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Resumen

Este método explota la contribución del poro de transición de permeabilidad mitocondrial a la fuga de protones de baja conductancia para determinar el umbral de voltaje para la apertura de poros en ratones con síndrome de X frágil neonatal con mayor contenido de coenzima Q mitocondrial de cardiomiocitos en comparación con el control de tipo salvaje.

Resumen

El poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTP) es un megacanal de membrana mitocondrial interna (IMM) dependiente de voltaje, no selectivo, importante en la salud y la enfermedad. El mPTP media la fuga de protones a través de la IMM durante la apertura de baja conductancia y es específicamente inhibido por la ciclosporina A (CsA). La coenzima Q (CoQ) es un regulador de la mPTP, y se han encontrado diferencias específicas en el tejido en el contenido de CoQ y la probabilidad abierta de la mPTP en las mitocondrias del cerebro anterior y del corazón en un modelo de ratón recién nacido del síndrome de X frágil (FXS, Fmr1 knockout). Desarrollamos una técnica para determinar el umbral de voltaje para la apertura de mPTP en esta cepa mutante, explotando el papel del mPTP como un canal de fuga de protones.

Para ello, el consumo de oxígeno y el potencial de membrana (ΔΨ) se midieron simultáneamente en mitocondrias aisladas mediante polarografía y un electrodo selectivo de iones tetrafenilfosfonio (TPP+) durante la respiración por fuga. El umbral para la apertura de mPTP se determinó por el inicio de la inhibición mediada por CsA de la fuga de protones en potenciales de membrana específicos. Utilizando este enfoque, las diferencias en la tensión de cierre del mPTP se definieron con precisión en el contexto del exceso de CoQ. Esta novedosa técnica permitirá futuras investigaciones para mejorar la comprensión de la regulación fisiológica y patológica de la apertura de baja conductancia de la mPTP.

Introducción

El mPTP media la transición de permeabilidad (PT), por lo que el IMM se vuelve abruptamente permeable a moléculas pequeñas y solutos 1,2. Este llamativo fenómeno es una clara desviación de la impermeabilidad característica de la IMM, que es fundamental para establecer el gradiente electroquímico necesario para la fosforilación oxidativa3. Pt, a diferencia de otros mecanismos de transporte mitocondrial, es un proceso de alta conductancia, inespecífico y no selectivo, que permite el paso de una gama de moléculas de hasta 1,5 kDa 4,5. El mPTP es un canal dependiente de voltaje dentro del IMM cuya abertura altera ΔΨ, la producción de ATP, la homeostasis del calcio, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la viabilidad celular4.

En el extremo patológico, la apertura incontrolada y prolongada de alta conductancia de mPTP conduce al colapso del gradiente electroquímico, hinchazón de la matriz, agotamiento de los nucleótidos de piridina de la matriz, ruptura de la membrana externa, liberación de proteínas intermembrana (incluido el citocromo c) y, en última instancia, muerte celular 4,6. Dicha apertura patológica de mPTP se ha implicado en la lesión por isquemia-reperfusión cardíaca, insuficiencia cardíaca, lesión cerebral traumática, diversas enfermedades neurodegenerativas y diabetes 1,7. Sin embargo, la apertura mPTP de baja conductancia es de naturaleza fisiológica y, a diferencia de la apertura de alta conductancia, no conduce a una despolarización profunda o hinchazón mitocondrial4.

La apertura de baja conductancia del poro restringe la permeabilidad a ~ 300 Da, permite el paso de protones independientemente de la síntesis de ATP y es una fuente potencial de fuga fisiológica de protones5. La apertura fisiológica de mPTP causa una disminución controlada de ΔΨ, aumenta el flujo de electrones a través de la cadena de transporte respiratorio y da como resultado una breve ráfaga o destello de superóxido, lo que contribuye a la señalización ros8. La regulación de dicha apertura transitoria de mPTP es importante para la homeostasis del calcio y el desarrollo y maduración celular normal 4,9,10,11. La apertura transitoria de los poros en las neuronas en desarrollo, por ejemplo, desencadena la diferenciación, mientras que el cierre de la mPTP induce la maduración en cardiomiocitos inmaduros 4,5.

