Протокол индукции поведения, подобного посттравматическому стрессовому расстройству (ПТСР), у мышей

Резюме

В этом исследовании поведение, подобное посттравматическому стрессовому расстройству (ПТСР), индуцируется у мышей с помощью двух сеансов неизбежного электрического удара ногой. Животные, похожие на ПТСР и устойчивые к ПТСР, идентифицируются с помощью нескольких тестов на поведение, специфичное для ПТСР.

Аннотация

Посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР) — это изнурительное психическое состояние, которое провоцируется у ~10% людей, подвергшихся травматическому событию (ТЭ). Симптомы включают повторяющиеся и навязчивые мысли, нарушение сна, гипербдительность, преувеличенную испуганность и безрассудное или деструктивное поведение. Учитывая сложный и гетерогенный характер заболевания, животные модели ПТСР-подобной симптоматики представляют все больший интерес для области исследований ПТСР. Поскольку устойчивость к симптоматике, подобной ПТСР, является важным эпидемиологическим аспектом ПТСР, модели на животных, которые разрешают уязвимость и устойчивость животных, имеют особую ценность. Из-за сложной природы фенотипа ПТСР и потенциального перекрытия между поведением, подобным ПТСР, и поведением, связанным с другими психопатологиями, вызванными стрессом, такими как тревога или депрессия, модели на животных, которые используют множественные показания для поведения, похожего на ПТСР, также имеют все большую ценность. Мы используем парадигму, разработанную Lebow et al. 2012, для индукции и идентификации симптоматики, подобной ПТСР, у мышей. Эта парадигма использует неизбежный электрический удар ногой, вводимый в ходе двух сеансов в течение двух дней подряд. Мыши, подвергшиеся стрессу, проводят четыре поведенческих теста - перенос темноты/света, закапывание мрамора, акустический испуг и активность в домашней клетке - для получения пяти поведенческих показаний поведения, подобного ПТСР: % оценки риска (%RA), % зарытых шариков (%MB), % предимпульсного торможения (%PPI), латентности до пиковой амплитуды испуга (LPSA) и % активности световой фазы (%LPA). Симптоматика, подобная ПТСР, характеризуется снижением %РА, увеличением %MB, снижением %PPI, снижением LPSA и увеличением %LPA. 20% животных, демонстрирующих наиболее похожее на ПТСР поведение в каждом тесте, получают определенное количество баллов в зависимости от теста, и животные, набравшие достаточное количество баллов, обозначаются как ПТСР-подобные, в то время как животные, не набравшие ни одного балла, обозначаются как устойчивые к ПТСР. Эта парадигма идентифицирует поведение, подобное ПТСР, у ~15% животных, что сопоставимо с тем, что наблюдается у людей. Этот протокол представляет собой надежную и воспроизводимую парадигму для индукции поведения, подобного ПТСР, у мышей.

Введение

Посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР) — это изнурительная психопатология, которая может развиться у людей, подвергшихся воздействию травматического события (ТЭ)¹. Согласно DSM-V, TE может принимать различные формы, включая прямое или неоднократное косвенное воздействие реальной или предполагаемой угрозы смерти, телесных повреждений или сексуального насилия над собой^{или другим лицом}. Симптоматика ПТСР характеризуется навязчивыми негативными мыслями и воспоминаниями, гипервозбуждением, гипербдительностью, повышенной склонностью к риску и нарушением циклов сна³. Распространенность ПТСР в течение жизни во всем мире относительно высока и составляет примерно 64%-70%³, хотя распространенность ПТСР в течение жизни остается сравнительно низкой, на уровне ~1,3%-12%⁴. Это несоответствие в распространенности воздействия ТЭ по сравнению с преципитацией ПТСР предполагает сильное взаимодействие гена и окружающей среды в уязвимости к ПТСР. Учитывая отсутствие в настоящее время надежной модели ПТСР-подобного поведения у позвоночных, эта область полагается на поведенческие парадигмы для индукции ПТСР-подобной^{симптоматики}.

