Um protocolo para a indução de comportamento semelhante ao transtorno de estresse pós-traumático (TEPT) em camundongos

Resumo

Neste estudo, o comportamento semelhante ao transtorno de estresse pós-traumático (TEPT) é induzido em camundongos usando duas sessões de choque elétrico inevitável nos pés. Animais semelhantes ao TEPT e resilientes são identificados usando vários ensaios para comportamentos específicos de TEPT.

Resumo

O transtorno de estresse pós-traumático (TEPT) é uma condição psiquiátrica debilitante que se precipita em ~ 10% dos indivíduos expostos a um evento traumático (TE). Os sintomas incluem pensamentos recorrentes e intrusivos, distúrbios do sono, hipervigilância, sobressalto exagerado e comportamento imprudente ou destrutivo. Dada a natureza complexa e heterogênea da doença, modelos animais para sintomatologia semelhante ao TEPT são de interesse crescente para o campo da pesquisa de TEPT. Como a resiliência à sintomatologia semelhante ao TEPT é um aspecto epidemiológico importante do TEPT, os modelos animais que resolvem animais vulneráveis e resilientes são de particular valor. Devido à natureza complexa do fenótipo de TEPT e às possíveis sobreposições entre o comportamento semelhante ao TEPT e os comportamentos associados a outras psicopatologias induzidas pelo estresse, como ansiedade ou depressão, os modelos animais que utilizam várias leituras para o comportamento semelhante ao TEPT também são de valor crescente. Utilizamos um paradigma desenvolvido por Lebow et al. 2012 para a indução e identificação de sintomatologia semelhante ao TEPT em camundongos. Este paradigma utiliza choque elétrico inevitável nos pés, administrado em duas sessões descontextualizadas ao longo de dois dias consecutivos. Camundongos estressados realizam quatro testes comportamentais - transferência de escuridão / luz, enterro de bolinhas, sobressalto acústico e atividade de gaiola doméstica - para gerar cinco leituras comportamentais de comportamento semelhante ao TEPT: % de avaliação de risco (% RA), % de bolinhas enterradas (% MB), % de inibição de pré-pulso (% PPI), latência para amplitude de pico de sobressalto (LPSA) e % de atividade da fase de luz (% LPA). A sintomatologia semelhante ao TEPT é caracterizada por diminuição do %RA, aumento do %MB, diminuição do %PPI, diminuição do LPSA e aumento do %LPA. Os 20% dos animais que exibem o comportamento mais semelhante ao TEPT em cada teste recebem um certo número de pontos, dependendo do teste, e os animais que marcam pontos suficientes são designados como semelhantes ao TEPT, enquanto os animais que não marcam pontos são designados como resistentes ao TEPT. Este paradigma identifica o comportamento semelhante ao TEPT em ~ 15% dos animais, uma taxa comparável à observada em humanos. Este protocolo representa um paradigma robusto e reprodutível para a indução de comportamento semelhante ao TEPT em camundongos.

Introdução

O transtorno de estresse pós-traumático (TEPT) é uma psicopatologia debilitante que pode precipitar em indivíduos que foram expostos a um evento traumático (TE)¹. De acordo com o DSM-V, a exposição ao TE pode assumir muitas formas, incluindo exposição indireta direta ou repetida a uma ameaça real ou percebida de morte, lesão corporal ou violência sexual a si mesmo ou a outra^{pessoa 2}. A sintomatologia do TEPT é caracterizada por pensamentos e lembranças negativas intrusivas, hiperexcitação, hipervigilância, aumento do comportamento de risco e ciclos de sono interrompidos³. A prevalência de exposição ao TE ao longo da vida em todo o mundo é relativamente alta, aproximadamente 64%-70%³, embora a prevalência ao longo da vida de TEPT permaneça comparativamente baixa, em ~1,3%-12%⁴. Essa disparidade na prevalência de exposição ao TE em relação à precipitação de TEPT sugere uma forte interação gene x ambiente na vulnerabilidade ao TEPT. Dada a atual ausência de um modelo confiável de vertebrados de comportamento semelhante ao TEPT, o campo se baseia em paradigmas comportamentais para a indução de sintomatologia semelhante ao TEPT⁵.

