透明质酸35 kDa对肠源单层早产小肠损伤体 外 模型及愈合的影响

摘要

该协议描述了一种在从非人灵长类动物回肠分离的三维（3D）肠衍生的二维（2D）单层上建立和执行划痕伤口测定的方法。

摘要

体外 划痕伤口测定通常用于研究各种组织类型中上皮愈合的机制和特征。在这里，我们描述了一种协议，以从源自末端回肠肠隐窝的三维（3D）非人灵长类动物肠生成二维（2D）单层。然后将这些肠来源的单层用于 体外 划痕伤口测定，以测试透明质酸35 kDa（HA35）（一种人乳HA模拟物）促进细胞沿上皮伤口边缘迁移和增殖的能力。单层生长至汇合后，手动划伤并用HA35（50μg/ mL，100μg/ mL，200μg/ mL）或对照（PBS）处理。使用配备活细胞成像的透射光显微镜对细胞迁移和增殖到间隙中成像。伤口闭合被量化为使用ImageJ中的伤口愈合大小插件的伤口愈合百分比。在24小时内测量划痕面积和细胞迁移速率以及伤口闭合百分比。 HA35体 外 加速小肠样单层的伤口愈合，可能是通过伤口边缘的细胞增殖和向伤口区域的迁移的组合。这些方法有可能用作探索早产儿小肠肠道再生的模型。

引言

坏死性小肠结肠炎（NEC）是早产儿最常见的胃肠道急症之一¹。该疾病的特征是严重的肠道炎症，可迅速恶化为肠道坏死、败血症和潜在的死亡。虽然病因尚不清楚，但有证据表明 NEC 是多因素的，是喂养、异常细菌定植和未成熟肠上皮^2，3 复杂相互作用的结果。早产儿肠道通透性增加，细菌定植异常，肠细胞^{再生能力低}4，5^，增加肠屏障功能障碍、细菌易位和NEC发展的风险。因此，确定加速肠上皮成熟和促进肠上皮再生或愈合的策略或干预措施对于预防这种致命疾病至关重要。

研究表明，母乳（HM）对早^产儿6，^7，8，⁹，^10，11具有NEC的保护作用。人类和动物研究都表明，牛配方可增加肠道通透性，对肠上皮细胞有直接毒性^2，12。虽然尚未完全阐明，但有证据表明HM的保护作用是通过乳铁蛋白，免疫球蛋白A（IgA）和HM低聚糖等生物活性成分介导的¹³。HM还富含透明质酸（HA），这是一种独特的非硫酸化糖胺聚糖，具有重复的D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺二糖^14，15。重要的是，我们已经证明口服35 kDa HA（HA35），一种HM HA模拟物，可以减轻肠道损伤的严重程度，防止细菌易位，并降低小鼠NEC样肠损伤模型^{的死亡率16，17}。

在这里，进一步研究了HA35对 体外 肠道愈合和再生的影响。目前，用于肠道损伤和修复的最广泛使用的 体外 测定是在结直肠癌（CRC）细胞单层中进行的划痕伤口测定。这种模型与早产儿肠道的生理相关性有限，因为CRC细胞的伤口修复在很大程度上依赖于癌细胞的高度增殖性质，而不是干细胞驱动的修复过程¹⁸。为了克服这一限制，这里描述了建立2D肠样划痕伤口模型，包括从早产非人灵长类动物（NHP）中分离和维持原代干细胞来源的小肠类肠道的过程。鉴于早产NEC最常在远端小肠中报告，与使用传统结直肠单层的现有模型相比，在肠道损伤和修复模型中使用原代上皮细胞类器官提供了更具生理可转化的 体外 模型^18，19。

研究方案

本研究中的所有动物程序均已获得俄克拉荷马大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会的批准。经机构批准，在安乐死后获得来自早产非人灵长类动物（NHP，90%妊娠，橄榄狒狒， Papio anubis）的胎儿小肠便利样本，以进行另一项研究（协议#101523-16-039-I）²⁰。

