コエンザイムQ過剰の設定におけるミトコンドリア透過性転移細孔の開放確率の評価

要約

この方法は、低コンダクタンスプロトンリークに対するミトコンドリア透過性遷移細孔の寄与を利用して、野生型対照と比較して心筋細胞ミトコンドリアコエンザイムQ含量が増加した新生児脆弱X症候群マウスにおける細孔開放の電圧閾値を決定する。

要約

ミトコンドリア透過性遷移孔(mPTP)は、健康と病気に重要な電位依存性の非選択的、内側ミトコンドリア膜(IMM)メガチャネルです。mPTPは、低コンダクタンス開口時にIMMを横切る陽子の漏れを媒介し、シクロスポリンA(CsA)によって特異的に阻害される。コエンザイムQ(CoQ)はmPTPの調節因子であり、脆弱X症候群(FXS、 Fmr1 ノックアウト)の新生児マウスモデルにおける前脳および心臓ミトコンドリアにおけるmPTPのCoQ含有量およびオープン確率において組織特異的な差異が見出されている。我々は、この変異株におけるmPTP開口の電圧閾値を決定する技術を開発し、プロトンリークチャネルとしてのmPTPの役割を利用した。

これを行うために、酸素消費量と膜電位(ΔΨ)は、漏れ呼吸中にポラログラフィーとテトラフェニルホスホニウム(TPP⁺)イオン選択電極を使用して、単離されたミトコンドリアで同時に測定されました。mPTP開口の閾値は、特定の膜電位におけるプロトンリークのCsA媒介性阻害の開始によって決定された。このアプローチを使用して、mPTPの電圧ゲーティングの違いは、CoQ過剰の文脈で正確に定義されました。この新規技術は、mPTPの低コンダクタンス開口部の生理学的および病理学的調節の理解を深めるための将来の研究を可能にするであろう。

概要

mPTPは透過性遷移(PT)を媒介し、それによってIMMは小分子および溶質^1,2に対して突然透過性になる。この顕著な現象は、酸化的リン酸化³に必要な電気化学的勾配を確立するための基本であるIMMの特徴的な不透過性からの明確な逸脱である。PTは、他のミトコンドリア輸送機構とは異なり、高コンダクタンス、非特異的、および非選択的プロセスであり、最大1.5kDa4^、5の範囲の分子の通過を可能にする。mPTPはIMM内の電位依存性チャネルであり、その開口部はΔΨ、ATP産生、カルシウム恒常性、活性酸素種(ROS)産生、および細胞生存率⁴を変化させる。

病理学的極限では、mPTPの制御不能で長期にわたる高コンダクタンス開口部は、電気化学的勾配の崩壊、マトリックス腫脹、マトリックスピリジンヌクレオチドの枯渇、外膜破裂、膜間タンパク質(シトクロムcを含む)の放出、および最終的には細胞死^4,6をもたらす。このような病理学的mPTP開口は、心臓虚血・再灌....

プロトコル

コロンビア大学医療センターの施設動物ケアおよび使用委員会の承認は、記載されたすべての方法について得られた。本研究のモデル系として用いたFXS(Fmr1 KO)(FVB.129P2-Pde6b⁺Tyr c-ch Fmr1^tm1Cgr/J)および対照(FVB)(FVB.129P2-Pde6b⁺Tyr^c-ch/AntJ)マウスを商業的に取得した(材料表参照)。各実験群で5~11匹を用いた。生後10日目(P10)マウスを、ヒト乳児期の時点についてモデル化するために使用した。

1. マウス心臓からのミトコンドリア隔離

1. 表1に記載したようにミトコンドリア単離および呼吸実験のための緩衝液を調製する。予めなしておけば4°Cで保存してください。
   1. 15%密度勾配培地を調製する:市販の密度勾配培地を密度勾配希釈剤で80%体積/体積(v/v)に希釈する。さらにミトコンドリア分離バッファー(MI)/ウシ血清アルブミン(BSA)を加えて80%密度勾配培地を15%v/v希釈する。
2. これらの実験のために、凍結されていない新鮮な組織からミトコンドリアを単離し、調製当日、典型的には5時間以内に使用する

結果

これらの実験で生成された典型的な_O2消費量およびΔΨ曲線が示されている(図1A、B)。TPP⁺キャリブレーションによる電圧信号の対数低下は、各実験の開始時に示されています。この対数パターンがないことは、TPP⁺選択電極の問題を示唆している可能性がある。ミトコンドリアは、典型的には、呼吸緩衝液への添加直後にΔΨを生成する.......

ディスカッション

本稿では、mPTPのオープン確率を評価する方法について述べる。具体的には、低コンダクタンスmPTPオープニングの電圧閾値は、ΔΨの範囲にわたるプロトンリークに対するCsA阻害の影響を評価することによって決定された。この技術を用いて、FXSマウスとFVB対照との間のmPTPの電圧ゲーティングの違いを、組織特異的CoQ含量の違いと一致するように同定することができた。この方法論の成功に不.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Fisher Scientific	15630080
Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1	PP systems	941039
BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft.	Fisher Scientific	14-170-11B	to modify the length of the hamilton synringe as needed
Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free	Sigma	A7030-10G
Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm	World Precision Inst. LLC	DRIREF-2
Electrode Holder for KWIK-Tips	World Precision Inst. LLC	KWIK-2	ion selective electrode holder
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid  (EGTA)	Sigma	324626
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME		FXS mice, Fmr1 KO
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME		FVB mice
Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk	Cole-Parmer	EW-07938-30	microsyringe
Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle	Cole-Parmer	EW-07938-02	microsyringe
Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete	PP systems	OXYTHERM+R	oxygen electrode and software
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma	1374248
Mannitol	Sigma	M9546-250G
P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A)	Sigma	D4022-10MG
Percoll	Sigma	P1644	medium for density gradient separation
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P3911
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	Sigma	5.43841
Sucrose	Sigma	S0389
TPP+ Electrode Tips (3)	World Precision Inst. LLC	TIPTPP