ПТСР является сложным и очень гетерогенным психическим расстройством, и разработка устойчивой и надежной животной модели симптоматики, подобной ПТСР, была сложной задачей. Обычно используемые показания для поведения, подобного ПТСР, такого как замирание, также являются симптомами других психопатологий, вызванных травмой, а именно тревоги и^{депрессии.} Это еще больше осложняется высокой коморбидностью между ПТСР и депрессией². Недавние исследования показали, что крысы, ставшие свидетелями травматических событий, демонстрируют повышенное тревожное и депрессивное поведение ^7,8,9, что еще раз демонстрирует важность оценки поведения, специфичного для ПТСР, при использовании поведенческих моделей ПТСР у грызунов. Кроме того, устойчивость к симптоматике, подобной ПТСР, после воздействия травматического события является важной эпидемиологической особенностью ПТСР, поскольку частота воздействия травматических событий в течение жизни во всем мире намного превышает распространенность ПТСР в течение всей жизни. Исторически сложилось так, что поведенческие модели для индукции поведения, подобного ПТСР, такие как исследование памяти на страх^10,11, не разрешали ПТСР-подобные животные из контрольной группы, подвергшейся травме (устойчивые к ПТСР животные), рассматривая всех подвергшихся травме животных как похожих на ПТСР, и обычно использовали небольшое количество поведенческих показаний, таких как замирание, которые либо не являются специфическими симптомами ПТСР, либо являются симптомами других психопатологий, вызванных травмой, таких как тревога или депрессия . В то время как эти парадигмы эффективны в исследовании нейронных цепей памяти о страхе, отсутствие надежной и специфической оценки поведения, подобного ПТСР, может повлиять на трансляцию этих данных. Таким образом, текущее состояние этой области сосредоточено на парадигмах, использующих множественные поведенческие показания, специфичные для ПТСР, для идентификации как ПТСР, так и устойчивых животных¹².

Мы используем недавно разработанную парадигму для индукции ПТСР-подобного поведения у мышей, которая идентифицирует как ПТСР-подобных, так и устойчивых животных, используя серию из четырех поведенческих тестов для анализа пяти поведенческих показаний ПТСР^13,14. Поведение, подобное ПТСР, индуцируется с помощью деконтекстуализированного электрического удара ногой в течение двух сеансов. Животные сначала подвергаются серьезному сеансу травмы в первый день, а затем относительно легкому сеансу триггера на следующий день (Рисунок 1). Было показано, что эта комбинация значительно увеличивает вероятность возникновения ПТСР-подобного поведения. Эта парадигма использует модель острого стресса для индукции ПТСР, а не хронический стресс (который может вызвать более депрессивный фенотип¹⁵) или черепно-мозговую травму (которая может привести к отчетливому фенотипу¹⁴, подобному ПТСР). Аналогичным образом, поведенческие данные, используемые для идентификации поведения, подобного ПТСР в этой парадигме – снижение рискованного поведения, увеличение закапывания мрамора, снижение предимпульсного торможения, уменьшение латентности до пиковой амплитуды испуга и повышенная активность световой фазы (рис. 1) – специфичны для поведения, подобного ПТСР, а не для других психопатологий, вызванных травмой, таких как тревога или депрессия. Кроме того, использование множественных поведенческих показаний и необходимость для животных демонстрировать множественное поведение, подобное ПТСР, чтобы быть обозначенными как ПТСР, увеличивает вероятность того, что животные, обозначенные как ПТСР, действительно демонстрируют фенотип, подобный ПТСР. В совокупности эти особенности протокола гарантируют, что эта парадигма является надежным и надежным средством для индуцирования симптоматики, подобной ПТСР, у мышей.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все описанные здесь процедуры одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) клиники Майо.

1. Животные и жилье

1. Содержание 10-недельных самцов мышей C57BL/6J по 4 в клетке в стандартных условиях содержания (стандартная микроизоляторная клетка, комнатная температура 70 °F, пища и вода в неограниченном количестве, цикл свет/темнота 12 ч/12 ч).