Aunque la importancia funcional de la mPTP en la salud y la enfermedad está bien establecida, su identidad molecular precisa sigue siendo objeto de debate. El progreso en la estructura molecular y la función de la mPTP se ha revisado exhaustivamente en otra parte12. Brevemente, actualmente, se ha planteado la hipótesis de que los estados de alta y baja conductancia del mPTP están mediados por distintas entidades12. Los principales candidatos son la ATP sintasa F1/F0 (ATP sintasa) y el transportador de nucleótidos de adenina (ANT) para los modos de alta y baja conductancia, respectivamente12.

A pesar de la falta de consenso con respecto a la identidad exacta del componente formador de poros del mPTP, se han detallado ciertas características clave. Una característica bien establecida del mPTP es que está regulado por el gradiente electroquímico tal que la despolarización del IMM conduce a la apertura del poro13. Trabajos anteriores han demostrado que el estado redox de los grupos tiol vicinales altera la tensión de cierre del mPTP, de modo que la oxidación abre el poro a ΔΨs relativamente más altos, y la reducción del grupo tiol da como resultado una probabilidad cerrada de mPTP14. Sin embargo, se desconoce la identidad del sensor de voltaje proteínico.

Se han identificado varias moléculas pequeñas que modulan la probabilidad abierta del poro. Por ejemplo, el mPTP puede ser estimulado para abrirse con calcio, fosfato inorgánico, ácidos grasos y ROS y puede ser inhibido por nucleótidos de adenina (particularmente ADP), magnesio, protones y CsA 5,12. Se han dilucidado los mecanismos de acción de algunos de estos reguladores. El calcio mitocondrial desencadena la apertura de mPTP al menos en parte al unirse a la subunidad β de la ATP sintasa15. ROS puede activar el mPTP disminuyendo su afinidad por ADP y mejorando su afinidad por la ciclofilina D (CypD), el activador proteínico mPTP mejor estudiado16. El mecanismo de activación del mPTP por fosfato inorgánico y ácidos grasos es menos claro. En cuanto a los inhibidores endógenos, se cree que el ADP inhibe la mPTP al unirse a la ANT o ATP sintasa, mientras que el magnesio ejerce su efecto inhibitorio al desplazar el calcio de su sitio de unión 15,17,18,19.

El pH bajo inhibe la apertura de mPTP mediante la protonación de la histidina 112 de la subunidad reguladora de la proteína reguladora que confiere sensibilidad a la oligomicina (OSCP) de la ATP sintasa 12,20,21. El inhibidor farmacológico prototípico de la mPTP, CsA, actúa uniéndose a CypD e impidiendo su asociación con OSCP22,23. Trabajos previos también han demostrado que una variedad de análogos de CoQ interactúan con el mPTP, inhibiéndolo o activándolo24. En trabajos recientes, encontramos evidencia de una mPTP patológicamente abierta, fuga excesiva de protones y fosforilación oxidativa ineficiente debido a una deficiencia de CoQ en las mitocondrias del cerebro anterior de las crías de ratón recién nacidas con FXS25.

El cierre del poro con CoQ exógeno bloqueó la fuga patológica de protones e indujo la madurez morfológica de las espinas dendríticas25. Curiosamente, en los mismos animales, los cardiomiocitos FXS tenían niveles excesivos de CoQ y una probabilidad cerrada de mPTP en comparación con los controles de tipo salvaje26. Aunque se desconoce la causa de estas diferencias específicas de tejido en los niveles de CoQ, los hallazgos subrayan el concepto de que la CoQ endógena es probablemente un regulador clave de la mPTP. Sin embargo, existe una gran brecha en nuestro conocimiento porque el mecanismo de inhibición mediada por CoQ de la mPTP sigue siendo desconocido.

