코엔자임 Q 과량의 설정에서 미토콘드리아 투과성 전이 기공의 개방 확률의 평가

요약

이 방법은 야생형 대조군에 비해 증가된 심근세포 미토콘드리아 코엔자임 Q 함량을 갖는 신생아 깨지기 쉬운 X 증후군 마우스에서 기공 개방에 대한 전압 역치를 결정하기 위해 낮은 전도도 양성자 누출에 대한 미토콘드리아 투과성 전이 기공의 기여를 이용한다.

초록

미토콘드리아 투과성 전이 공극(mPTP)은 건강 및 질병에 중요한 전압-게이팅된, 비선택적, 내부 미토콘드리아 막(IMM) 메가채널이다. mPTP는 저전도도 개방 동안 IMM을 통한 양성자의 누출을 매개하고 사이클로스포린 A(CsA)에 의해 특별히 억제된다. 코엔자임 Q (CoQ)는 mPTP의 조절자이며, 조직 특이적 차이는 깨지기 쉬운 X 증후군 (FXS, Fmr1 녹아웃)의 신생아 마우스 모델에서 전뇌 및 심장 미토콘드리아에서 CoQ 함량 및 mPTP의 개방 확률에서 발견되었다. 우리는이 돌연변이 균주에서 mPTP 개방에 대한 전압 임계 값을 결정하는 기술을 개발하여 양성자 누출 채널로서의 mPTP의 역할을 이용했습니다.

이를 위해, 산소 소비 및 막 전위(ΔΨ)를 편광 촬영과 누설 호흡 동안 테트라페닐포스포늄(TPP⁺) 이온 선택성 전극을 사용하여 분리된 미토콘드리아에서 동시에 측정하였다. mPTP 개방에 대한 역치는 특정 막 전위에서 양성자 누출의 CsA 매개 억제의 개시에 의해 결정되었다. 이 접근법을 사용하여, mPTP의 전압 게이팅의 차이는 CoQ 과잉의 맥락에서 정확하게 정의되었다. 이 새로운 기술은 mPTP의 저전도도 개방의 생리적 및 병리학적 조절에 대한 이해를 증진시키기 위한 미래의 조사를 가능하게 할 것이다.

서문

mPTP는 투과성 전이 (PT)를 매개하고, 이에 의해 IMM은 소분자 및 용질 ^1,2에 갑작스럽게 투과성이된다. 이러한 현저한 현상은 산화적 인산화3에 필요한 전기화학적 구배를 확립하는데 근본적인 IMM의 특성 불투과성으로부터 뚜렷한 출발^이다. PT는 다른 미토콘드리아 수송 메커니즘과 달리 높은 전도도, 비특이적, 비선택적 과정으로, 최대 1.5^kDa4,5의 다양한 분자의 통과를 허용^한다. mPTP는 IMM 내의 전압 게이트 채널로, 개구부가 ΔΨ, ATP 생산, 칼슘 항상성, 반응성 산소 종 (ROS) 생산 및 세포 생존력⁴를 변경합니다.

병리학적 극단에서, mPTP의 조절되지 않고 장기간의 고전도도 개방은 전기화학적 구배의 붕괴, 매트릭스 팽윤, 매트릭스 피리딘 뉴클레오티드의 고갈, 외막 파열, 막간 단백질(시토크롬 c 포함)의 방출, 및 궁극적으로는 세포 사멸 ^4,6을 야기한다. 이러한 병리학적 mPTP 개방은 심장 허혈-재관류 손상, 심부전, 외상성 뇌 손상, 다양한 신경퇴행성 질환, 및 당뇨병 ^1,7에 연루되어 있다. 그러나, 저-전도도 mPTP 개방은 본질적으로 생리학적이며, 고전도도 개방과는 달리, 심오한 탈분극 또는 미토콘드리아 팽윤을 초래하지 않는다⁴.

기공의 낮은 전도도 개방은 투과성을 ~300 Da로 제한하고, ATP 합성과 무관하게 양성자의 통과를 허용하며, 생리학적 양성자 누출의 잠재적 원인이다⁽⁵). 생리학적 mPTP 개방은 ΔΨ의 제어된 감소를 야기하고, 호흡 수송 사슬을 통한 전자 플럭스를 증가시키며, 수퍼옥사이드의 짧은 버스트 또는 플래시를 초래하여, ROS 신호전달⁽⁸)에 기여한다. 이러한 일시적인 mPTP 개방의 조절은 칼슘 항상성 및 정상적인 세포 발달 및 성숙 4,9,10,11에 중요하다. 예를 들어, 발달하는 뉴런에서의 일시적인 기공 개방은 분화를 촉발시키는 반면, mPTP의 폐쇄는 미성숙 심근세포 ^4,5에서 성숙을 유도한다.

