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要約

この方法は、低コンダクタンスプロトンリークに対するミトコンドリア透過性遷移細孔の寄与を利用して、野生型対照と比較して心筋細胞ミトコンドリアコエンザイムQ含量が増加した新生児脆弱X症候群マウスにおける細孔開放の電圧閾値を決定する。

要約

ミトコンドリア透過性遷移孔(mPTP)は、健康と病気に重要な電位依存性の非選択的、内側ミトコンドリア膜(IMM)メガチャネルです。mPTPは、低コンダクタンス開口時にIMMを横切る陽子の漏れを媒介し、シクロスポリンA(CsA)によって特異的に阻害される。コエンザイムQ(CoQ)はmPTPの調節因子であり、脆弱X症候群(FXS、 Fmr1 ノックアウト)の新生児マウスモデルにおける前脳および心臓ミトコンドリアにおけるmPTPのCoQ含有量およびオープン確率において組織特異的な差異が見出されている。我々は、この変異株におけるmPTP開口の電圧閾値を決定する技術を開発し、プロトンリークチャネルとしてのmPTPの役割を利用した。

これを行うために、酸素消費量と膜電位(ΔΨ)は、漏れ呼吸中にポラログラフィーとテトラフェニルホスホニウム(TPP+)イオン選択電極を使用して、単離されたミトコンドリアで同時に測定されました。mPTP開口の閾値は、特定の膜電位におけるプロトンリークのCsA媒介性阻害の開始によって決定された。このアプローチを使用して、mPTPの電圧ゲーティングの違いは、CoQ過剰の文脈で正確に定義されました。この新規技術は、mPTPの低コンダクタンス開口部の生理学的および病理学的調節の理解を深めるための将来の研究を可能にするであろう。

概要

mPTPは透過性遷移(PT)を媒介し、それによってIMMは小分子および溶質1,2に対して突然透過性になる。この顕著な現象は、酸化的リン酸化3に必要な電気化学的勾配を確立するための基本であるIMMの特徴的な不透過性からの明確な逸脱である。PTは、他のミトコンドリア輸送機構とは異なり、高コンダクタンス、非特異的、および非選択的プロセスであり、最大1.5kDa4、5の範囲の分子の通過を可能にする。mPTPはIMM内の電位依存性チャネルであり、その開口部はΔΨ、ATP産生、カルシウム恒常性、活性酸素種(ROS)産生、および細胞生存率4を変化させる。

病理学的極限では、mPTPの制御不能で長期にわたる高コンダクタンス開口部は、電気化学的勾配の崩壊、マトリックス腫脹、マトリックスピリジンヌクレオチドの枯渇、外膜破裂、膜間タンパク質(シトクロムcを含む)の放出、および最終的には細胞死4,6をもたらす。このような病理学的mPTP開口は、心臓虚血・再灌流傷害、心不全、外傷性脳損傷、種々の神経変性疾患、および糖尿病に関与している1、7。しかしながら、低コンダクタンスmPTP開口は本質的に生理学的であり、高コンダクタンス開口とは対照的に、深い脱分極またはミトコンドリア腫脹をもたらさない4。

細孔の低コンダクタンス開口部は、透過性を〜300Daに制限し、ATP合成とは無関係にプロトンの通過を可能にし、そして生理学的プロトンリーク5の潜在的な発生源である。生理学的mPTP開口は、ΔΨの制御された減少を引き起こし、呼吸輸送鎖を通る電子流束を増加させ、スーパーオキシドの短いバーストまたはフラッシュをもたらし、ROSシグナル伝達に寄与する8。このような一過性のmPTP開口の調節は、カルシウム恒常性ならびに正常な細胞発生および成熟にとって重要である4、9、10、11。例えば、発達中のニューロンにおける一過性の細孔開放は分化を誘発し、一方、mPTPの閉鎖は未熟心筋細胞における成熟を誘導する4,5。

健康と疾患におけるmPTPの機能的意義は十分に確立されているが、その正確な分子的同一性は依然として議論されている。mPTPの分子構造と機能に関する進歩は、他の場所で包括的にレビューされている12。簡単に言えば、現在、mPTPの高コンダクタンス状態および低コンダクタンス状態は、別個の実体12によって媒介されると仮定されている。主要な候補は、それぞれ高コンダクタンスモードおよび低コンダクタンスモード用のF1/F0 ATP合成酵素(ATP合成酵素)およびアデニンヌクレオチドトランスポーター(ANT)である12。

mPTPの孔形成成分の正確な同一性に関するコンセンサスの欠如にもかかわらず、特定の重要な特性が詳述されている。mPTPの十分に確立された特徴は、IMMの脱分極が細孔開口部13につながるように電気化学的勾配によって調節されることである。以前の研究は、ビシナルチオール基の酸化還元状態がmPTPの電圧ゲーティングを変化させ、酸化が比較的高いΔΨsで細孔を開き、チオール基の減少が閉mPTP確率をもたらすことを示している14。しかしながら、タンパク質性電圧センサの同一性は不明である。