La regulación de la mPTP es un determinante crítico de la señalización celular y la supervivencia4. Por lo tanto, la detección de la apertura de mPTP dentro de las mitocondrias es clave cuando se consideran mecanismos fisiopatológicos específicos. Por lo general, el umbral para la apertura de poros de alta conductancia se determina utilizando calcio para desencadenar la transición de permeabilidad. Dicha carga de calcio conduce al colapso del potencial de membrana, al desacoplamiento rápido de la fosforilación oxidativa y a la hinchazón mitocondrial27,28. Se buscó desarrollar un método para detectar la apertura de mPTP de baja conductancia in situ, sin inducirla per se.

El enfoque explota el papel del mPTP como un canal de fuga de protones. Para ello, se emplearon electrodos selectivos de iones Tipo Clark y TPP+ para medir simultáneamente el consumo de oxígeno y el potencial de membrana, respectivamente, en mitocondrias aisladas durante la respiración por fuga29. El umbral para la apertura de mPTP se determinó por el inicio de la inhibición mediada por CsA de la fuga de protones en potenciales de membrana específicos. Utilizando este enfoque, se definieron con precisión las diferencias en la tensión de cierre del mPTP en el contexto del exceso de CoQ.

Protocolo

Se obtuvo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico de la Universidad de Columbia para todos los métodos descritos. Los ratones FXS (Fmr1 KO) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J) y control (FVB)(FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ) utilizados como sistemas modelo para este estudio fueron adquiridos comercialmente (ver la Tabla de Materiales). Se utilizaron de cinco a once animales en cada grupo experimental. Se utilizaron ratones postnatales del día 10 (P10) para modelar un punto de tiempo en la infancia humana.

1. Aislamiento mitocondrial del corazón de ratón

  1. Preparar tampones para el aislamiento mitocondrial y los experimentos de respiración como se describe en la Tabla 1. Conservar a 4 °C si se hace con antelación.
    1. Preparar medio de gradiente de densidad al 15%: diluir el medio de gradiente de densidad comercial al 80% de volumen/volumen (v/v) con diluyente de gradiente de densidad. Diluya aún más el medio de gradiente de densidad del 80% 15% v / v agregando tampón de aislamiento mitocondrial (IM) / albúmina sérica bovina (BSA).
  2. Aislar las mitocondrias de tejido fresco, no congelado para estos experimentos y usarlo el día de la preparación, generalmente dentro de las cinco horas26. Lleve a cabo todos los pasos de aislamiento en hielo.
    1. Decapita al ratón y extirpa el corazón. Lavar inmediatamente 1-2 veces en una placa de Petri con MI/BSA helado. Cortar la aurícula y picar el tejido.
    2. Transfiera el tejido cardíaco picado a un homogeneizador de vidrio que contenga 1 ml de MI/BSA. Homogeneizar con un mortero más suelto (A) (10 golpes), luego un mortero más apretado (B) (10 golpes).
    3. Centrifugar el homogeneizado a 1.100 × g durante 2 min a 4 °C para eliminar los desechos nucleares y celulares.
    4. Tome el sobrenadante suavemente sin tocar ningún gránulo esponjoso, y colóquelo cuidadosamente sobre 700 μL de medio de gradiente de densidad del 15% en un tubo de centrífuga. Centrifugadora a 18.500 × g durante 15 min a 4 °C.
    5. Resuspendir el pellet en 1 mL de tampón de sacarosa (SB)/BSA y centrifugarlo a 10.000 × g durante 10 min a 4 °C.
    6. Retire y deseche completamente el sobrenadante. Resuspend el pellet en SB/BSA a un volumen final de 55 μL.
    7. Cuantificar el contenido de proteína mitocondrial utilizando un ensayo estándar como el ensayo de proteína de ácido bicinconínico (BCA).