1.早产非人灵长类动物三维肠样的建立

1. 培养基制备
   注意:可以按照标准无菌技术在隐窝分离前1周制备培养基。如果需要，青霉素/链霉素（终浓度 1%）可用于代替原代细胞的广谱抗生素。
   1. 通过将 50 mL 类器官生长培养基人基础培养基与 50 mL 类器官补充剂混合来制备人类器官生长培养基 + Y-27632 （HOGMY）（材料表）。加入 200 μL 广谱抗生素（终浓度 100 μg/mL）（材料表）和 Y-27632（终浓度为 10 μM）。在工作台上加热至室温。
   2. 通过将 50 mL 类器官生长培养基人基础培养基与 50 mL 类器官补充剂混合来制备人类器官生长培养基 （HOGM）。加入 200 μL 广谱抗生素 （100 μg/mL）。在工作台上加热至室温。
      注意:在传代后前 2-3 天之后更换培养基时，将使用 HOGM。
   3. 冷却 100 mL 不含钙或镁的 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS），直至冰冷。
   4. 通过将不含钙或镁的 1x PBS 与 0.1% 牛血清白蛋白 （BSA） 混合来制备 50 mL 洗涤缓冲液。冷却至冰冷。
   5. 通过将 1 mL 广谱抗生素 （100 μg/mL） 加入 500 mL DMEM/F12（Dulbecco 改良的 Eagle 培养基/营养火腿混合物 F12 + 15 mM HEPES 缓冲液）来制备 DMEM-F12 洗涤缓冲液。保持冰冷。
2. 隐窝隔离和电镀
   注意:在整个过程中，基于细胞外基质（ECM）的水凝胶必须保持在冰上。该过程假设有足够的组织来填充六个基于ECM的水凝胶圆顶。如果收获了不同密度的地穴，则应相应地更改圆顶编号。
   1. 在2-8°C的冰上解冻150μL生长因子还原（GFR）基底膜提取物（BME）（无酚红）过夜。
   2. 使用前，将24孔，平底，组织培养处理的聚苯乙烯板在37°C和5%CO₂ 的培养箱中孵育至少30分钟。
   3. 在 NHP 安乐死和组织收集后，在一次性培养皿中使用冰冷的 1x PBS 用 1，000 μL 移液器吸头冲洗碎片的回肠段。
      注意:新鲜组织必须快速收获并保持冰冷以收获健康的肠类。
   4. 沿整个肠道纵向切开回肠，并用冰冷的PBS 3x清洗。用无菌剪刀将组织切成小碎片（长约 2 mm），在含有 15 mL 冰冷 PBS 的 50 mL 锥形管上，从最靠近管的回肠段部分开始。
   5. 使用 10 mL 血清移液器上下移液 5-10 倍来破坏隐窝。让组织段沉降到管底部，然后去除上清液并用新鲜的冰冷PBS代替。重复此过程至少7x-10x，直到上清液澄清且没有碎屑。
   6. 清除后，取出上清液并将隐窝重悬于 25 mL 细胞解离试剂中。在室温下将管子放在20rpm的摇摆平台上15分钟。
   7. 从摇臂上取下试管，让细胞沉淀约30秒至1分钟，然后除去上清液。加入 10 mL 冰冷洗涤缓冲液。用 p1000 移液器上下移液，进一步解离成单个隐窝。