건강과 질병에서 mPTP의 기능적 중요성은 잘 확립되어 있지만, 정확한 분자 정체성은 여전히 논쟁의 여지가있다. mPTP의 분자 구조 및 기능에 대한 진행은 다른 곳(¹²)에서 종합적으로 검토되었다. 간략하게, 현재, mPTP의 높은- 및 낮은- 전도도 상태는 별개의 엔티티(¹²)에 의해 매개되는 것으로 가정되었다. 주요 후보는 각각 고전도도 및 저전도도 모드용 F1/F0 ATP 신타제(ATP 합성효소) 및 아데닌 뉴클레오티드 수송체(ANT)(¹²)이다.

mPTP의 기공 형성 성분의 정확한 동일성에 관한 합의가 결여되어 있음에도 불구하고, 특정 주요 특성이 상세화되었다. mPTP의 잘 확립된 특징은 IMM의 탈분극이 기공 개구(¹³)로 이어지도록 전기화학적 구배에 의해 조절된다는 것이다. 선행 연구는 vicinal 티올기의 산화환원 상태가 mPTP의 전압 게이팅을 변화시켜 산화가 상대적으로 더 높은 ΔΨs에서 기공을 개방하고, 티올기 감소가 닫힌 mPTP 확률¹⁴를 초래한다는 것을 보여주었다. 그러나, 단백질성 전압 센서의 동일성은 알려져 있지 않다.

기공의 개방 확률을 조절하는 다양한 소분자가 확인되었다. 예를 들어, mPTP는 칼슘, 무기 포스페이트, 지방산 및 ROS로 개방되도록 자극될 수 있고, 아데닌 뉴클레오티드 (특히 ADP), 마그네슘, 양성자, 및 CsA ^5,12에 의해 억제될 수 있다. 이러한 규제 기관 중 일부의 작용 메커니즘이 해명되었습니다. 미토콘드리아 칼슘은 ATP 신타제¹⁵의 β 서브유닛에 결합함으로써 적어도 부분적으로 mPTP 개방을 촉발시킨다. ROS는 ADP에 대한 그의 친화도를 감소시키고 가장 잘 연구된 단백질성 mPTP 활성화제¹⁶인 사이클로필린 D(CypD)에 대한 그의 친화도를 향상시킴으로써 mPTP를 활성화시킬 수 있다. 무기 포스페이트 및 지방산에 의한 mPTP의 활성화 메카니즘은 덜 명확하다. 내인성 억제제에 관해서는, ADP는 ANT 또는 ATP 합성 효소에서 결합함으로써 mPTP를 억제하는 것으로 생각되며, 마그네슘은 결합 부위^15,17,18,19에서 칼슘을 대체함으로써 억제 효과를 발휘합니다.

낮은 pH는 ATP 신타제 12,20,21의 조절 올리고마이신 감수성 부여 단백질 (OSCP) 서브유닛의 양성자화 히스티딘¹¹²에 의해 mPTP 개방을 억제^한다. mPTP의 원형 약리학적 억제제인 CsA는 CypD에 결합하고 OSCP^22,23과의 연관성을 방지함으로써 작용한다. 이전의 연구는 또한 다양한 CoQ 유사체가 mPTP와 상호작용하여, 이를 억제하거나 활성화시킨다는 것을 보여주었다⁽²⁴). 최근 연구에서, 우리는 신생아 FXS 마우스 새끼²⁵의 전뇌 미토콘드리아의 CoQ 결핍으로 인한 병리학 적으로 개방 된 mPTP, 과도한 양성자 누출 및 비효율적 인 산화 인산화의 증거를 발견했습니다.