2. Индукция ПТСР

1. Сеанс травматологии
   1. Подготовьте оборудование для подготовки страха и камеру.
      1. Запрограммируйте протокол травмы в программном обеспечении для обусловливания страха. Установите общее время на 5100 с (85 мин). Добавьте белый свет из Time 0 s - Time 5,100 s. Сложите четырнадцать токов по 1 с со случайным межпробным интервалом (ITI). Отрегулируйте ток на 1,0 мА.
      2. Протрите все внутренние поверхности каждой камеры кондиционирования от страха 1% раствором уксусной кислоты.
      3. Выключите свет в процедурном кабинете и включите лампу, оснащенную красной лампочкой, чтобы осветить комнату.
      4. Транспортируйте животных, подлежащих анализу, непосредственно в процедурный кабинет под непрозрачным покрытием.
      5. Дайте животным акклиматизироваться в процедурном кабинете в течение 30 минут в темноте с белым шумом 65 дБ(А).
      6. Поместите каждое животное в камеру для обусловливания страха, убедитесь, что камера заперта, и запустите протокол с помощью программного обеспечения для обусловливания страха.
      7. Когда протокол будет завершен, удалите животных из камер для утрендения страха и верните их в клетку. Если в тот же день необходимо провести обследование дополнительных клеток с животными, перевезите травмированных животных в послеоперационную палату, отдельную от домашней клетки, чтобы травмированные животные не могли передавать информацию животным, ранее не получавшим травму.
   2. Очистите внутреннюю часть камер кондиционирования страха с помощью 70% этанола. Если необходимо провести анализ большего количества животных, очистите внутреннюю часть камеры 1% уксусной кислотой и повторяйте протокол до тех пор, пока не будут проанализированы все животные.
   3. Триггерная сессия
      1. Запрограммируйте протокол запуска. Установите общее время на 300 с (5 мин). Сложите токи 1 с в разы 60 с, 120 с, 180 с, 240 с и 300 с. Отрегулируйте ток на 0,7 мА.
      2. Установите вставки из плексигласа с А-образной рамой в камеру кондиционирования от страха и протрите все внутренние поверхности 10% этанолом. Поместите генератор белого шума в каждую кабину с ослаблением звука и отрегулируйте выходной уровень звука до 70 дБ(А).
      3. Транспортировка обнаруженных животных в комнату для процедуры коррекции страха непрямым путем, который занимает больше времени, чем прямой маршрут для сеанса травмы.
      4. Дайте животным акклиматизироваться в комнате для снятия страха в течение 30 минут.
      5. Поместите каждое животное в камеру для обусловливания страха, включите генератор белого шума и начните протокол.
      6. Когда протокол будет завершен, удалите животных из камер для утрендения страха и верните их в клетку.
      7. Очистите внутреннюю часть камер кондиционирования страха с помощью 70% этанола. Если необходимо провести анализ дополнительных животных, очистите внутреннюю часть камеры 10% этанолом. Если не требуется никаких дополнительных животных, очистите внутреннюю часть камеры 70% этанолом.

