Un protocole pour l’induction d’un comportement semblable au trouble de stress post-traumatique (SSPT) chez la souris

Résumé

Dans cette étude, un comportement semblable au syndrome de stress post-traumatique (SSPT) est induit chez les souris à l’aide de deux séances de choc électrique inévitable du pied. Les animaux de type PTSD et résilients sont identifiés à l’aide de plusieurs tests pour les comportements spécifiques au SSPT.

Résumé

Le trouble de stress post-traumatique (TSPT) est un état psychiatrique débilitant qui précipite chez ~10 % des individus exposés à un événement traumatique (TE). Les symptômes comprennent des pensées récurrentes et intrusives, des troubles du sommeil, une hypervigilance, un sursaut exagéré et un comportement imprudent ou destructeur. Compte tenu de la nature complexe et hétérogène de la maladie, les modèles animaux de symptomatologie de type SSPT suscitent un intérêt croissant dans le domaine de la recherche sur le TSPT. Parce que la résilience à la symptomatologie de type SSPT est un aspect épidémiologique important du SSPT, les modèles animaux qui résolvent les animaux vulnérables et résilients sont particulièrement précieux. En raison de la nature complexe du phénotype du TSPT et des chevauchements potentiels entre le comportement de type SSPT et les comportements associés à d’autres psychopathologies induites par le stress telles que l’anxiété ou la dépression, les modèles animaux qui utilisent plusieurs lectures pour le comportement de type SSPT ont également une valeur croissante. Nous utilisons un paradigme développé par Lebow et al. 2012 pour l’induction et l’identification de la symptomatologie de type SSPT chez la souris. Ce paradigme utilise l’inévitable choc électrique du pied, administré en deux séances décontextualisées sur deux jours consécutifs. Les souris stressées effectuent quatre tests comportementaux - transfert sombre/lumière, enterrement de billes, sursaut acoustique et activité de la cage domestique - pour générer cinq lectures comportementales du comportement de type SSPT : % d’évaluation du risque ( %RA), % de billes enfouies ( %MB), % d’inhibition prépulsive ( %PPI), latence jusqu’à l’amplitude de sursaut maximale (LPSA) et % d’activité de la phase lumineuse ( %LPA). La symptomatologie de type SSPT est caractérisée par une diminution du % de PR, une augmentation du % MB, une diminution du % IPP, une diminution du LPSA et une augmentation du % LPA. Les 20 % d’animaux présentant le plus de comportements similaires au SSPT dans chaque test se voient attribuer un certain nombre de points en fonction du test, et les animaux obtenant suffisamment de points sont désignés comme étant de type PTSD, tandis que les animaux n’obtenant aucun point sont désignés comme résilients au SSPT. Ce paradigme identifie un comportement semblable au SSPT chez ~15 % des animaux, un taux comparable à celui observé chez les humains. Ce protocole représente un paradigme robuste et reproductible pour l’induction d’un comportement de type SSPT chez la souris.

Introduction

Le trouble de stress post-traumatique (TSPT) est une psychopathologie débilitante qui peut se précipiter chez les personnes qui ont été exposées à un événement traumatisant (TE)¹. Selon le DSM-V, l’exposition à l’ET peut prendre de nombreuses formes, y compris l’exposition directe ou indirecte répétée à une menace réelle ou perçue de mort, de lésions corporelles ou de violence sexuelle envers soi-même ou autrui². La symptomatologie du SSPT se caractérise par des pensées et des souvenirs négatifs intrusifs, une hyperexcitation, une hypervigilance, une augmentation des comportements à risque et des cycles de sommeil perturbés³. La prévalence au cours de la vie de l’exposition à l’ET dans le monde est relativement élevée, à environ 64 % à 70 %³, bien que la prévalence au cours de la vie du SSPT reste relativement faible, à ~1,3 % à 12 %⁴. Cette disparité dans la prévalence de l’exposition aux TE par rapport à la précipitation du TSPT suggère une forte interaction gène x environnement dans la vulnérabilité au TSPT. Étant donné l’absence actuelle d’un modèle vertébré fiable du comportement de type SSPT, le domaine s’appuie sur des paradigmes comportementaux pour l’induction d’une symptomatologie de type SSPT⁵.

