨ...

Discussion

Cet article décrit une méthode pour évaluer la probabilité d’ouverture du mPTP. Plus précisément, le seuil de tension pour l’ouverture mPTP à faible conductance a été déterminé en évaluant l’effet de l’inhibition de CsA sur la fuite de protons sur une plage de ΔΨs. En utilisant cette technique, nous avons pu identifier des différences dans la grille de tension du mPTP entre les souris FXS et les contrôles FVB compatibles avec leurs différences dans la teneur en CoQ spécifique des tissus. Un él?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Fisher Scientific	15630080
Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1	PP systems	941039
BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft.	Fisher Scientific	14-170-11B	to modify the length of the hamilton synringe as needed
Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free	Sigma	A7030-10G
Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm	World Precision Inst. LLC	DRIREF-2
Electrode Holder for KWIK-Tips	World Precision Inst. LLC	KWIK-2	ion selective electrode holder
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid  (EGTA)	Sigma	324626
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME		FXS mice, Fmr1 KO
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME		FVB mice
Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk	Cole-Parmer	EW-07938-30	microsyringe
Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle	Cole-Parmer	EW-07938-02	microsyringe
Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete	PP systems	OXYTHERM+R	oxygen electrode and software
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma	1374248
Mannitol	Sigma	M9546-250G
P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A)	Sigma	D4022-10MG
Percoll	Sigma	P1644	medium for density gradient separation
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P3911
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	Sigma	5.43841
Sucrose	Sigma	S0389
TPP+ Electrode Tips (3)	World Precision Inst. LLC	TIPTPP