細孔の開放確率を調節する様々な小分子が同定されている。例えば、mPTPは、カルシウム、無機リン酸、脂肪酸、およびROSで開くように刺激することができ、アデニンヌクレオチド(特にADP)、マグネシウム、プロトン、およびCsA5、12によって阻害され得る。これらの調節因子のいくつかの作用機序が解明されている。ミトコンドリアカルシウムは、ATP合成酵素15のβサブユニットに結合することによって少なくとも部分的にmPTP開口を誘発する。ROSは、ADPに対する親和性を低下させ、最も研究されたタンパク質性mPTP活性化剤16であるサイクロフィリンD(CypD)に対する親和性を増強することによって、mPTPを活性化することができる。無機リン酸や脂肪酸によるmPTPの活性化のメカニズムはあまり明らかではない。内因性阻害剤については、ADPはANTまたはATP合成酵素で結合することによってmPTPを阻害すると考えられ、マグネシウムはその結合部位からカルシウムを置換することによってその阻害効果を発揮すると考えられている15,17,18,19。

低pHは、ATP合成酵素12、20、21の調節オリゴマイシン感受性付与タンパク質(OSCP)サブユニットのヒスチジン112をプロトン化することによってmPTP開口を阻害する。mPTPのプロトタイプ薬理学的阻害剤であるCsAは、CypDを結合させ、OSCP22,23との会合を予防することによって作用する。これまでの研究はまた、様々なCoQ類似体がmPTPと相互作用し、それを阻害または活性化することを示した24。最近の研究では、新生児FXSマウス仔の前脳ミトコンドリアにおけるCoQ欠損による病理学的に開放的なmPTP、過剰なプロトン漏出、および非効率的な酸化的リン酸化の証拠を発見した25。

外因性CoQによる細孔の閉鎖は、病的陽子漏出を遮断し、樹状突起棘25の形態学的成熟を誘導した。興味深いことに、同じ動物において、FXS心筋細胞は、野生型対照と比較して過剰なCoQレベルおよび閉mPTP確率を有していた26。CoQレベルのこれらの組織特異的な差異の原因は不明であるが、この知見は、内因性CoQがmPTPの主要な調節因子である可能性が高いという概念を強調している。しかし、mPTPのCoQ媒介性阻害のメカニズムは不明のままであるため、我々の知識には大きなギャップがある。

mPTPの調節は、細胞シグナル伝達および生存の重要な決定因子である4。したがって、ミトコンドリア内のmPTP開口部を検出することは、特定の病態生理学的メカニズムを考える際に重要である。典型的には、高コンダクタンス細孔開口の閾値は、透過性遷移をトリガするためにカルシウムを用いて決定される。このようなカルシウム負荷は、膜電位の崩壊、酸化的リン酸化の急速な脱結合、およびミトコンドリア腫脹27、28をもたらす。我々は、低コンダクタンスmPTPの開口部を その場で、 それ自体を誘導することなく検出する方法の開発を目指し た。

このアプローチは、プロトンリークチャネルとしてのmPTPの役割を利用する。そうするために、クラーク型およびTPP+ イオン選択電極を用いて、漏出呼吸中の単離ミトコンドリアにおける酸素消費量および膜電位をそれぞれ同時に測定した29。mPTP開口の閾値は、特定の膜電位におけるプロトンリークのCsA媒介性阻害の開始によって決定された。このアプローチを用いて、CoQ過剰の文脈におけるmPTPの電圧ゲーティングの違いが正確に定義された。

プロトコル

コロンビア大学医療センターの施設動物ケアおよび使用委員会の承認は、記載されたすべての方法について得られた。本研究のモデル系として用いたFXS(Fmr1 KO)(FVB.129P2-Pde6b+Tyr c-ch Fmr1tm1Cgr/J)および対照(FVB)(FVB.129P2-Pde6b+Tyrc-ch/AntJ)マウスを商業的に取得した(材料表参照)。各実験群で5~11匹を用いた。生後10日目(P10)マウスを、ヒト乳児期の時点についてモデル化するために使用した。

