Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Этот протокол описывает метод установления и выполнения анализа раны царапин на двумерных (2D) монослоях, полученных из трехмерных (3D) энтероидов, выделенных из подвздошной кишки приматов нечеловеческих.
Анализы раны с царапинами in vitro обычно используются для изучения механизмов и характеристик заживления эпителия в различных типах тканей. Здесь мы описываем протокол для генерации двумерного (2D) монослоя из трехмерных (3D) энтероидов нечеловеческих приматов, полученных из кишечных крипт терминальной подвздошной кишки. Эти монослои, полученные из энтероидов, затем использовались в анализе in vitro для проверки способности гиалуроновой кислоты 35 кДа (HA35), имитации ГК грудного молока, способствовать миграции и пролиферации клеток вдоль края эпителиальной раны. После того, как монослои были выращены до слияния, их вручную царапали и обрабатывали HA35 (50 мкг/мл, 100 мкг/мл, 200 мкг/мл) или контрольным (PBS). Миграция и пролиферация клеток в щель были визуализированы с помощью микроскопа с передаваемым светом, оборудованного для визуализации живых клеток. Закрытие раны было количественно определено как процент заживления ран с помощью плагина Wound Healing Size Plugin в ImageJ. Площадь царапин и скорость миграции клеток и процент закрытия раны были измерены в течение 24 ч. HA35 in vitro ускоряет заживление ран в тонкокишечных энтероидных монослоях, вероятно, за счет комбинации пролиферации клеток на краю раны и миграции в раневую область. Эти методы потенциально могут быть использованы в качестве модели для изучения кишечной регенерации в недоношенном тонком кишечнике человека.
Некротизирующий энтероколит (НЭК) является одним из наиболее распространенных желудочно-кишечных чрезвычайных ситуаций у недоношенных детей1. Заболевание характеризуется сильным воспалением кишечника, которое может быстро ухудшиться до некроза кишечника, сепсиса и потенциально смерти. Хотя этиология неясна, данные свидетельствуют о том, что NEC является многофакторным и результатом сложного взаимодействия кормления, аномальной бактериальной колонизации и незрелого кишечного эпителия 2,3. Недоношенные дети имеют повышенную проницаемость кишечника, аномальную бактериальную колонизацию и низкую регенеративную способность энтероцитов 4,5, что увеличивает риск дисфункции кишечного барьера, бактериальной транслокации и развития NEC. Поэтому определение стратегий или вмешательств для ускорения созревания эпителия кишечника и содействия регенерации или заживлению кишечного эпителия имеет решающее значение для предотвращения этого смертельного заболевания.
Исследования показали, что грудное молоко (ГМ) защищает от НЭК у недоношенных детей 6,7,8,9,10,11. Исследования на людях и животных показали, что формула на основе крупного рогатого скота увеличивает проницаемость кишечника и напрямую токсична для эпителиальных клеток кишечника 2,12. Хотя они не полностью выяснены, данные свидетельствуют о том, что защитные эффекты HM опосредованы биологически активными компонентами, такими как лактоферрин, иммуноглобулин A (IgA) и олигосахариды HM13. HM также богат гиалуронаном (HA), уникальным несульфатированным гликозаминогликаном с повторяющейся D-глюкуроновой кислотой и N-ацетил-D-глюкозаминовыми дисахаридами14,15. Важно отметить, что мы показали, что пероральный прием 35 кДа ГК (HA35), имитирующий HM HA, ослабляет тяжесть повреждения кишечника, предотвращает бактериальную транслокацию и снижает смертность в мышиной NEC-подобной модели кишечного повреждения16,17.
Здесь дополнительно исследуется влияние HA35 на заживление и регенерацию кишечника in vitro. В настоящее время наиболее широко используемым анализом in vitro для ранирования и восстановления кишечника является анализ царапины на ране, выполняемый в монослоях клеток колоректального рака (CRC). Физиологическая значимость такой модели для кишечника недоношенных детей ограничена, поскольку восстановление ран CRC-клеток в значительной степени зависит от высокопролиферативной природы раковых клеток, а не от процессов восстановления, управляемых стволовыми клетками18. Чтобы преодолеть это ограничение, здесь описано создание 2D-модели энтероидной царапины раны, включая процедуру выделения и поддержания первичных энтероидов тонкой кишки, полученных из стволовых клеток, от недоношенных нечеловеческих приматов (NHP). Учитывая, что преждевременный НЭК чаще всего сообщается в дистальной тонкой кишке, использование первичных органоидов эпителиальных клеток в модели повреждения и восстановления кишечника обеспечивает более физиологически переводимую модель in vitro по сравнению с существующими моделями, использующими традиционные колоректальные монослои18,19.
Все процедуры для животных в этом исследовании были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Центра медицинских наук Университета Оклахомы. После институционального одобрения после эвтаназии были получены образцы тонкой кишки плода от недоношенного нечеловеческого примата (NHP, 90% беременности, оливковый бабуин, Papio anubis) для отдельного исследования (Протокол No 101523-16-039-I)20.
1. Установление недоношенных нечеловеческих приматов 3D кишечных энтероидов
2. Создание энтероидного монослоя и анализа раны царапин
Влияние ГК на восстановление тканей и заживление ран в различных тканях и органах хорошо документировано; однако специфические эффекты ГК с молекулярной массой 35 кДа на заживление и регенерацию тонкой кишки плода или новорожденного в настоящее время неизвестны. Чтобы проверить спосо?...
Желудочно-кишечный тракт недоношенного ребенка находится под постоянным регенеративным давлением от повторного воздействия экологических оскорблений, связанных с дисбактериозом, воспалительными бактериальными метаболитами и токсинами и прерывистой гипоксией23,24
Авторам нечего раскрывать и нет конфликта интересов.
Этот контент является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. HC поддерживается грантом P20GM134973 от Национальных институтов здравоохранения. KB поддерживается грантом Фонда детских больниц (CHF) и Фонда пресвитерианского здравоохранения (PHF). Услуги визуализации живых клеток, предоставляемые ядром функциональной геномики рака, были частично поддержаны грантом Национального института общих медицинских наук P20GM103639 и грантом Национального института рака P30CA225520 Национальных институтов здравоохранения, присужденным Онкологическому центру Стивенсона Университета Оклахомы.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10 mL Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-675-49 | |
100x21mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 172931 | |
15 mL Conical tube | VWR | 89039-666 | |
24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate | Corning | 3524 | |
37 µM Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27215 | |
50 mL Conical tube | VWR | 89039-658 | |
70 µm Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | FB22-363-548 | |
Albumin, Bovine (BSA) | VWR | 0332-100G | |
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer | STEMCELL Technologies | 36254 | |
Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 100-0485 | |
ImageJ | NIH | imagej.nih.gov/ij/ | |
Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | 4647 | |
Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module | Sartorius | 9600-0012 | |
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies | 06010 | This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics. |
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | ThermoFisher Scientific | 136101 | |
PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | This is broad-spectrum antibiotics |
Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K | Lifecore Biomedical | HA20K-1 | |
TC20 Automated Cell Counter | Company: Bio-Rad | 1450102 | |
Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin | Fisher Scientific | MT25053CI | |
Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены