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摘要

在这项研究中，使用两次不可避免的足电击在小鼠中诱导创伤后应激障碍 （PTSD） 样行为。使用几种 PTSD 特异性行为的分析来识别 PTSD 样和有弹性的动物。

摘要

创伤后应激障碍 （PTSD） 是一种使人衰弱的精神疾病，在暴露于创伤事件 （TE） 的个体中 ~10% 会诱发。症状包括反复出现和侵入性想法、睡眠障碍、过度警觉、夸张的惊吓以及鲁莽或破坏性行为。鉴于该疾病的复杂性和异质性，PTSD 样症状的动物模型越来越受到 PTSD 研究领域的关注。由于对 PTSD 样症状的恢复力是 PTSD 的一个重要流行病学方面，因此解决脆弱和恢复力动物的动物模型具有特别的价值。由于 PTSD 表型的复杂性以及 PTSD 样行为与其他压力诱发的精神病理学（如焦虑或抑郁）相关的行为之间的潜在重叠，利用多个读数进行 PTSD 样行为的动物模型也越来越有价值。我们利用 Lebow 等人在 2012 年开发的范式来诱导和鉴定小鼠的 PTSD 样症状。这种范式利用了不可避免的电足电击，在连续两天内分两次去情境化的疗程进行。应激小鼠执行四项行为测试——暗/光转移、大理石掩埋、声学惊吓和家笼活动——以生成 PTSD 样行为的五种行为读数：风险评估百分比 （%RA）、弹珠埋藏百分比 （%MB）、前脉冲抑制百分比 （%PPI）、峰值惊吓幅度潜伏期 （LPSA） 和明相活动百分比 （%LPA）。PTSD 样症状的特征是 %RA 降低、%MB 增加、%PPI 降低、LPSA 降低和 %LPA 增加。在每次测试中表现出最像 PTSD 的行为的 20% 的动物根据测试获得一定数量的分数，获得足够分数的动物被指定为 PTSD 样动物，而没有得分的动物被指定为 PTSD 弹性动物。该范式在 ~15% 的动物中识别出类似 PTSD 的行为，这一比率与在人类中观察到的比率相当。该协议代表了在小鼠中诱导 PTSD 样行为的稳健且可重复的范式。

引言

创伤后应激障碍 （PTSD） 是一种使人衰弱的精神病理学，可能在暴露于创伤事件 （TE） 的个体中诱发1。根据 DSM-V，te 暴露可能有多种形式，包括直接或反复间接暴露于真实或感知的死亡威胁、身体伤害或对自己或他人的性暴力2。PTSD 症状的特点是侵入性的消极想法和回忆、过度觉醒、过度警觉、冒险行为增加和睡眠周期中断3。全球 TE 暴露的终生患病率相对较高，约为 64%-70%3，但 PTSD 的终生患病率仍然相对较低，为 ~1.3%-12%4。相对于 PTSD 沉淀，TE 暴露患病率的这种差异表明，PTSD 的易感性存在很强的基因 x 环境相互作用。鉴于目前缺乏可靠的 PTSD 样行为脊椎动物模型，该领域依赖于行为范式来诱导 PTSD 样症状5。

PTSD 是一种复杂且高度异质性的精神疾病，为 PTSD 样症状开发一个强大而可靠的动物模型一直具有挑战性。PTSD 样行为（例如冻结）的常用读数也是其他创伤诱发的精神病理学的症状，即焦虑和抑郁6。PTSD 和抑郁症之间的高合并症使情况更加复杂2。最近的研究表明，目睹创伤事件的大鼠表现出焦虑和抑郁行为增加 7,8,9，进一步证明了在啮齿动物中使用 PTSD 行为模型时评估 PTSD 特异性行为的重要性。此外，创伤事件暴露后对 PTSD 样症状的恢复力是 PTSD 的一个重要流行病学特征，因为全球创伤事件暴露的终生发生率远远超过 PTSD 的终生患病率。从历史上看，诱导 PTSD 样行为的行为模型，例如调查恐惧记忆10,11 的行为模型，并没有从创伤暴露对照（PTSD 适应力动物）中解决 PTSD 样动物，将所有创伤暴露动物视为 PTSD 样动物，并且通常使用少数行为读数，例如冻结，要么不是 PTSD 的特异性症状，要么是其他创伤引起的精神病理学（如焦虑或抑郁）的症状12.虽然这些范式在研究恐惧记忆的神经回路方面是有效的，但缺乏对 PTSD 样行为的稳健和具体的评估可能会影响这些数据的翻译。因此，该领域的现状侧重于利用多个 PTSD 特定行为读数来识别类似 PTSD 和适应力的动物的范式12。