2. Consumo de oxígeno mitocondrial (O2) y ΔΨ

  1. Montaje y calibración de electrodos de oxígeno
    1. Configure y calibre el electrodo de oxígeno (consulte la Tabla de materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      1. Coloque una gota de solución de electrolito de cloruro de potasio (KCl) al 50% en la parte superior de la cúpula del disco del electrodo.
      2. Coloque un pequeño trozo ~ 2 cm2 espaciador de papel de cigarrillo cubierto con un trozo ligeramente más grande de la membrana de politetrafluoroetileno (PTFE) proporcionada sobre la gota de electrolito.
      3. Usando la herramienta aplicadora proporcionada, empuje la pequeña junta tórica del disco del electrodo sobre la cúpula del electrodo.
        NOTA: Asegúrese de que no haya burbujas de aire y que la membrana esté lisa.
    2. Rellene bien el depósito con la solución de electrolito.
    3. Coloque la junta tórica más grande en el hueco alrededor del disco del electrodo.
    4. Instale el disco en la cámara del electrodo y conéctelo a la unidad de control.
    5. Agregue 2 ml de agua desionizada saturada de aire a la cámara de reacción y el imán recubierto de PTFE a la cámara.
    6. Conecte la cámara a la parte trasera de la unidad de control.
    7. Ajuste la temperatura a 37 °C y la velocidad de agitación a 100.
    8. Espere 10 minutos para que la temperatura del sistema se equilibre antes de comenzar la calibración.
    9. En la pestaña Calibración , seleccione Calibración en fase líquida para realizar la calibración en fase líquida. Confirme que la temperatura está ajustada a 37 ° C, la velocidad de agitación es de 100 y la presión está configurada a presión atmosférica (101.32 kPa).
    10. Presione OK y espere a que la señal se estabilice.
    11. Cuando se alcance una meseta, pulse OK.
    12. Establezca cero O2 en la cámara agregando una pequeña cantidad (~ 20 mg) de ditionita de sodio.
    13. Presione OK y espere a que la señal se estabilice.
    14. Cuando se alcanza una meseta, pulse Guardar para aceptar la calibración.
  2. TPP+-ensamblaje selectivo de electrodos
    1. Llene la punta del electrodo selectivo TPP+ con una solución de TPP de 10 mM utilizando la jeringa y la aguja flexible proporcionadas, teniendo cuidado de evitar burbujas de aire.
    2. Ensamble el aparato de electrodo selectivo TPP+, incluidos el electrodo de referencia y el soporte del electrodo, (consulte la Tabla de materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    3. Brevemente, afloje la tapa del soporte del electrodo e inserte el electrodo de referencia interno en la punta TPP+. Apriete la tapa para asegurar la punta. Conecte el cable proporcionado al soporte del electrodo y al puerto auxiliar de la caja de control.
    4. Inserte el electrodo selectivo TPP+ y los electrodos de referencia en el conjunto del émbolo adaptado para electrodos selectivos de iones. Conecte el electrodo de referencia al puerto de referencia de la caja de control.
    5. Inserte los electrodos selectivos y de referencia TPP+ en el conjunto del émbolo adaptado para electrodos selectivos de iones.
  3. Preparación de la cámara de reacción
    1. Agregue la mezcla de reacción a la cámara de reacción: 10 mM de succinato (sustrato complejo II), 5 μM de rotenona (inhibidor del complejo I), 80 ng mL−1 nigericina (para colapsar el gradiente de pH a través de IMM), 2,5 μg mL-1 oligomicina (para inducir la respiración en estado 4) y tampón de reacción de respiración (RB)/BSA a un volumen final de 1 mL. Tenga cuidado de evitar la introducción de burbujas de aire en la cámara.
    2. Cierre la cámara con el conjunto del émbolo adaptado con el TPP+ selectivo y el electrodo de referencia en su lugar. Seleccione GO para comenzar a grabar. Una vez que la cámara esté cerrada, introduzca reactivos adicionales directamente en la solución de reacción utilizando microjeringes separadas modificadas con tubos de plástico para ajustar la longitud de la aguja.
  4. Calibración TPP+
    1. Una vez que se obtiene una señal de voltaje estable, calibre el electrodo selectivo TPP+ agregando incrementos de 1 μM de una solución de TPP de 0,1 mM a una concentración final de 3 μM. Observe que hay una disminución logarítmica en la señal de voltaje TPP + con cada adición.
      NOTA: Calibre el electrodo selectivo TPP+ al inicio de cada experimento.
  5. Adquisición de datos
    1. Permita que los rastros de O2 y TPP+ se estabilicen, y agregue 100 μg de mitocondrias de cardiomiocitos recién preparadas a la cámara de reacción a una concentración final de 0,1 mg mL-1 a través del puerto de adición de reactivos en el conjunto del émbolo. Observe la disminución en los niveles de O2 en la cámara a medida que las mitocondrias se energizan y consumen O2 y el aumento abrupto en la señal de voltaje TPP + a medida que las mitocondrias generan un potencial de membrana y absorben TPP + de la solución.
    2. Añadir 2,5 μg de oligomicina mL-1 para inducir la respiración en estado 4.
      NOTA: Las tasas de consumo de O2 ahora representarán la tasa de respiración por fuga de protones. La oligomicina se puede agregar a la cámara de reacción antes de TPP + como alternativa.
  6. Evaluación de la probabilidad abierta del mPTP
    1. Observe que ΔΨ disminuye con el tiempo durante la respiración por fugas. Una vez que se alcanza el ΔΨ deseado, agregue 1 μM CsA (inhibidor de mPTP) a la cámara de reacción para evaluar la probabilidad abierta del mPTP en ese ΔΨ específico.
    2. Medir el efecto de CsA sobre el consumo de O2 y ΔΨ antes y después de la adición de CsA
    3. Determine la dependencia de voltaje de la apertura mPTP variando el ΔΨ al que se agrega CsA en experimentos sucesivos.