Le TSPT est un trouble psychiatrique complexe et très hétérogène, et le développement d’un modèle animal robuste et fiable pour la symptomatologie de type TSPT a été un défi. Les lectures couramment utilisées pour un comportement semblable au SSPT, comme la congélation, sont également symptomatiques d’autres psychopathologies induites par un traumatisme, à savoir l’anxiété et la dépression⁶. La situation est encore compliquée par la forte comorbidité entre le SSPT et la dépression². Des recherches récentes ont montré que les rats qui ont été témoins d’événements traumatisants présentent une augmentation des comportements d’anxiété et de dépression ^7,8,9, démontrant ainsi l’importance d’évaluer les comportements spécifiques au SSPT lors de l’utilisation de modèles comportementaux de SSPT chez les rongeurs. De plus, la résilience à la symptomatologie de type SSPT après l’exposition à un événement traumatique est une caractéristique épidémiologique importante du SSPT, car l’incidence au cours de la vie de l’exposition à un événement traumatique dans le monde dépasse de loin la prévalence du TSPT au cours de la vie. Historiquement, les modèles comportementaux pour l’induction d’un comportement semblable au SSPT, tels que ceux étudiant la mémoire de peur^10,11, n’ont pas résolu les animaux de type PTSD des témoins exposés au traumatisme (animaux résilients au SSPT), traitant tous les animaux exposés au traumatisme comme étant de type PTSD, et utilisaient couramment quelques lectures de comportement, telles que la congélation, qui ne sont pas spécifiquement symptomatiques du SSPT ou sont symptomatiques d’autres psychopathologies induites par le traumatisme telles que l’anxiété ou la dépression¹². Bien que ces paradigmes soient efficaces pour étudier les circuits neuronaux de la mémoire de la peur, l’absence d’une évaluation robuste et spécifique du comportement de type SSPT peut avoir un impact sur la traduction de ces données. L’état actuel du domaine se concentre donc sur des paradigmes utilisant de multiples lectures comportementales spécifiques au SSPT pour identifier à la fois les animaux de type PTSD et les animaux résilients¹².

Nous utilisons un paradigme récemment développé pour l’induction d’un comportement de type SSPT chez la souris, qui identifie à la fois les animaux de type PTSD et les animaux résilients à l’aide d’une série de quatre tests comportementaux pour analyser cinq lectures comportementales de type PTSD^13,14. Un comportement semblable au SSPT est induit à l’aide d’un choc électrique du pied décontextualisé sur deux séances. Les animaux sont d’abord exposés à une séance de traumatisme sévère le premier jour, suivie d’une séance de déclenchement relativement légère le lendemain (Figure 1). Il a été démontré que cette combinaison augmente considérablement la précipitation d’un comportement semblable au SSPT. Ce paradigme utilise un modèle de stress aigu pour l’induction du TSPT plutôt que le stress chronique (qui peut induire un phénotype¹⁵ plus dépressif) ou une lésion cérébrale traumatique (qui peut entraîner un phénotype¹⁴ distinct de type SSPT). De même, les lectures comportementales utilisées pour identifier les comportements similaires au SSPT dans ce paradigme - comportement de prise de risque réduit, augmentation de l’enfouissement des billes, inhibition prépulsive réduite, latence réduite jusqu’à l’amplitude maximale du sursaut et augmentation de l’activité de la phase lumineuse (Figure 1) - sont spécifiques au comportement de type SSPT, plutôt qu’à d’autres psychopathologies induites par un traumatisme telles que l’anxiété ou la dépression. De plus, l’utilisation de plusieurs lectures comportementales et la nécessité pour les animaux d’afficher plusieurs comportements similaires au SSPT afin d’être désignés comme PTSD augmentent la probabilité que les animaux désignés comme PTSD présentent réellement un phénotype semblable au SSPT. Ensemble, ces caractéristiques du protocole garantissent que ce paradigme est un moyen robuste et fiable d’induire une symptomatologie de type SSPT chez la souris.

Protocole

Toutes les procédures décrites ici sont approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de la Mayo Clinic (IACUC).

1. Animaux et logement

1. Hébergez des souris C57BL/6J mâles de 10 semaines à 4 par cage dans des conditions de logement standard (cage de micro-isolement standard, température ambiante de 70 °F (RT), nourriture et eau à volonté, cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h).