我们利用最近开发的一种范式来诱导小鼠的 PTSD 样行为，该范式使用一系列四种行为测试来识别 PTSD 样动物和弹性动物，以检测五种 PTSD 样行为读数13,14。PTSD 样行为是在两个疗程中使用去情境化的足部电击诱导的。动物在第一天首先暴露于严重的创伤会话，然后在第二天进行相对温和的触发会话（图 1）。这种组合已被证明可以显着增加 PTSD 样行为的沉淀。该范式利用急性应激模型来诱导 PTSD，而不是慢性应激（可能会诱发更抑郁的表型15）或创伤性脑损伤（可能导致独特的 PTSD 样表型14）。同样，在该范式中用于识别 PTSD 样行为的行为读数 - 减少冒险行为、增加大理石掩埋、减少前脉冲抑制、减少达到峰值惊吓幅度的潜伏期和增加光相活动（图 1） - 特定于 PTSD 样行为，而不是其他创伤引起的精神病理学，如焦虑或抑郁。此外，使用多个行为读数，以及动物需要表现出多种 PTSD 样行为才能被指定为 PTSD 样，这增加了被指定为 PTSD 样的动物真正表现出 PTSD 样表型的可能性。该协议的这些特点共同确保这种范式是在小鼠中诱导 PTSD 样症状的稳健可靠的方法。

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研究方案

此处描述的所有程序均已获得妙佑医疗国际机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 动物和住房

  1. 在标准饲养条件（标准微隔离器笼，70°F 室温 （RT）， 随意进食和水，12 小时/12 小时光照/黑暗循环）中 4 至 a-笼子的 10 周龄雄性 C57BL/6J 小鼠。

2. PTSD 诱导

  1. 创伤会话
    1. 准备恐惧调节设备和房间。
      1. 在恐惧条件反射软件中对创伤协议进行编程。将总时间设置为 5100 秒（85 分钟）。从时间 0 秒 - 时间 5,100 秒添加白光。以随机试验间隔 （ITI） 添加 14 个 1 s 电流。将电流调整为 1.0 mA。
      2. 用 1% 乙酸溶液擦拭每个恐惧调节室的所有内表面。
      3. 关掉手术室的灯，打开装有红灯灯泡的灯，照亮房间。
      4. 在不透明覆盖物下将要检测的动物直接运输到手术室。
      5. 让动物在黑暗中以 65 db（A） 的白噪声适应手术室 30 分钟。
      6. 将每只动物放入恐惧调节室中，确保腔室已锁定，然后使用恐惧调节软件启动协议。
      7. 协议完成后，将动物从恐惧调节室中取出并将它们放回笼子中。如果要在同一天对额外的动物笼子进行化验，请将暴露于创伤的动物运送到与家庭笼房分开的恢复室，以防止受创伤的动物向未受创伤的动物传达信息。
    2. 用 70% 乙醇清洁恐惧调节室的内部。如果要检测其他动物，请用 1% 乙酸清洁腔室内部并重复该方案，直到所有动物都被检测完。
    3. 触发会话
      1. 对触发器协议进行编程。将总时间设置为 300 秒（5 分钟）。在 60 s、120 s、180 s、240 s 和 300 s 时增加 1 s 电流。将电流调整为 0.7 mA。
      2. 将 A 型框架有机玻璃插件安装到恐惧调节室中，并用 10% 乙醇擦拭所有内表面。在每个消声隔间中放置一台白噪声机，并将声音输出调整为 70 dB（A）。
      3. 通过间接路线将发现的动物运送到恐惧调节程序室，这比创伤治疗的直接路线需要更长的时间。
      4. 让动物适应恐惧调节室 30 分钟。
      5. 将每只动物放入恐惧调节室，打开白噪声机，然后启动协议。
      6. 协议完成后，将动物从恐惧调节室中取出并将它们放回笼子中。
      7. 用 70% 乙醇清洁恐惧调节室的内部。如果要分析其他动物，请用 10% 乙醇清洁腔室内部。如果没有其他动物进行检测，则用 70% 乙醇清洁腔室内部。