   8. 通过 70 μm 细胞过滤器将组织过滤到新的 50 mL 锥形管中。用 10 mL 冰冷洗涤缓冲液冲洗原始 50 mL 锥形管，并通过 70 μm 过滤器过滤，以确保已从原始管中取出所有隐窝。重复这种纸巾洗涤，总共冲洗4次。
   9. 将滤液在4°C下以300× g 离心5分钟，并除去上清液。加入 600 μL HOGMY，并用 200 μL 移液器上下移液破坏沉淀。将试管放在冰上，直到溶液变冷。
      注意:如果溶液不是冰冷的，则圆顶在电镀时将无法保持正确的结构。移液基于ECM的水凝胶圆顶时避免引入气泡，因为气泡会阻止正确粘附到板底。
   10. 加入 600 μL 冰冷的 ECM 基水凝胶以悬浮细胞沉淀，并与 200 μL 移液器充分混合。
   11. 从培养箱中取出24孔板并将其置于37°C板加热器上。将 50 μL 冰冷的 HOGMY/ECM 基水凝胶混合物移液到 24 孔培养板的 24 孔中心（每个圆顶 50 μL）。
   12. 板后，让圆顶在37°C的板加热器上放置1分钟，以使其粘附在板的底部。小心地倒置板，确保板底部没有冷凝，并将倒置板放入培养箱中，温度为37°C和5%CO₂。
   13. 15分钟后，将板右侧朝上，并将750μL室温HOGMY移液到每个孔中。
       注意:将培养基缓慢移液到孔的侧壁上，注意不要破坏新形成的基于3D ECM的水凝胶圆顶。
   14. 将所有孔充满培养基后，将板放入培养箱中，并每 3 天用 750 μL HOGM 更换培养基。每7-10天传代一次肠样。
3. 肠道肠样传代
   注意:以下方案适用于一个含有 NHP 类肠的 24 孔培养板，分裂率为 1:2。
   1. 从每个孔中取出肠样培养基，注意不要破坏含有肠样的ECM圆顶，使用1，000μL移液管向每个孔中加入500μL冰冷细胞解离试剂，并在室温下孵育1分钟。
   2. 通过上下移液 8-12 次手动中断 ECM。将 12 孔的内容物转移到一个 15 mL 锥形管中。
   3. 从 24 孔培养板收集所有溶液后，向每个孔中加入 250 μL 细胞破碎试剂，以确保已从每个孔中去除所有 NHP 类肠，将最后一次冲洗添加到现有的 15 mL 锥形管中。
   4. 在室温（20°C）下以40rpm置于摇摆平台上15分钟。或者，在室温下手动摇动试管15分钟。
   5. 15分钟后，在4°C下以300× g 离心5分钟。 从 15 mL 管中取出上清液，直到只剩下沉淀。
   6. 将 8 mL 冰冷的 DMEM + 广谱抗生素加入一个 15 mL 锥形管中，确保沉淀充分破碎。在4°C下以300× g 离心5分钟，弃去上清液。
   7. 加入 600 μL HOGMY，并用 1，000 μL 移液器上下移液来破坏沉淀。将试管放在冰上，直到溶液变冷。溶液冰冷后，加入 600 μL 冰冷的 ECM 以悬浮细胞沉淀，并与 1，000 μL 移液器充分混合。重复步骤 1.3.2.-1.3.7。其余12口井。
      1. 有关其余步骤，请参阅步骤 1.2.11.-1.2.16。