1. マウス心臓からのミトコンドリア隔離

  1. 表1に記載したようにミトコンドリア単離および呼吸実験のための緩衝液を調製する。予めなしておけば4°Cで保存してください。
    1. 15%密度勾配培地を調製する:市販の密度勾配培地を密度勾配希釈剤で80%体積/体積(v/v)に希釈する。さらにミトコンドリア分離バッファー(MI)/ウシ血清アルブミン(BSA)を加えて80%密度勾配培地を15%v/v希釈する。
  2. これらの実験のために、凍結されていない新鮮な組織からミトコンドリアを単離し、調製当日、典型的には5時間以内に使用する26。氷上ですべての隔離ステップを実行します。
    1. マウスを斬首し、心臓を切除する。直ちに氷冷MI / BSAでペトリ皿で1〜2回洗ってください。心房を切り取り、組織をミンチにする。
    2. ミンチした心臓組織を、1mLのMI/BSAを含むガラスガラスホモジナイザーに移す。より緩い(A)乳棒(10ストローク)で均質化し、次によりタイトな(B)乳棒(10ストローク)で均質化する。
    3. ホモジネートを1,100 × g で4°Cで2分間遠心分離し、核および細胞破片を除去した。
    4. 上清をふわふわのペレットに触れることなく優しく取り、遠沈管内の700μLの15%密度勾配培地の上に慎重に重ねます。18,500 × g で4°Cで15分間遠心分離機。
    5. ペレットを1 mLのスクロース緩衝液(SB)/BSAに再懸濁し、10,000 × g で4°Cで10分間遠心分離した。
    6. 上清を完全に取り除いて捨てる。ペレットをSB/BSAに再懸濁し、最終容量55 μLにする。
    7. ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイなどの標準的なアッセイを使用して、ミトコンドリアタンパク質含有量を定量する。

2. ミトコンドリア酸素(O2)消費量とΔΨ

  1. 酸素電極アセンブリとキャリブレーション
    1. 製造元の指示に従って酸素電極( 材料表を参照)をセットアップして校正します。
      1. 50%塩化カリウム(KCl)電解質溶液を電極ディスクのドームの上に置きます。
      2. 電解質滴の上に、提供されたポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜のわずかに大きい部分で覆われた〜2cm2 のタバコ紙スペーサーの小片を置く。
      3. 付属のアプリケーターツールを使用して、小さな電極ディスクOリングを電極のドームに押し込みます。
        メモ: 気泡がなく、膜が滑らかであることを確認します。
    2. リザーバを電解液でよく補充します。
    3. 大きなOリングを電極ディスクの周りの凹部によく置きます。
    4. ディスクを電極室に取り付け、コントロールユニットに接続します。
    5. 2mLの空気飽和脱イオン水を反応チャンバに加え、PTFEコーティングされた磁石をチャンバに加える。
    6. チャンバーをコントロールユニットの背面に接続します。
    7. 温度を37°C、攪拌速度を100に設定してください。
    8. 校正を開始する前に、システム温度が平衡化するまで10分間待ちます。
    9. 「キャリブレーション」タブで、「液相キャリブレーション」を選択して液相キャリブレーションを実行します。 温度が37°Cに設定され、攪拌速度が100、圧力が大気圧(101.32kPa)に設定されていることを確認します。
    10. OKを押して、信号がプラトーするのを待ちます。
    11. プラトーに達したら、 OKを押します。
    12. 少量(〜20mg )の亜ジチオン酸ナトリウムを添加することによってチャンバ内にゼロO2を確立する。
    13. OKを押して、信号がプラトーするのを待ちます。
    14. プラトーに達したら、[ 保存] を押してキャリブレーションを受け入れます。
  2. TPP+選択的電極アセンブリ
    1. TPP+-選択的電極チップに、付属のシリンジと柔軟な針を使用して10 mM TPP溶液を充填し、気泡を避けるように注意してください。
    2. 参照電極と電極ホルダーを含むTPP+選択電極装置( 材料表を参照)を製造元の指示に従って組み立てます。
    3. 簡単に説明すると、電極ホルダーのキャップを緩め、内部参照電極をTPP+チップに挿入します。キャップを締めて先端を固定します。付属のケーブルを電極ホルダーとコントロールボックスの補助ポートに接続します。
    4. TPP+選択電極と参照電極をイオン選択電極用に適合したプランジャーアセンブリに挿入します。参照電極をコントロールボックスの参照ポートに接続します。
    5. TPP+選択電極と参照電極をイオン選択電極用の適合プランジャーアセンブリに挿入します。
  3. 反応室の準備
    1. 反応混合物を反応チャンバに加える:10 mM コハク酸塩 (複合体 II 基質)、5 μM ロテノン (複合体 I 阻害剤)、80 ng mL-1 ニゲリシン (IMM を横切る pH 勾配を崩壊させるため)、2.5 μg mL-1 オリゴマイシン (状態 4 呼吸を誘導するため)、および呼吸バッファー (RB)/BSA 反応バッファーを最終容量 1 mL にします。チャンバーに気泡を導入しないように注意してください。
    2. TPP+選択的および参照電極を所定の位置に取り付けた適合プランジャーアセンブリでチャンバを閉じます。[ GO ] を選択して記録を開始します。チャンバーが閉じられたら、プラスチックチューブで修正された別々のマイクロシリンジを使用して、追加の試薬を反応液に直接導入して針の長さを調整します。
  4. TPP+ キャリブレーション
    1. 安定した電圧信号が得られたら、0.1 mM TPP溶液を終濃度3 μMまで1 μM刻みで加えて、TPP+選択電極を較正します。TPP+ 電圧信号が加算されるたびに対数的に低下することを確認します。
      注: TPP+選択電極は、各実験の開始時に較正してください。
  5. データ集録
    1. O2およびTPP+微量を安定化させ、プランジャーアセンブリの試薬添加口を介して、調製しかけたばかりの心筋細胞ミトコンドリア100μgを反応チャンバに終濃度0.1mg mL-1まで加える。ミトコンドリアが通電してO2を消費するにつれてチャンバー内のO2レベルが低下し、ミトコンドリアが膜電位を生成して溶液からTPP+を取り込むにつれてTPP+電圧信号が急激に増加するのを観察します。
    2. 2.5 μg mL-1 オリゴマイシンを加え、状態4呼吸を誘導する。
      注:O2 消費率は、プロトン漏れ呼吸の速度を表すようになりました。オリゴマイシンは、代替としてTPP+ の前に反応チャンバに添加することができる。
  6. mPTPのオープン確率の評価
    1. リーク呼吸中にΔΨが時間の経過とともに減少することを確認します。所望のΔΨに達したら、1μM CsA(mPTP阻害剤)を反応チャンバに追加して、その特定のΔΨにおけるmPTPの開放確率を評価する。
    2. CsA添加前後のO2 消費量とΔΨに対するCsAの影響を測定する
    3. 連続した実験でCsAが加えられるΔΨを変化させることによって、mPTP開口部の電圧依存性を決定する。