외인성 CoQ를 사용한 기공의 폐쇄는 병리학적 양성자 누출을 차단하고 수지상 척추(²⁵)의 형태학적 성숙을 유도하였다. 흥미롭게도, 동일한 동물에서, FXS 심근세포는 야생형 대조군²⁶에 비해 과도한 CoQ 수준과 폐쇄된 mPTP 확률을 가졌다. CoQ 수준의 이러한 조직 특이적 차이의 원인은 알려지지 않았지만, 연구 결과는 내인성 CoQ가 mPTP의 핵심 조절자일 가능성이 높다는 개념을 강조합니다. 그러나, mPTP의 CoQ 매개 억제 메카니즘이 알려지지 않았기 때문에 우리의 지식에 큰 차이가 있다.

mPTP의 조절은 세포 신호전달 및 생존의 결정인자⁴이다. 따라서, 미토콘드리아 내에서 mPTP 개방을 검출하는 것은 특정 병리생리학적 메카니즘을 고려할 때 중요하다. 전형적으로, 고전도도 공극 개방에 대한 역치는 투과성 전이를 촉발시키기 위해 칼슘을 사용하여 결정된다. 이러한 칼슘 로딩은 막 전위의 붕괴, 산화적 인산화의 신속한 결합해제, 및 미토콘드리아 팽윤^27,28을 초래한다. 우리는 저전도도 mPTP 개구부를 그 자체로 유도하지 않고 현장에서 검출하는 방법을 개발하고자 노력했습니다.

이 접근법은 양성자 누출 채널로서의 mPTP의 역할을 이용한다. 이를 위해, Clark-Type 및 TPP⁺ 이온 선택성 전극을 사용하여 누출 호흡⁽²⁹) 동안 분리된 미토콘드리아에서 각각 산소 소비량과 막 전위를 동시에 측정하였다. mPTP 개방에 대한 역치는 특정 막 전위에서 양성자 누출의 CsA 매개 억제의 개시에 의해 결정되었다. 이 접근법을 사용하여, CoQ 초과의 맥락에서 mPTP의 전압 게이팅의 차이가 정확하게 정의되었다.

프로토콜

컬럼비아 대학 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회 승인은 설명 된 모든 방법에 대해 획득되었습니다. 본 연구를 위한 모델 시스템으로 사용된 FXS(Fmr1KO)(FVB.129P2-Pde6b+ Tyr c-ch Fmr1tm1Cgr/J) 및 대조군(FVB)(FVB.129P2-Pde6b⁺ Tyr^c-ch/AntJ) 마우스는 상업적으로 획득되었다(물자의 표 참조). 다섯 마리 내지 열한 마리의 동물을 각 실험군에 사용하였다. 출생 후 10일째(P10) 마우스를 인간 유아기의 시점 동안 모델링하기 위해 사용하였다.

1. 마우스 심장으로부터의 미토콘드리아 분리

1. 표 1에 기재된 바와 같이 미토콘드리아 분리 및 호흡 실험을 위한 완충액을 준비한다. 미리 만든 경우 4°C에서 보관한다.
   1. 15 % 밀도 구배 매체를 준비하십시오 : 상업용 밀도 구배 매질을 밀도 구배 희석제로 80 % 부피 / 부피 (v / v)로 희석하십시오. 미토콘드리아 분리 완충액 (MI) / 소 혈청 알부민 (BSA)을 추가하여 80 % 밀도 구배 배지 15 % v / v를 추가로 희석하십시오.
2. 이러한 실험을 위해 미토콘드리아를 냉동되지 않은 신선한 조직으로부터 분리하고 준비 당일, 전형적으로 5시간 이내에²⁶시간 이내에 사용한다. 얼음 위에서 모든 격리 단계를 수행하십시오.
   1. 마우스를 무력화시키고 심장을 절제하십시오. 즉시 얼음처럼 차가운 MI / BSA로 페트리 접시에서 1-2 번 씻으십시오. 아트리움을 자르고 조직을 다듬습니다.
   2. 다진 심장 조직을 1mL의 MI/BSA가 들어있는 유리 균질기로 옮깁니다. 느슨한 (A) 유모 (10 스트로크)로 균질화 한 다음 더 단단한 (B) 유모 (10 스트로크)로 균질화하십시오.
   3. 균질액을 4°C에서 2분 동안 1,100 × g 에서 원심분리하여 핵 및 세포 파편을 제거하였다.
   4. 상층액을 푹신한 펠렛을 만지지 않고 부드럽게 취하고, 원심분리 튜브에서 15% 밀도 구배 배지 중 700 μL의 상부에 조심스럽게 겹쳐서 겹쳐준다. 4°C에서 15분 동안 18,500 × g 에서 원심분리한다.
   5. 펠렛을 1 mL의 수크로오스 완충액(SB)/BSA에 재현탁시키고, 4°C에서 10분 동안 10,000 × g 에서 원심분리하였다.
   6. 상층액을 완전히 제거하고 버립니다. 펠렛을 SB/BSA에 55 μL의 최종 부피로 재현탁시킨다.
   7. 비신코닌산(BCA) 단백질 분석법과 같은 표준 검정을 사용하여 미토콘드리아 단백질 함량을 정량한다.