O TEPT é um transtorno psiquiátrico complexo e altamente heterogêneo, e o desenvolvimento de um modelo animal robusto e confiável para sintomatologia semelhante ao TEPT tem sido um desafio. Leituras comumente usadas para comportamento semelhante ao TEPT, como congelamento, também são sintomáticas de outras psicopatologias induzidas por trauma, a saber, ansiedade e depressão⁶. Isso é ainda mais complicado pela alta comorbidade entre TEPT e depressão². Investigações recentes mostraram que ratos que testemunharam eventos traumáticos apresentam comportamentos aumentados de ansiedade e depressão ^7,8,9, demonstrando ainda mais a importância de avaliar comportamentos específicos de TEPT ao utilizar modelos comportamentais de TEPT em roedores. Além disso, a resiliência à sintomatologia semelhante ao TEPT após a exposição a eventos traumáticos é uma característica epidemiológica significativa do TEPT, pois a incidência de exposição a eventos traumáticos ao longo da vida em todo o mundo supera em muito a prevalência de TEPT ao longo da vida. Historicamente, os modelos comportamentais para indução de comportamento semelhante ao TEPT, como aqueles que investigam a memória do medo^10,11, não resolveram animais semelhantes ao TEPT de controles expostos ao trauma (animais resilientes ao TEPT), tratando todos os animais expostos ao trauma como semelhantes ao TEPT e comumente usavam poucas leituras de comportamento, como congelamento, que não são especificamente sintomáticas de TEPT ou são sintomáticas de outras psicopatologias induzidas por trauma, como ansiedade ou depressão¹². Embora esses paradigmas sejam eficazes na investigação de circuitos neurais da memória do medo, a falta de uma avaliação robusta e específica do comportamento semelhante ao TEPT pode afetar a tradução desses dados. O estado atual do campo, portanto, concentra-se em paradigmas que utilizam múltiplas leituras comportamentais específicas de TEPT para identificar animais semelhantes a TEPT e resilientes¹².

Utilizamos um paradigma recentemente desenvolvido para a indução de comportamento semelhante ao TEPT em camundongos, que identifica animais semelhantes ao TEPT e resilientes usando uma série de quatro testes comportamentais para testar cinco leituras comportamentais semelhantes ao TEPT^13,14. O comportamento semelhante ao TEPT é induzido usando choque elétrico descontextualizado nos pés em duas sessões. Os animais são expostos pela primeira vez a uma sessão de trauma grave no primeiro dia, seguida por uma sessão de gatilho relativamente leve no dia seguinte (Figura 1). Foi demonstrado que essa combinação aumenta significativamente a precipitação do comportamento semelhante ao TEPT. Este paradigma utiliza um modelo de estresse agudo para indução de TEPT em vez de estresse crônico (que pode induzir um fenótipo mais depressivo¹⁵) ou lesão cerebral traumática (que pode resultar em um fenótipo distinto semelhante ao TEPT¹⁴). Da mesma forma, as leituras comportamentais utilizadas para identificar o comportamento semelhante ao TEPT neste paradigma - comportamento de risco reduzido, aumento do enterro de bolinhas de gude, inibição pré-pulso reduzida, latência reduzida para amplitude de sobressalto de pico e aumento da atividade da fase de luz (Figura 1) - são específicos para o comportamento semelhante ao TEPT, e não para outras psicopatologias induzidas por trauma, como ansiedade ou depressão. Além disso, o uso de múltiplas leituras comportamentais e a necessidade de os animais exibirem vários comportamentos semelhantes ao TEPT para serem designados como TEPT aumentam a probabilidade de que os animais designados como TEPT estejam realmente exibindo um fenótipo semelhante ao TEPT. Juntos, esses recursos do protocolo garantem que esse paradigma seja um meio robusto e confiável para induzir sintomatologia semelhante ao TEPT em camundongos.

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Protocolo

Todos os procedimentos descritos aqui são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Mayo Clinic (IACUC).

1. Animais e alojamento

1. Alojar camundongos C57BL / 6J machos de 10 semanas de idade 4 para uma gaiola em condições de alojamento padrão (gaiola de microisolador padrão, temperatura ambiente (RT) de 70 ° F, comida e água ad libitum, ciclo de 12 h / 12 h de luz / escuridão).