3. Поведенческая оценка

1. Перенос темноты/света
   1. Расположите раздаточную коробку светлых/темных тонов под камерой, установленной на потолке. Увеличивайте масштаб камеры до тех пор, пока светлый/темный прямоугольник не заполнит поле зрения, и отрегулируйте фокус таким образом, чтобы изображение было четким. Поместите кусок непрозрачного пластика над дверным проемом, соединяющим светлую и темную арены.
      1. Определите световую арену и зону оценки риска (область размером 1 x 3 дюйма непосредственно за дверью в световой арене) в программном обеспечении для отслеживания движения.
      2. Отрегулируйте освещение на яркой арене до 1 000-1 100 люкс.
      3. Транспортируйте животных в процедурный кабинет и дайте им акклиматизироваться в течение 30 минут.
      4. Поместите каждого зверька в темную арену и закройте крышкой. Уберите дверной проем, разделяющий светлую и темную камеры, и запишите движение животного в течение 5 минут.
      5. Извлеките животное из аппарата и очистите все поверхности 70% этанолом.
      6. Рассчитайте % оценки риска для каждого животного, разделив время, проведенное в зоне оценки риска, на общее время, проведенное в Light Arena.
      7. Верните всех животных в домашние клетки. Тщательно очистите светлую/темную коробку 70% этанолом.
2. Испытание на закапывание мрамора
   1. Проведите тест на захоронение мрамора в стандартной микроизоляторной клетке для крыс или аналогичном вольере. Заполните каждую клетку свежей подстилкой по 5 см. Расставьте кейджи на скамейке процедурного кабинета и отрегулируйте освещение на <10 люкс.
   2. Разложите 20 чистых шариков из черного стекла в равномерно расположенной сетке 5 x 4 на дне каждой клетки.
   3. Перенесите животных в комнату для захоронения мрамора, чтобы животные могли акклиматизироваться в течение 30 минут.
   4. Поместите каждое животное в мраморную арену на 25 минут. Через 25 минут уберите каждую мышь с арены и верните ее в клетку.
   5. Рассчитайте процент захороненных шариков, разделив количество захороненных шариков на 20.
3. Акустическая реакция на испуг
   1. Определите испытания испуга, отсутствия стимула и предимпульсного испуга в программном обеспечении для реагирования на испуг.
      1. Определите стимул испуга 120 дБ(А) для излучения тона 120 дБ(А) в течение 40 мс при измерении амплитуды испуга.
      2. Определите предимпульсные стимулы 75 дБ(А), 80 дБ(А) и 85 дБ(А) для излучения тона 75 дБ(А), 80 дБ(А) или 85 дБ(А) соответственно, а затем тона 120 дБ(А) за 40 мс при измерении амплитуды испуга.
      3. Определите стимул без испуга для излучения тона 65 дБ(А) (фон) в течение 40 мс при измерении амплитуды испуга.
   2. Определите сеанс акустической реакции на испуг.
      1. Установите фон на аналоговый уровень, коррелируя с 65 дБ(А).
      2. Добавьте семь испытаний на испуг 120 дБ(А) в начале сеанса, за которыми последуют еще десять испытаний с испугом 120 дА(А), случайным образом перемежающихся с двенадцатью испытаниями без стимулов, двенадцатью испытаниями с давлением 75 дБ(А), двенадцатью испытаниями с давлением 80 дБ(А) и двенадцатью испытаниями с давлением 85 дБ(А), а затем с семью последними испытаниями 120 дБ(А).
   3. Перенесите животных в помещение, примыкающее к комнате для процедуры акустической реакции на испуг, и дайте животным акклиматизироваться в течение 30 минут.
   4. После 30-минутной акклиматизации перенесите животных для оценки в процедурный кабинет в темноте.
   5. Поместите каждое животное в удерживающее устройство в акустическом блоке для отпугивания, установите на место вставки, чтобы удержать каждое животное, и закройте дверцу шумопоглощающего бокса. Убедитесь, что вставки расположены таким образом, чтобы животное находилось по центру датчика вибрации, но при этом могло свободно поворачиваться.
   6. Запустите протокол с помощью программного обеспечения для реагирования на испуг.
   7. Когда протокол будет завершен, удалите всех животных из акустического аппарата для испуга в клетку для переноса.
   8. Очистите удерживающее устройство для животных, тщательно протерев внутренние поверхности 70% этанолом.
   9. Рассчитайте задержку до амплитуды пикового испуга, усреднив время до значений максимальной скорости для всех 120 дБ(А) стимулов испуга для каждого животного.
   10. Рассчитайте % предимпульсного торможения. Рассчитайте среднее значение Vmax для стимулов испуга 120 дБ(А) без испуга, 75 дБ(А) стимулов испуга, 80 дБ(А) стимулов испуга и 85 дБ(А) стимулов испуга. Рассчитайте чистую среднюю амплитуду испуга путем вычитания среднего Vmax для отсутствующих стимулов испуга из среднего значения Vmax для 120 дБ(А). Рассчитайте % предимпульсного торможения для предимпульсных испугов 75 дБ(А), 80 дБ(А) и 85 дБ(А), разделив каждое среднее предимпульсное Vmax на среднее значение Vmax 120 дБ(А), вычтите это отношение из 1 и умножив на 100. Рассчитайте среднее % предимпульсного торможения путем усреднения 75 дБ(А), 80 дБ(А) и 85 дБ(А) % предимпульсного торможения.
4. Активность в домашней клетке
   1. Выполняйте работу в домашних клетках в микроизоляторах с модифицированными крышками, оснащенными пассивными инфракрасными датчиками, которые обнаруживают движение животного. Замените стандартные бутылки для воды на конические трубки объемом 50 мл с пробкой, чтобы уменьшить площадь дна клетки, закрытую от обзора датчика движения. Поместите ограниченное количество пищи (50-75 г) во вставку проволочной клетки, чтобы уменьшить препятствие для датчика движения.
   2. Транспортируйте животных в комнату для занятий в домашней клетке после теста на акустическую реакцию на испуг.
   3. Поместите каждое животное в модифицированную клетку с микроизолятором и убедитесь, что ИК-датчик считывает движение. Установите на место верхнюю часть и крышку проволочной клетки.
   4. Ежедневно проверяйте животных в ходе анализа, чтобы убедиться, что каждое животное имеет достаточный доступ как к пище, так и к воде.
   5. Размещайте животных в домашних клетках для занятий в течение 3 циклов света/темноты (72 часа).
   6. По истечении 72-часового периода остановите запись и заберите всех животных из домашних клеток.
   7. Рассчитайте % активности световой фазы, разделив общее количество сеансов активности во время второй и третьей световых фаз на общее количество сеансов активности за последние 48 часов мониторинга.
5. Оценка и инклюзия
   1. Рассчитайте значение Z для % оценки риска, % зарытых шариков, среднего % предимпульсного торможения, латентности до пиковой амплитуды испуга и % считывания активности световой фазы для каждого животного, вычтя среднее значение для этого поведенческого теста в этой когорте, а затем разделив на стандартное отклонение этого поведенческого теста в этой когорте.
   2. Присуждайте баллы 20% наиболее похожих на ПТСР животных за каждое поведенческое считывание. Первые 20% животных, демонстрирующих наименьший % оценки риска, наибольший % зарытых шариков, самый низкий средний % предимпульсного торможения, наименьшую латентность до пиковой амплитуды испуга и самый высокий % активности световой фазы, получают 3, 1, 2, 3 и 1 балл соответственно (Таблица 1).
   3. Сложите все баллы, полученные каждым животным в поведенческих тестах. Обозначьте животных, получающих 5 баллов или более, как похожих на ПТСР, а животных, получивших 0 баллов, как устойчивых.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Мы ожидаем, что животные будут демонстрировать поведение, подобное ПТСР, в каждом поведенческом тесте, равномерно распределенном по всем когортам. Концентрация животных, похожих на ПТСР, в любой когорте может указывать на артефакты, введенные либо во время индукции П?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

