Effet de l’acide hyaluronique 35 kDa sur un modèle in vitro de lésion prématurée de l’intestin grêle prématuré et cicatrisation à l’aide de monocouches dérivées d’entéroïdes

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour établir et effectuer un essai de plaie par égratignures sur des monocouches bidimensionnelles (2D) dérivées d’entéroïdes tridimensionnels (3D) isolés de l’iléon de primates non humains.

Résumé

Les tests in vitro sur les rayures sont couramment utilisés pour étudier les mécanismes et les caractéristiques de la cicatrisation épithéliale dans divers types de tissus. Ici, nous décrivons un protocole pour générer une monocouche bidimensionnelle (2D) à partir d’entéroïdes de primates non humains tridimensionnels (3D) dérivés des cryptes intestinales de l’iléon terminal. Ces monocouches dérivées d’entéroïdes ont ensuite été utilisées dans un essai in vitro sur des rayures pour tester la capacité de l’hyaluronane 35 kDa (HA35), un imitateur HA du lait humain, à favoriser la migration et la prolifération cellulaires le long du bord de la plaie épithéliale. Une fois que les monocouches ont été cultivées jusqu’à la confluence, elles ont été grattées manuellement et traitées avec HA35 (50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL) ou témoin (PBS). La migration et la prolifération des cellules dans l’espace ont été imagées à l’aide d’un microscope à lumière transmise équipé pour l’imagerie de cellules vivantes. La fermeture des plaies a été quantifiée en pourcentage de cicatrisation à l’aide du plug-in Wound Healing Size dans ImageJ. La zone de rayure, le taux de migration cellulaire et le pourcentage de fermeture de la plaie ont été mesurés sur 24 heures. HA35 in vitro accélère la cicatrisation des plaies dans les monocouches entéroïdes de l’intestin grêle, probablement par une combinaison de prolifération cellulaire au bord de la plaie et de migration vers la zone de la plaie. Ces méthodes peuvent potentiellement être utilisées comme modèle pour explorer la régénération intestinale dans l’intestin grêle humain prématuré.

Introduction

L’entérocolite nécrosante (ECN) est l’une des urgences gastro-intestinales les plus courantes chez les nouveau-nés prématurés¹. La maladie se caractérise par une inflammation intestinale sévère qui peut rapidement se détériorer en nécrose intestinale, septicémie et potentiellement la mort. Bien que l’étiologie ne soit pas claire, les preuves suggèrent que l’ECN est multifactorielle et le résultat d’une interaction complexe de l’alimentation, d’une colonisation bactérienne anormale et d’un épithélium intestinal immature ^2,3. Les nouveau-nés prématurés ont une perméabilité intestinale acc....

Protocole

Toutes les procédures animales de cette étude ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Centre des sciences de la santé de l’Université de l’Oklahoma. À la suite de l’approbation institutionnelle, des échantillons de commodité de l’intestin grêle fœtal provenant d’un primate prématuré non humain (PSN, gestation à 90 %, babouin olive, Papio anubis) ont été prélevés après l’euthanasie pour une étude distincte (Protocole #101523-16-039-I)²⁰.

1. Établissement d’entéroïdes intestinaux 3D chez les primates non humains prématurés

1. Préparation d....

Résultats

Les effets de l’AH sur la réparation tissulaire et la cicatrisation des plaies dans divers tissus et organes sont bien documentés; cependant, les effets spécifiques de l’HA d’un poids moléculaire de 35 kDa sur la cicatrisation et la régénération de l’intestin grêle fœtal ou néonatal sont actuellement inconnus. Pour tester la capacité de HA35 à favoriser la cicatrisation des plaies dans un modèle de l’intestin grêle fœtal ou néonatal, nous avons généré des entéroïdes intestinaux 3D à partir.......

Discussion

Le tractus gastro-intestinal d’un nouveau-né prématuré est soumis à une pression régénératrice continue due à des expositions répétées à des agressions environnementales associées à la dysbiose, aux métabolites bactériens inflammatoires et aux toxines, et à l’hypoxie intermittente^23,24. Malheureusement, l’épithélium intestinal du nouveau-né prématuré est incapable d’établir rapidement l’intégrité fonctionnelle^2.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Serological Pipet	Fisher Scientific	13-675-49
100x21mm Dish, Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific	172931
15 mL Conical tube	VWR	89039-666
24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate	Corning	3524
37 µM Reversible Cell Strainer	STEMCELL Technologies	27215
50 mL Conical tube	VWR	89039-658
70 µm Sterile Cell Strainers	Fisher Scientific	FB22-363-548
Albumin, Bovine (BSA)	VWR	0332-100G
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer	STEMCELL Technologies	36254
Gentle Cell Dissociation Reagent	STEMCELL Technologies	100-0485
ImageJ	NIH	imagej.nih.gov/ij/
Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument	Sartorius	4647
Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module	Sartorius	9600-0012
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	STEMCELL Technologies	06010	This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics.
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography	Millipore Sigma	L3012-10MG
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free	Corning	356231
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate	ThermoFisher Scientific	136101
PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4	Corning	21-040-CM
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	This is broad-spectrum antibiotics
Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K	Lifecore Biomedical	HA20K-1
TC20 Automated Cell Counter	Company: Bio-Rad	1450102
Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin	Fisher Scientific	MT25053CI
Y-27632	STEMCELL Technologies	72302