3. 行为评估

  1. 暗/亮转移
    1. 将明/暗传输盒布置在吊顶式摄像机下方。放大相机直到明/暗框填满视野，然后调整焦距以使图像清晰。在连接光明和黑暗竞技场的门口上放置一块不透明的塑料。
      1. 在运动跟踪软件中定义灯光场和风险评估区域（灯光场门外的 1 英寸 x 3 英寸区域）。
      2. 将明亮场地的照明调整为 1,000-1,100 勒克斯。
      3. 将动物运送到手术室，让动物适应 30 分钟。
      4. 将每只动物放入黑暗的竞技场中并盖上盖子。拆除分隔明暗室的门口，并记录动物的运动 5 分钟。
      5. 从设备中取出动物并用 70% 乙醇清洁所有表面。
      6. 通过在风险评估区花费的时间除以在 Light Arena 中花费的总时间来计算每只动物的风险评估百分比。
      7. 将所有动物放回它们的家笼子里。用 70% 乙醇彻底清洁亮/暗盒。
  2. 大理石埋设试验
    1. 在标准大鼠微隔离器笼或类似外壳中进行大理石埋设试验。在每个笼子里装满 5 厘米的新鲜床上用品。将笼子放在手术室的长凳上，并将灯光调节到 <10 勒克斯。
    2. 将 20 个干净的黑色玻璃弹珠均匀分布在每个笼子底部，以 5 x 4 的网格排列。
    3. 将动物转移到大理石掩埋手术室，让动物适应 30 分钟。
    4. 将每只动物放入大理石掩埋场中 25 分钟。25 分钟后，将每只鼠标从竞技场中取出并将其放回笼子中。
    5. 通过将埋藏的弹珠数除以 20 来计算埋藏的弹珠百分比。
  3. 声学惊吓响应
    1. 在惊吓响应软件中定义惊吓、无刺激和前脉冲惊吓试验。
      1. 定义 120 dB（A） 的惊吓刺激，以在测量惊吓振幅的同时发出 120 dB（A） 的 40 ms 音调。
      2. 定义 75 dB（A）、80 dB（A） 和 85 dB（A） 前脉冲刺激，以分别发出 75 dB（A）、80 dB（A） 或 85 dB（A） 的 40 ms 音调，然后是 120 dB（A） 的 40 ms 音调，同时测量惊吓幅度。
      3. 定义无惊吓刺激，在测量惊吓振幅时发出 65 dB（A） 的 40 ms 音调（背景）。
    2. 定义声学惊吓响应会话。
      1. 将背景设置为与 65 db（A） 相关的模拟电平。
      2. 在会话开始时添加 7 个 120 db（A） 惊吓试验，然后是另外 10 个 120 db（A） 惊吓试验，随机穿插 12 个无刺激试验，12 个 75 db（A） 前脉冲试验，12 个 80 db（A） 前脉冲试验，12 个 85 db（A） 前脉冲试验，12 个 85 db（A） 前脉冲试验，然后是最后 7 个 120 db（A） 惊吓刺激。
    3. 将动物转移到与声学惊吓反应室相邻的房间，让动物适应 30 分钟。
    4. 驯化 30 分钟后，将要评估的动物转移到黑暗中的手术室。
    5. 将每只动物放入声学惊吓装置的束缚器中，更换用于束缚每只动物的插件，然后关闭隔音隔间的门。确保插件的位置使动物位于振动传感器的中心，但仍能够自由转动。
    6. 使用惊吓响应软件启动协议。
    7. 协议结束后，将所有动物从声学惊吓装置移到转移笼中。
    8. 用 70% 乙醇彻底擦拭内表面，清洁动物笼。
    9. 通过平均每只动物的所有 120 dB（A） 惊吓刺激达到最大速度值的时间，计算达到峰值惊吓振幅的潜伏期。
    10. 计算 % 前脉冲抑制。计算 120 dB（A） 惊吓刺激、无惊吓、75 dB（A） 惊吓刺激、80 db（A） 惊吓刺激和 85 dB（A） 惊吓刺激的平均 Vmax 值。通过从 120 dB（A） 的平均 Vmax 中减去无惊吓刺激的平均 Vmax 来计算净平均惊吓幅度。通过将每个平均前脉冲 Vmax 除以平均 120 dB（A） Vmax，从 1 中减去该比率并乘以 100，计算 75 db（A）、80 dB（A） 和 85 dB（A） 前脉冲启动的 % 预脉冲抑制。通过平均 75 dB（A）、80 dB（A） 和 85 db（A） % 的脉冲前抑制来计算平均 % 脉冲前抑制。
  4. 家居笼子活动
    1. 在带有改装盖子的微隔离器笼中进行家庭笼子活动，该笼子配有被动红外传感器，可检测动物的运动。用装有塞子吸管的 50 mL 锥形管替换标准水瓶，以减少笼底被挡住运动传感器视野的区域。将适量的食物（50-75 克）放入金属丝笼插件中，以减少运动传感器的阻塞。
    2. 在声学惊吓反应测试后，将动物运送到家庭笼子活动室。
    3. 将每只动物放入经过改装的微隔离器笼中，并确保 IR 传感器正在读取运动。装回金属丝架顶部和盖子。
    4. 在检测过程中每天检查动物，以确保每只动物都有足够的食物和水。
    5. 将动物安置在家庭笼子活动笼中 3 次光照/黑暗循环 （72 h）。
    6. 在 72 小时后，停止记录并将所有动物从家笼中取出。
    7. 通过将第二和第三轻相期间的活动发作总数除以监测的最后 48 小时的活动发作总数来计算 % 轻相活动。
  5. 评分和纳入
    1. 通过减去该队列中该行为测试的平均值，然后除以该队列中该行为测试的标准差，计算每只动物的风险评估百分比、埋藏弹珠百分比、平均前脉冲抑制百分比、峰值惊吓幅度潜伏期和光相活动读数百分比的 Z 值该队列中。
    2. 对于每个行为读数，前 20% 最像 PTSD 的动物将获得奖励积分。显示最低风险评估百分比、最高埋藏弹珠百分比、最低平均前脉冲抑制百分比、峰值惊吓幅度最低潜伏期和最高 % 光相活动的前 20% 动物分别获得 3、1、2、3 和 1 分（表 1）。
    3. 将每只动物在行为测试中获得的所有分数相加。将获得 5 分或以上的动物指定为类似 PTSD，将获得 0 分的动物指定为适应力动物。