ПТСР является сложным и гетерогенным психическим заболеванием. К сожалению, в настоящее время не существует надежной животной модели для ПТСР-подобного поведения, а поведенческие парадигмы для индукции ПТСР-подобного поведения являются наиболее надежными средства?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid, glacial	Sigma Aldrich	AX0073
Benchtop Balance	Fisher Scientific	01-913-925
Clocklab Data Collection Suite	Actimetrics	-	Home cage activity cages
Deciblemeter
Ethovision XT14 Software	Noldus	-	Movement tracking software
Ethyl alcohol	Sigma Aldrich	443611
Light/Dark Box	Noldus	-	Light/dark transfer box
Lux Meter
Monochrome GigE Camera	Noldus	-	Requires Ceiling Mounting Hardware Available from Noldus
NIR Video Fear Conditioning Package for Mouse [Standard, USB]	Med Associates	MED-VFC2-USB-M	Fear conditioning equipment and chamber. Package includes all equipment needed to assay 1 animal at a time.
Spray Bottle	Thermo Scientific	BirA500
SR LAB Software	San Diego Instruments	-	Startle response software
SR LAB Startle Response Unit	San Diego Instruments	-	Acoustic startle unit
Video Fear Coniditioning "Video Freeze " Software	Med Associates	SOF-843	Fear conditioning software
White noise machine	Med Associates	ENV-230