2.肠样单层和划痕创面测定的建立

1. 培养基和治疗准备
   1. 将 5 mL 不含钙或镁的 PBS 冷却至冰冷。
   2. 通过将 1 mL 广谱抗生素 （100 μg/mL） 加入 500 mL DMEM/F12（Dulbecco 改良的 Eagle 培养基/营养火腿混合物 F12 + 15 mM HEPES 缓冲液）来制备 DMEM-F12 洗涤缓冲液。保持冰冷。
   3. 如步骤1.1.1所述，准备100 mL HOGMY，并在工作台上加热至室温。
   4. 在37°C水浴中加热25mL的0.25%胰蛋白酶 - 乙二胺四乙酸（EDTA）。
   5. 使用不含钙或镁作为溶剂的无菌 PBS 制备 50 μg/mL、100 μg/mL 和 200 μg/mL 浓度的 HA35 用于细胞处理。HA35的最终稀释将使用HOMGY作为溶剂。
      注意:HA35制剂可能需要多次稀释，因为HA35通常以大于5mg / mL的浓度从溶液中出来。
2. 肠样单层形成
   注意:以下程序提供的体积足以生成一个24孔肠样单层板。调整所需单层数量的体积。
   1. 在2-8°C的冰上解冻96μL基于ECM的水凝胶BME（无酚红）过夜。 在不含钙或镁的冰冷PBS中以1:50的比例稀释基于ECM的水凝胶。用 200 μL 冰冷稀释的 ECM 基水凝胶涂覆 24 孔组织培养板的每个孔。
   2. 将基于ECM的水凝胶包被板在37°C和5%CO₂下孵育至少1小时。从含有单层 3D 肠样的 24 孔培养板中吸出培养基，并用 500 μL 细胞解离试剂/孔替换。
   3. 通过上下移液 8x-12x 手动破碎基于 ECM 的水凝胶圆顶，并将 12 个孔的内容物转移到 15 mL 锥形管中。
   4. 用 250 μL 细胞解离试剂洗涤 12 个空孔，以确保去除所有类肠，并将内容物转移到 15 mL 锥形管中。重复步骤 2.2.5。和步骤 2.2.6。对于其余 12 个孔，使用第二个 15 mL 锥形管。
   5. 在4°C下以300× g 离心锥形管5分钟，弃去上清液。将 10 mL 冰冷的 DMEM-F12 洗涤缓冲液加入 15 mL 锥形管中，并通过倒置管悬浮肠样颗粒。在4°C下以300× g 离心5分钟。
   6. 除去上清液并将细胞沉淀重悬于12mL的37°C胰蛋白酶-EDTA中。将试管置于37°C水浴中10分钟或直到细胞看起来可溶。向每个试管中加入 3 mL DMEM-F12 洗涤缓冲液以稀释胰蛋白酶-EDTA，通过倒置试管进行混合，然后放在冰上。
   7. 通过 37 μM 网状细胞过滤器过滤解离的类肠，将内容物收集到干净的 15 mL 锥形管中。在4°C下以300× g 离心管5分钟。
   8. 当细胞在离心机中沉淀时，从培养箱中取出基于ECM的水凝胶包被板，并吸出任何多余的基于ECM的水凝胶溶液，而不会划伤包被表面或让板完全干燥。
   9. 从锥形管中取出上清液，并用 6 mL HOMGY 重悬细胞沉淀。将 500 μL 组合的 12 mL HOMGY 细胞悬液加入涂有 ECM 基水凝胶的 24 孔板的每个孔中，接种密度约为 3 x 10⁵ 个细胞/孔。用盖子旋转板，以确保孔内细胞的均匀分布。
   10. 将板在37°C和5%CO 2下孵育_，每2 天交换一次HOMGY培养基，直到单层达到>90%汇合度。
3. 单层处理和划痕伤口测定
   1. 一旦单层达到>90%汇合度，吸出培养基以去除任何无法附着的细胞。用 500 μL HA35（50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL）或 PBS 处理细胞，溶解在 HOMGY 中，持续 24 小时。
   2. 24小时后，取出培养基，注意不要破坏单层的表面。使用 200 μL 移液器吸头，在每个孔中单层的整个表面直径上划过线性划痕，注意不要让单层干燥。
   3. 用 500 μL 1x PBS 清洗划伤的单层 1x。加入 500 μL HA35（50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL）或溶解在 HOMGY 中的 PBS，并将板转移到 37 °C 和 5% CO₂ 培养箱内的活细胞分析仪器（材料表）中。
   4. 在活细胞分析软件（材料表）中的计划图标下，单击启动添加新容器向导图标，并设置扫描频率以按计划扫描。在扫描类型下创建一个新的全孔容器，指定扫描设置（即，图像通道的相位和物镜的4x），然后单击下一步。
   5. 从提供的列表中选择印版制造商和目录号。在 时间表 图标下，选择板将放置在活细胞分析仪器中的加号。选择所需的 扫描图案，然后通过在"板布局"页面上选择"+"来创建板图。选择 推迟分析，然后将扫描 计划 设置为每 4 小时一次，持续 24 小时，并在 容器向导摘要 页面下验证采集设置。最后，选择"添加到计划"。
   6. 完成 24 次检测后，在" 查看"图标下，双击 "容器名称"，然后导出图像和动画。选择要显示的孔和一系列图像，并将其导出为 JPEG。按照步骤 2.4 使用 ImageJ²¹ 的伤口愈合大小插件分析图像以获得伤口愈合百分比。下面。
4. 划痕伤口分析
   1. 打开 ImageJ 软件。上传划痕伤口测定图像（.TIFF或.JPG）。
   2. 选择 图像>键入 > 8 位 ，将图像从 24 位 RGB 更改为 8 位。通过选择插件>宏来安装伤口愈合大小插件 >安装>伤口愈合大小插件。
   3. 旋转图像，使划痕垂直，并初始化伤口愈合大小工具插件。
   4. 在对话框中选择插件参数以最适合划痕伤口。将伤口愈合大小选项的参数值设置如下:方差窗口半径为 20，阈值为 100，饱和像素百分比为 0.001，然后为设置全局比例选择是。通过单击完成选择 OK 按钮。验证所选区域是否为伤口区域。上述参数可能需要从实验室到实验室进行标准化。
   5. 重复步骤 2.4.2.-2.4.4。对于每个划痕的剩余时间点。
   6. 计算24小时内迁移或增殖细胞的划痕区域伤口愈合百分比，如下所示:
      伤口愈合百分比 =
      其中 T 0 = 时间 0 小时的面积百分比，T_c = ₀ 小时、4 小时、12 小时或 24 小时的面积百分比。