2. Indução de TEPT

1. Sessão de trauma
   1. Prepare o equipamento e a câmara de condicionamento do medo.
      1. Programe o protocolo de trauma no software de condicionamento do medo. Defina um tempo total para 5100 s (85 min). Adicione luz branca do Tempo 0 s - Tempo 5.100 s. Adicione quatorze correntes de 1 s em um intervalo aleatório entre tentativas (ITI). Ajuste a corrente para 1.0 mA.
      2. Limpe todas as superfícies internas de cada câmara de condicionamento do medo com solução de ácido acético a 1%.
      3. Apague a luz da sala de procedimentos e acenda uma lâmpada equipada com uma lâmpada vermelha para iluminar a sala.
      4. Transportar os animais a analisar directamente para a sala de procedimentos sob uma cobertura opaca.
      5. Permitir que os animais se aclimatem à sala de procedimentos durante 30 minutos no escuro com ruído branco de 65 db(A).
      6. Coloque cada animal em uma câmara de condicionamento do medo, certifique-se de que a câmara esteja travada e inicie o protocolo usando o software de condicionamento do medo.
      7. Quando o protocolo terminar, remova os animais das câmaras de condicionamento do medo e devolva-os à gaiola. Se gaiolas adicionais de animais forem testadas no mesmo dia, transporte os animais expostos ao trauma para uma sala de recuperação separada da sala da gaiola de casa para evitar que os animais traumatizados comuniquem informações aos animais virgens de trauma.
   2. Limpe o interior das câmaras de condicionamento do medo com etanol 70%. Se for necessário dosear outros animais, limpar o interior da câmara com ácido acético a 1% e repetir o protocolo até que todos os animais tenham sido analisados.
   3. Sessão de gatilho
      1. Programe o protocolo de disparo. Defina o tempo total para 300 s (5 min). Adicione correntes de 1 s nos momentos 60 s, 120 s, 180 s, 240 s e 300 s. Ajuste a corrente para 0.7 mA.
      2. Instale inserções de plexiglass em A na câmara de condicionamento do medo e limpe todas as superfícies internas com etanol a 10%. Coloque uma máquina de ruído branco em cada cubículo de atenuação de som e ajuste a saída de som para 70 dB(A).
      3. Transporte os animais descobertos para a sala de procedimentos de condicionamento do medo por uma via indireta, que leva mais tempo do que a rota direta percorrida para a sessão de trauma.
      4. Permita que os animais se aclimatem à sala de condicionamento do medo por 30 min.
      5. Coloque cada animal em uma câmara de condicionamento do medo, ligue a máquina de ruído branco e inicie o protocolo.
      6. Quando o protocolo terminar, remova os animais das câmaras de condicionamento do medo e devolva-os à gaiola.
      7. Limpe o interior das câmaras de condicionamento do medo com etanol 70%. Se for necessário analisar outros animais, limpar o interior da câmara com etanol a 10%. Se não for necessário analisar outros animais, limpar o interior da câmara com etanol a 70%.