Resultados

Se muestran el consumo típico de O2 y las curvas ΔΨ generadas en estos experimentos (Figura 1A,B). La disminución logarítmica en la señal de voltaje con calibración TPP+ se muestra al comienzo de cada experimento. La ausencia de este patrón logarítmico puede sugerir un problema con el electrodo selectivo TPP+. Las mitocondrias típicamente generan ΔΨ inmediatamente después de la adición al tampón respiratorio. ΔΨ puede interpr...

Discusión

Este artículo describe un método para evaluar la probabilidad abierta de la mPTP. Específicamente, el umbral de voltaje para la apertura de mPTP de baja conductancia se determinó evaluando el efecto de la inhibición de CsA en la fuga de protones en un rango de ΔΨs. Usando esta técnica, pudimos identificar diferencias en la tensión de la mPTP entre ratones FXS y controles FVB consistentes con sus diferencias en el contenido de CoQ específico del tejido. Fundamental para el éxito de esta metodología es que las ...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo está respaldado por las siguientes subvenciones: NIH/NIGMS T32GM008464 (K.K.G.), Premio Target of Opportunity Provost del Centro Médico Irving de la Universidad de Columbia al Departamento de Anestesiología (K.K.G.), Premio de Investigación del Joven Investigador de la Sociedad de Anestesia Pediátrica (K.K.G.) y NIH/NINDS R01NS112706 (R.J.L.)

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Fisher Scientific15630080
Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1PP systems941039
BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft.Fisher Scientific14-170-11Bto modify the length of the hamilton synringe as needed
Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid freeSigmaA7030-10G
Dri-Ref Reference Electrode, 2 mmWorld Precision Inst. LLCDRIREF-2
Electrode Holder for KWIK-TipsWorld Precision Inst. LLCKWIK-2 ion selective electrode holder
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid  (EGTA)Sigma324626
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/JJackson Laboratory, Bar Harbor, MEFXS mice, Fmr1 KO 
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJJackson Laboratory, Bar Harbor, MEFVB mice
Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pkCole-ParmerEW-07938-30microsyringe
Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-NeedleCole-ParmerEW-07938-02microsyringe
Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) CompletePP systemsOXYTHERM+Roxygen electrode and software
Magnesium Chloride (MgCl2)Sigma1374248
MannitolSigmaM9546-250G
P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A)SigmaD4022-10MG
PercollSigmaP1644medium for density gradient separation
Potassium chloride (KCl)SigmaP3911
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)Sigma5.43841
SucroseSigmaS0389
TPP+ Electrode Tips (3)World Precision Inst. LLCTIPTPP

Referencias

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