結果

これらの実験で生成された典型的なO2消費量およびΔΨ曲線が示されている(図1A、B)。TPP+キャリブレーションによる電圧信号の対数低下は、各実験の開始時に示されています。この対数パターンがないことは、TPP+選択電極の問題を示唆している可能性がある。ミトコンドリアは、典型的には、呼吸緩衝液への添加直後にΔΨを生成する...

ディスカッション

本稿では、mPTPのオープン確率を評価する方法について述べる。具体的には、低コンダクタンスmPTPオープニングの電圧閾値は、ΔΨの範囲にわたるプロトンリークに対するCsA阻害の影響を評価することによって決定された。この技術を用いて、FXSマウスとFVB対照との間のmPTPの電圧ゲーティングの違いを、組織特異的CoQ含量の違いと一致するように同定することができた。この方法論の成功に不...

開示事項

著者らは、開示する利益相反はありません。

謝辞

NIH/NIGMS T32GM008464(K.K.G.)、コロンビア大学アーヴィング医療センター麻酔科への機会プロボスト目標賞(K.K.G.)、小児麻酔学会若手研究者研究賞(K.K.G.)、NIH/NINDS R01NS112706(R.J.L.)

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Fisher Scientific15630080
Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1PP systems941039
BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft.Fisher Scientific14-170-11Bto modify the length of the hamilton synringe as needed
Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid freeSigmaA7030-10G
Dri-Ref Reference Electrode, 2 mmWorld Precision Inst. LLCDRIREF-2
Electrode Holder for KWIK-TipsWorld Precision Inst. LLCKWIK-2 ion selective electrode holder
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid  (EGTA)Sigma324626
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/JJackson Laboratory, Bar Harbor, MEFXS mice, Fmr1 KO 
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJJackson Laboratory, Bar Harbor, MEFVB mice
Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pkCole-ParmerEW-07938-30microsyringe
Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-NeedleCole-ParmerEW-07938-02microsyringe
Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) CompletePP systemsOXYTHERM+Roxygen electrode and software
Magnesium Chloride (MgCl2)Sigma1374248
MannitolSigmaM9546-250G
P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A)SigmaD4022-10MG
PercollSigmaP1644medium for density gradient separation
Potassium chloride (KCl)SigmaP3911
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)Sigma5.43841
SucroseSigmaS0389
TPP+ Electrode Tips (3)World Precision Inst. LLCTIPTPP

参考文献

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