2. 미토콘드리아 산소(_O2) 소비 및 ΔΨ

1. 산소 전극 조립 및 교정
   1. 제조업체의 지침에 따라 산소 전극을 설치하고 교정 하십시오 (재료 표 참조).
      1. 50% 염화칼륨(KCl) 전해질 용액을 전극 디스크의 돔 위에 떨어뜨립니다.
      2. 제공된 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 막의 약간 더 큰 조각으로 덮인 작은 조각∼2^cm2 담배 종이 스페이서를 전해질 방울 위에 놓는다.
      3. 제공된 어플리케이터 도구를 사용하여 작은 전극 디스크 O 링을 전극의 돔 위로 밀어 넣습니다.
         참고: 기포가 없고 멤브레인이 매끄럽게 되어 있는지 확인하십시오.
   2. 전해질 용액으로 저수지를 잘 보충하십시오.
   3. 더 큰 O-링을 전극 디스크 주위의 오목부에 잘 놓습니다.
   4. 디스크를 전극 챔버에 설치하고 제어 장치에 연결하십시오.
   5. 공기 포화 탈이온수 2 mL를 반응 챔버에 첨가하고 PTFE 코팅 자석을 챔버에 첨가한다.
   6. 챔버를 제어 장치의 후면에 연결합니다.
   7. 온도를 37°C로 설정하고 교반 속도를 100으로 설정합니다.
   8. 교정을 시작하기 전에 시스템 온도가 평형화될 때까지 10분 정도 기다립니다.
   9. 교정 탭에서 액상 교정을 선택하여 액상 교정을 수행합니다. 온도가 37°C로 설정되고, 교반 속도가 100이고, 압력이 대기압(101.32 kPa)으로 설정되어 있는지 확인합니다.
   10. OK를 누르고 신호가 고원이 될 때까지 기다립니다.
   11. 고원에 도달하면 OK를 누릅니다.
   12. 소량 (∼₂₀ mg)의 나트륨 디티오나이트를 첨가하여 챔버 내에 O2제로 확립한다.
   13. OK를 누르고 신호가 고원이 될 때까지 기다립니다.
   14. 고원에 도달하면 저장을 눌러 보정을 수락합니다.
2. TPP⁺-선택적 전극 어셈블리
   1. 제공된 주사기 및 유연한 바늘을 사용하여 TPP⁺- 선택적 전극 팁을 10 mM TPP 용액으로 채우고 기포를 피하기 위해 주의하십시오.
   2. 기준 전극 및 전극 홀더를 포함하는 TPP⁺-선택적인 전극 장치를 제조자의 지시에 따라 조립한다( 재료 표 참조).
   3. 간단히 설명하면, 전극 홀더 캡을 풀고 내부 기준 전극을 TPP⁺ 팁에 삽입합니다. 뚜껑을 조여서 팁을 고정시킵니다. 제공된 케이블을 전극 홀더와 컨트롤 박스의 보조 포트에 연결합니다.
   4. TPP⁺ 선택 전극 및 기준 전극을 이온 선택성 전극을 위한 적응된 플런저 어셈블리에 삽입합니다. 컨트롤 박스의 기준 포트에 참조 전극을 연결합니다.
   5. TPP⁺ 선택 및 기준 전극을 이온 선택성 전극을 위한 적응된 플런저 어셈블리에 삽입합니다.
3. 반응 챔버 준비
   1. 반응 혼합물을 반응 챔버에 첨가한다: 10 mM 숙시네이트 (복합체 II 기질), 5 μM 로테논 (복합체 I 억제제), 80 ng mL-1 니게리신 (IMM을 가로질러 pH 구배를 붕괴시키기 위해), 2.5 μg ^mL-1 올리고마이신 (상태 4 호흡을 유도하기 위해), 및 호흡 완충액 (RB)/BSA 반응 완충액을 최종 부피 ¹ mL로 한다. 챔버에 기포가 유입되지 않도록주의하십시오.
   2. TPP⁺-선택성 및 기준 전극을 제자리에 장착한 적응형 플런저 어셈블리로 챔버를 닫습니다. GO를 선택하여 녹화를 시작합니다. 챔버가 닫히면 바늘 길이를 조정하기 위해 플라스틱 튜브로 개질 된 별도의 미세 주사기를 사용하여 추가 시약을 반응 용액에 직접 도입하십시오.
4. TPP⁺ 캘리브레이션
   1. 안정적인 전압 신호가 얻어지면 0.1mM TPP 용액의 1μM 증분을 3μM의 최종 농도로 추가하여 TPP⁺ 선택적 전극을 교정합니다. TPP⁺ 전압 신호가 추가될 때마다 대수적으로 감소하는 것을 관찰하십시오.
      참고: 각 실험 시작 시 TPP⁺ 선택 전극을 교정하십시오.
5. 데이터 수집
   1. O2 및 TPP⁺ 트레이스가 안정화되도록 하고, 플런저 어셈블리의 시약 첨가 포트를 통해 갓 제조된 심근세포 미토콘드리아 100 μg을 반응 챔버에 최종 농도 0.1 mg ^mL-1로 첨가한다. 미토콘드리아가 통전되어_O2를 소비하고 미토콘드리아가 막 전위를 생성하고 용액에서 TPP +를 흡수함에 따라 TPP ⁺ 전압 신호의 급격한 증가로 챔버 내의_O2 수준의 감소를 관찰하십시오.
   2. 2.5 μg ^mL-1 올리고마이신을 첨가하여 상태 4 호흡을 유도하였다.
      참고 :_O2 소비율은 이제 양성자 누출 호흡 속도를 나타냅니다. 올리고마이신은 대안으로서 TPP⁺ 이전에 반응 챔버에 첨가될 수 있다.
6. mPTP의 개방 확률 평가
   1. 누출 호흡 중에 ΔΨ가 시간이 지남에 따라 감소하는 것을 관찰하십시오. 원하는 ΔΨ에 도달하면, 1 μM CsA (mPTP 억제제)를 반응 챔버에 첨가하여 그 특정 ΔΨ에서 mPTP의 개방 확률을 평가한다.
   2. CsA 첨가 전후의_O2 소비 및 ΔΨ에 대한 CsA의 영향 측정
   3. 연속적인 실험에서 CsA가 첨가되는 ΔΨ를 변화시킴으로써 mPTP 개방의 전압 의존성을 결정한다.