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结果

我们希望看到动物在每次行为测试中表现出类似 PTSD 的行为，均匀分布在所有队列中。任何一个队列中 PTSD 样动物的集中可能表明在 PTSD 诱导或行为测试期间引入了伪影。在每个行为读数中得分的动物在所有测试的队列中平均分布（图 2）。暴露于 PTSD 诱导范式的 48 只动物中有 7 只 （14.6%） 得分 5 分或更高，并被指定为 PTSD 样（图 3...

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讨论

PTSD 是一种复杂且异质性的精神疾病。不幸的是，目前没有可靠的 PTSD 样行为动物模型，诱导 PTSD 样行为的行为范式是生成表现出 PTSD 样行为表型的动物的最可靠方法。这里描述的范式提供了一种强大而可靠的方法来沉淀 PTSD 样行为表型，因为使用急性创伤来诱发 PTSD 样行为，并使用多个 PTSD 特异性行为读数来识别 PTSD 样动物。该范式中使用的 PTSD 特异性行为具有高度临?...

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披露声明

没有作者有任何冲突需要披露。

致谢

这项工作得益于海沃德基金会 （Hayward Foundation） 和万豪家族 （Marriot Family） 的慷慨解囊。我们还要感谢杜兰大学和妙佑医疗国际 IACUC 委员会和比较医学系以及妙佑医疗国际啮齿动物行为研究机构的辛勤工作和专业知识。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acid, glacialSigma AldrichAX0073
Benchtop BalanceFisher Scientific01-913-925
Clocklab Data Collection SuiteActimetrics-Home cage activity cages
Deciblemeter
Ethovision XT14 SoftwareNoldus-Movement tracking software
Ethyl alcoholSigma Aldrich443611
Light/Dark BoxNoldus-Light/dark transfer box
Lux Meter
Monochrome GigE CameraNoldus-Requires Ceiling Mounting Hardware Available from Noldus
NIR Video Fear Conditioning Package for Mouse [Standard, USB]Med AssociatesMED-VFC2-USB-MFear conditioning equipment and chamber. Package includes all equipment needed to assay 1 animal at a time.
Spray BottleThermo ScientificBirA500
SR LAB SoftwareSan Diego Instruments-Startle response software
SR LAB Startle Response UnitSan Diego Instruments-Acoustic startle unit
Video Fear Coniditioning "Video Freeze " SoftwareMed AssociatesSOF-843Fear conditioning software
White noise machineMed AssociatesENV-230

参考文献

  1. Yehuda, R., et al. Post-traumatic stress disorder. Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15057(2015).
  2. Flory, J. D., Yehuda, R. Comorbidity between post-traumatic stress disorder and major depressive disorder: alternative explanations and treatment considerations. Dialogues in Clinical Neuroscience. 17 (2), 141(2015).
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  4. Karam, E. G., et al. Cumulative traumas and risk thresholds: 12-month PTSD in the World Mental Health (WMH) surveys. Depression and Anxiety. 31 (2), 130-142 (2014).
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