结果

HA对各种组织和器官的组织修复和伤口愈合的影响是有据可查的;然而，分子量为35 kDa的HA对胎儿或新生儿小肠愈合和再生的具体影响目前尚不清楚。为了测试HA35在胎儿或新生儿小肠模型中促进伤口愈合的能力，我们从NHP回肠组织中生成了3D肠样肠，并进一步将该组织解离成单细胞以创建2D肠衍生单层（图1A，B）。将单层生长至汇合并使用P200移液器吸头手动刮擦（...

讨论

早产儿的胃肠道因反复暴露于与生态失调、炎症性细菌代谢物和毒素以及间歇性缺氧相关的环境损害而承受持续的再生压力^23，24。不幸的是，早产儿的肠上皮无法迅速建立功能完整性²³，导致屏障功能障碍，肠道通透性增加，严重时，肠道炎症和NEC发展猖獗。

糖胺聚糖（GAGs）是一类在母乳中普遍存在的多糖，是?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Serological Pipet	Fisher Scientific	13-675-49
100x21mm Dish, Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific	172931
15 mL Conical tube	VWR	89039-666
24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate	Corning	3524
37 µM Reversible Cell Strainer	STEMCELL Technologies	27215
50 mL Conical tube	VWR	89039-658
70 µm Sterile Cell Strainers	Fisher Scientific	FB22-363-548
Albumin, Bovine (BSA)	VWR	0332-100G
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer	STEMCELL Technologies	36254
Gentle Cell Dissociation Reagent	STEMCELL Technologies	100-0485
ImageJ	NIH	imagej.nih.gov/ij/
Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument	Sartorius	4647
Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module	Sartorius	9600-0012
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	STEMCELL Technologies	06010	This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics.
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography	Millipore Sigma	L3012-10MG
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free	Corning	356231
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate	ThermoFisher Scientific	136101
PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4	Corning	21-040-CM
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	This is broad-spectrum antibiotics
Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K	Lifecore Biomedical	HA20K-1
TC20 Automated Cell Counter	Company: Bio-Rad	1450102
Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin	Fisher Scientific	MT25053CI
Y-27632	STEMCELL Technologies	72302