결과

이들 실험에서 생성된 전형적인_O2 소비 및 ΔΨ 곡선이 도시되어 있다(도 1A, B). TPP⁺ 캘리브레이션을 통한 전압 신호의 대수 감소는 각 실험의 시작 부분에 표시됩니다. 이러한 로그 패턴의 부재는 TPP⁺ 선택적 전극에 문제점을 시사할 수 있다. 미토콘드리아는 전형적으로 호흡 완충제에 첨가 즉시 ΔΨ를 생성한다. ΔΨ는 Nernst 방정식([외부 TPP...

토론

이 논문에서는 mPTP의 개방 확률을 평가하는 방법을 설명한다. 구체적으로, 저전도도 mPTP 개방에 대한 전압 임계값은 ΔΨs의 범위에 걸친 양성자 누출에 대한 CsA 억제의 효과를 평가함으로써 결정되었다. 이 기술을 사용하여, 우리는 FXS 마우스와 FVB 대조군 사이의 mPTP의 전압 게이팅의 차이가 조직 특이적 CoQ 함량의 차이와 일치하는지 확인할 수 있었다. 이 방법론의 성공에 중요한 것은 미토콘드리?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Fisher Scientific	15630080
Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1	PP systems	941039
BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft.	Fisher Scientific	14-170-11B	to modify the length of the hamilton synringe as needed
Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free	Sigma	A7030-10G
Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm	World Precision Inst. LLC	DRIREF-2
Electrode Holder for KWIK-Tips	World Precision Inst. LLC	KWIK-2	ion selective electrode holder
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid  (EGTA)	Sigma	324626
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME		FXS mice, Fmr1 KO
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME		FVB mice
Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk	Cole-Parmer	EW-07938-30	microsyringe
Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle	Cole-Parmer	EW-07938-02	microsyringe
Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete	PP systems	OXYTHERM+R	oxygen electrode and software
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma	1374248
Mannitol	Sigma	M9546-250G
P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A)	Sigma	D4022-10MG
Percoll	Sigma	P1644	medium for density gradient separation
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P3911
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	Sigma	5.43841
Sucrose	Sigma	S0389
TPP+ Electrode Tips (3)	World Precision Inst. LLC	TIPTPP