2. Induction du TSPT

1. Séance de traumatologie
   1. Préparez l’équipement et la chambre de conditionnement de la peur.
      1. Programmez le protocole de traumatisme dans le logiciel de conditionnement de la peur. Réglez la durée totale sur 5100 s (85 min). Ajouter une lumière blanche de Temps 0 s à Temps 5 100 s. Ajouter quatorze courants de 1 s à un intervalle inter-essais aléatoire (ITI). Réglez le courant à 1,0 mA.
      2. Essuyez toutes les surfaces intérieures de chaque chambre de conditionnement de la peur avec une solution d’acide acétique à 1 %.
      3. Éteignez la lumière de la salle d’intervention et allumez une lampe équipée d’une ampoule rouge pour éclairer la pièce.
      4. Transportez les animaux à analyser directement dans la salle d’intervention sous un revêtement opaque.
      5. Laissez les animaux s’acclimater à la salle d’intervention pendant 30 minutes dans l’obscurité avec un bruit blanc de 65 db(A).
      6. Placez chaque animal dans une chambre de conditionnement de la peur, assurez-vous que la chambre est verrouillée et démarrez le protocole à l’aide du logiciel de conditionnement de la peur.
      7. Lorsque le protocole est terminé, retirez les animaux des chambres de conditionnement de la peur et remettez-les dans leur cage. Si d’autres cages d’animaux doivent être analysées le même jour, transportez les animaux exposés à un traumatisme dans une salle de réveil distincte de la salle de la cage familiale pour empêcher les animaux traumatisés de communiquer de l’information aux animaux naïfs de traumatisme.
   2. Nettoyez l’intérieur des chambres de conditionnement de la peur avec de l’éthanol à 70 %. Si d’autres animaux doivent être analysés, nettoyez l’intérieur de la chambre avec de l’acide acétique à 1 % et répétez le protocole jusqu’à ce que tous les animaux aient été analysés.
   3. Séance de déclenchement
      1. Programmez le protocole de déclenchement. Réglez la durée totale sur 300 s (5 min). Ajoutez 1 s de courants parfois 60 s, 120 s, 180 s, 240 s et 300 s. Réglez le courant à 0,7 mA.
      2. Installez des inserts en plexiglas dans la chambre de conditionnement de la peur et essuyez toutes les surfaces intérieures avec de l’éthanol à 10 %. Placez un appareil à bruit blanc dans chaque cabine d’atténuation du bruit et réglez la sortie sonore à 70 dB(A).
      3. Transportez les animaux découverts jusqu’à la salle de traitement de conditionnement de la peur par une voie indirecte, ce qui prend plus de temps que la route directe empruntée pour la séance de traumatisme.
      4. Laissez les animaux s’acclimater à la salle de conditionnement de la peur pendant 30 min.
      5. Placez chaque animal dans une chambre de conditionnement de la peur, allumez la machine à bruit blanc et démarrez le protocole.
      6. Lorsque le protocole est terminé, retirez les animaux des chambres de conditionnement de la peur et remettez-les dans leur cage.
      7. Nettoyez l’intérieur des chambres de conditionnement de la peur avec de l’éthanol à 70 %. Si d’autres animaux doivent être testés, nettoyez l’intérieur de la chambre avec de l’éthanol à 10 %. Si aucun autre animal ne doit être testé, nettoyez l’intérieur de la chambre avec de l’éthanol à 70 %.

3. Évaluation comportementale

1. Transfert obscurité/lumière
   1. Disposez la boîte de transfert clair/foncé sous la caméra montée au plafond. Zoomez sur l’appareil photo jusqu’à ce que la zone claire/sombre remplisse le champ de vision et ajustez la mise au point de manière à ce que l’image soit claire. Placez un morceau de plastique opaque sur la porte reliant les arènes claires et sombres.
      1. Définissez l’arène lumineuse et la zone d’évaluation des risques (une zone de 1 pouce x 3 pouces directement à l’extérieur de la porte dans l’arène lumineuse) dans le logiciel de suivi des mouvements.
      2. Ajustez l’éclairage de l’arène lumineuse à 1 000-1 100 lux.
      3. Transportez les animaux jusqu’à la salle d’intervention et laissez-les s’acclimater pendant 30 min.
      4. Placez chaque animal dans l’arène sombre et remettez le couvercle en place. Retirez la porte séparant les chambres claires et sombres et enregistrez les mouvements de l’animal pendant 5 min.
      5. Retirez l’animal de l’appareil et nettoyez toutes les surfaces avec de l’éthanol à 70 %.
      6. Calculez le pourcentage d’évaluation des risques pour chaque animal en divisant le temps passé dans la zone d’évaluation des risques par le temps total passé dans l’arène légère.
      7. Remettez tous les animaux dans leurs cages d’origine. Nettoyez soigneusement la boîte claire/foncée avec de l’éthanol à 70 %.
2. Test d’enfouissement du marbre
   1. Effectuez le test d’enfouissement du marbre dans une cage de micro-isolement standard pour rats ou un enclos similaire. Remplissez chaque cage avec de la litière fraîche de 5 cm. Disposez les cages sur le banc de la salle d’intervention et ajustez les lumières à <10 lux.
   2. Disposez 20 billes de verre noir propres dans une grille de 5 x 4 uniformément espacée au bas de chaque cage.
   3. Transférez les animaux dans la salle d’enterrement du marbre pour leur permettre de s’acclimater pendant 30 minutes.
   4. Placez chaque animal dans une arène d’enterrement de marbre pendant 25 min. Après 25 min, retirez chaque souris de son arène et remettez-la dans sa cage.
   5. Calculez le % de billes enterrées en divisant le nombre de billes enterrées par 20.
3. Réponse de sursaut acoustique
   1. Définissez les essais de sursaut, d’absence de stimulus et de sursaut pré-impulsionnel dans le logiciel de réponse au sursaut.
      1. Définissez le stimulus de sursaut de 120 dB(A) pour émettre une tonalité de 40 ms de 120 dB(A) tout en mesurant l’amplitude du sursaut.
      2. Définissez les stimuli pré-impulsionnels de 75 dB(A), 80 dB(A) et 85 dB(A) pour émettre une tonalité de 40 ms de 75 dB(A), 80 dB(A) ou 85 dB(A), respectivement, suivie d’une tonalité de 40 ms de 120 dB(A) tout en mesurant l’amplitude du sursaut.
      3. Définissez le stimulus sans sursaut pour émettre une tonalité de 40 ms de 65 dB(A) (arrière-plan) tout en mesurant l’amplitude du sursaut.
   2. Définissez la session de réponse acoustique en cas de sursaut.
      1. Réglez l’arrière-plan au niveau analogique correspondant à 65 db(A).
      2. Ajoutez sept essais de sursaut de 120 db(A) au début de la séance, suivis de dix autres essais de sursaut de 120 db(A) entrecoupés aléatoirement de douze essais sans stimulus, douze essais de préimpulsion de 75 db(A), douze essais de préimpulsion de 80 db(A) et douze essais de préimpulsion de 85 db(A), suivis de sept derniers stimuli de sursaut de 120 db(A).
   3. Transférez les animaux dans une pièce adjacente à la salle d’intervention de réponse acoustique au sursaut et laissez-les s’acclimater pendant 30 minutes.
   4. Après l’acclimatation de 30 minutes, transférez les animaux à évaluer dans la salle d’intervention dans l’obscurité.
   5. Placez chaque animal dans la contention de l’unité de sursaut acoustique, replacez les inserts pour retenir chaque animal et fermez la porte de la cabine d’atténuation du bruit. Assurez-vous que les inserts sont positionnés de manière à ce que l’animal soit centré sur le capteur de vibrations, mais qu’il puisse toujours se retourner librement.
   6. Démarrez le protocole à l’aide du logiciel de réponse de sursaut.
   7. À la fin du protocole, retirer tous les animaux de l’appareil de sursaut acoustique dans la cage de transfert.
   8. Nettoyez la contention des animaux en essuyant soigneusement les surfaces intérieures avec de l’éthanol à 70 %.
   9. Calculez la latence jusqu’au pic d’amplification en faisant la moyenne des valeurs de temps jusqu’à la vitesse maximale pour tous les stimuli de sursaut de 120 dB(A) pour chaque animal.
   10. Calculez le % d’inhibition de pré-impulsion. Calculez la valeur moyenne de Vmax pour les stimuli de sursaut de 120 dB(A), l’absence de sursaut, les stimuli de sursaut de 75 dB(A), les stimuli de sursaut de 80 dB(A) et les stimuli de sursaut de 85 dB(A). Calculez l’amplitude de sursaut moyenne nette en soustrayant la Vmax moyenne pour l’absence de stimuli de sursaut de la Vmax moyenne pour 120 dB(A). Calculez le % d’inhibition de la préimpulsion pour les sursauts de préimpulsion de 75 dB(A), 80 dB(A) et 85 dB(A) en divisant chaque Vmax moyenne de préimpulsion par la Vmax moyenne de 120 dB(A), en soustrayant ce rapport de 1 et en multipliant par 100. Calculez le % moyen d’inhibition pré-impulsion en faisant la moyenne des 75 dB(A), 80 dB(A) et 85 dB(A) % d’inhibitions pré-impulsion.
4. Activité en cage à domicile
   1. Effectuez l’activité de la cage domestique dans des cages de micro-isolement avec des couvercles modifiés équipés de capteurs infrarouges passifs qui détectent les mouvements des animaux. Remplacez les bouteilles d’eau standard par des tubes coniques de 50 ml équipés d’un bouchon d’aspiration pour réduire la zone du fond de la cage obstruée par le capteur de mouvement. Placez une quantité limitée de nourriture (50-75 g) dans l’insert de la cage métallique pour réduire l’obstruction du capteur de mouvement.
   2. Transportez les animaux jusqu’à la salle d’activités de la cage à la maison après le test de réponse acoustique au sursaut.
   3. Placez chaque animal dans une cage de micro-isolement modifiée et assurez-vous que le capteur IR lit les mouvements. Replacez le haut et le couvercle de la cage métallique.
   4. Vérifiez les animaux tous les jours au cours de l’essai pour vous assurer qu’ils ont un accès suffisant à la nourriture et à l’eau.
   5. Hébergez les animaux dans les cages d’activité de la cage domestique pendant 3 cycles lumière/obscurité (72 h).
   6. Après la période de 72 heures, arrêtez l’enregistrement et retirez tous les animaux de leurs cages d’origine.
   7. Calculez le pourcentage d’activité de la phase lumineuse en divisant le nombre total de périodes d’activité au cours des deuxième et troisième phases lumineuses par le nombre total de périodes d’activité des 48 dernières heures de surveillance.
5. Scoring et inclusion
   1. Calculez la valeur Z pour le % d’évaluation du risque, le % de billes enterrées, le % moyen d’inhibition prépulsive, la latence jusqu’à l’amplitude maximale du sursaut et le % d’activité de la phase lumineuse pour chaque animal en soustrayant la valeur moyenne de ce test comportemental dans cette cohorte, puis en divisant par l’écart-type de ce test comportemental dans cette cohorte.
   2. Attribuez des points aux 20 % d’animaux les plus atteints de TSPT pour chaque lecture comportementale. Les 20 % d’animaux présentant le pourcentage le plus faible d’évaluation du risque, le pourcentage le plus élevé de billes enterrées, le pourcentage moyen le plus bas d’inhibition prépulsive, la latence la plus faible jusqu’à l’amplitude de sursaut maximale et le pourcentage le plus élevé d’activité de la phase lumineuse reçoivent respectivement 3, 1, 2, 3 et 1 point (tableau 1).
   3. Additionnez tous les points reçus par chaque animal dans les tests comportementaux. Désignez les animaux qui reçoivent 5 points ou plus comme étant de type TSPT et désignez les animaux qui reçoivent 0 point comme étant résilients.

Résultats

Nous nous attendons à ce que les animaux affichent un comportement semblable au SSPT dans chaque test comportemental, uniformément répartis dans toutes les cohortes. Une concentration d’animaux de type SSPT dans une cohorte peut indiquer des artefacts introduits lors de l’induction du TSPT ou des tests comportementaux. Les animaux qui ont obtenu des points dans chaque lecture comportementale sont répartis de manière égale dans toutes les cohortes testées (...

Discussion

Le TSPT est une maladie psychiatrique complexe et hétérogène. Malheureusement, il n’existe actuellement aucun modèle animal fiable pour un comportement de type SSPT, et les paradigmes comportementaux pour l’induction d’un comportement de type PTSD sont les moyens les plus fiables de générer des animaux présentant un phénotype comportemental de type PTSD. Le paradigme décrit ici fournit un moyen robuste et fiable de précipiter un phénotype comportemental de type SSPT en r...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid, glacial	Sigma Aldrich	AX0073
Benchtop Balance	Fisher Scientific	01-913-925
Clocklab Data Collection Suite	Actimetrics	-	Home cage activity cages
Deciblemeter
Ethovision XT14 Software	Noldus	-	Movement tracking software
Ethyl alcohol	Sigma Aldrich	443611
Light/Dark Box	Noldus	-	Light/dark transfer box
Lux Meter
Monochrome GigE Camera	Noldus	-	Requires Ceiling Mounting Hardware Available from Noldus
NIR Video Fear Conditioning Package for Mouse [Standard, USB]	Med Associates	MED-VFC2-USB-M	Fear conditioning equipment and chamber. Package includes all equipment needed to assay 1 animal at a time.
Spray Bottle	Thermo Scientific	BirA500
SR LAB Software	San Diego Instruments	-	Startle response software
SR LAB Startle Response Unit	San Diego Instruments	-	Acoustic startle unit
Video Fear Coniditioning "Video Freeze " Software	Med Associates	SOF-843	Fear conditioning software
White noise machine	Med Associates	ENV-230