3. Avaliação comportamental

1. Transferência de escuridão/luz
   1. Disponha a caixa de transferência clara/escura sob a câmera montada no teto. Aumente o zoom da câmera até que a caixa clara/escura preencha o campo de visão e ajuste o foco de forma que a imagem fique nítida. Coloque um pedaço de plástico opaco sobre a porta que conecta as arenas claras e escuras.
      1. Defina a arena de luz e a área de avaliação de risco (uma área de 1 polegada x 3 polegadas diretamente do lado de fora da porta na arena de luz) no software de rastreamento de movimento.
      2. Ajuste a iluminação na arena brilhante para 1.000-1.100 lux.
      3. Transporte os animais para a sala de procedimentos e deixe os animais se aclimatarem por 30 min.
      4. Coloque cada animal na arena escura e recoloque a tampa. Remova a porta que separa as câmaras claras e escuras e registre o movimento do animal por 5 min.
      5. Retire o animal do aparelho e limpe todas as superfícies com etanol 70%.
      6. Calcule a avaliação de risco percentual para cada animal dividindo o tempo gasto na Área de Avaliação de Risco pelo tempo total gasto na Light Arena.
      7. Devolva todos os animais às gaiolas de origem. Limpe bem a caixa clara/escura com etanol a 70%.
2. Teste de enterramento de mármore
   1. Efectuar o ensaio de enterramento de mármore numa gaiola microisolator normalizada para ratos ou num recinto semelhante. Encha cada gaiola com cama fresca de 5 cm. Disponha as gaiolas na bancada da sala de procedimentos e ajuste as luzes para <10 lux.
   2. Disponha 20 bolinhas de vidro preto limpas em uma grade de 5 x 4 uniformemente espaçada na parte inferior de cada gaiola.
   3. Transfira os animais para a sala de procedimentos de enterro de mármore para permitir que os animais se aclimatem por 30 min.
   4. Coloque cada animal em uma arena de enterro de bolinhas de gude por 25 min. Após 25 minutos, remova cada rato de sua arena e devolva-o à sua gaiola.
   5. Calcule a % de bolinhas enterradas dividindo o número de bolinhas enterradas por 20.
3. Resposta de sobressalto acústico
   1. Defina os testes de sobressalto, sem estímulo e sobressalto de pré-pulso no software de resposta de sobressalto.
      1. Defina o estímulo de sobressalto de 120 dB(A) para emitir um tom de 40 ms de 120 dB(A) enquanto mede a amplitude de sobressalto.
      2. Defina os estímulos de pré-pulso de 75 dB(A), 80 dB(A) e 85 dB(A) para emitir um tom de 40 ms de 75 dB(A), 80 dB(A) ou 85 dB(A), respectivamente, seguido por um tom de 40 ms de 120 dB(A) enquanto mede a amplitude do sobressalto.
      3. Defina o estímulo sem sobressalto para emitir um tom de 40 ms de 65 dB(A) (fundo) enquanto mede a amplitude do sobressalto.
   2. Defina a sessão de resposta acústica de sobressalto.
      1. Defina o plano de fundo para o nível analógico correlacionado a 65 db(A).
      2. Adicione sete tentativas de sobressalto de 120 db(A) no início da sessão, seguidas por dez tentativas de sobressalto adicionais de 120 db(A) intercaladas aleatoriamente com doze tentativas sem estímulo, doze tentativas de pré-pulso de 75 db(A), doze tentativas de pré-pulso de 80 db(A) e doze tentativas de pré-pulso de 85 db(A), seguidas por sete estímulos finais de 120 db(A) de sobressalto.
   3. Transfira os animais para uma sala adjacente à sala de procedimentos de resposta acústica de sobressalto e deixe-os aclimatar por 30 minutos.
   4. Após a aclimatação de 30 minutos, transfira os animais a serem avaliados para a sala de procedimentos no escuro.
   5. Coloque cada animal no limitador na unidade de sobressalto acústico, substitua as inserções para conter cada animal e feche a porta do cubículo de atenuação de som. Certifique-se de que as inserções estejam posicionadas de forma que o animal fique centralizado sobre o sensor de vibração, mas ainda possa se virar livremente.
   6. Inicie o protocolo usando o software de resposta de sobressalto.
   7. Quando o protocolo terminar, remova todos os animais do aparelho acústico de sobressalto para a gaiola de transferência.
   8. Limpe o contenção de animais limpando completamente as superfícies internas com etanol a 70%.
   9. Calcule a latência para atingir o pico de sobressalto da amplitude calculando a média do tempo até os valores de velocidade máxima para todos os estímulos de sobressalto de 120 dB(A) para cada animal.
   10. Calcule a % de inibição de pré-pulso. Calcule o valor médio de Vmax para estímulos de sobressalto de 120 dB(A), sem sobressalto, estímulos de sobressalto de 75 dB(A), estímulos de sobressalto de 80 db(A) e estímulos de sobressalto de 85 dB(A). Calcule a amplitude de sobressalto média líquida subtraindo a Vmax média para nenhum estímulo de sobressalto da Vmax média para 120 dB(A). Calcule a % de inibição de pré-pulso para os sobressaltos de pré-pulso de 75 db(A), 80 dB(A) e 85 dB(A) dividindo cada pré-pulso médio Vmax pela média de 120 dB(A) Vmax, subtraindo essa proporção de 1 e multiplicando por 100. Calcule a % média de inibição pré-pulso calculando a média das inibições pré-pulso de 75 dB(A), 80 dB(A) e 85 db(A) %.
4. Atividade em gaiola doméstica
   1. Realizar a atividade de gaiola doméstica em gaiolas microisoladas com tampas modificadas equipadas com sensores infravermelhos passivos que detectam o movimento do animal. Substitua as garrafas de água padrão por tubos cônicos de 50 mL equipados com um bebedor de rolha para reduzir a área do fundo da gaiola obstruída do view do sensor de movimento. Coloque uma quantidade limitada de comida (50-75 g) na inserção da gaiola de arame para reduzir a obstrução do sensor de movimento.
   2. Transporte os animais para a sala de atividades da gaiola doméstica após o teste de resposta acústica ao sobressalto.
   3. Coloque cada animal em uma gaiola de microisolador modificada e certifique-se de que o sensor IR esteja lendo o movimento. Recoloque a parte superior e a tampa da gaiola de arame.
   4. Verifique os animais diariamente ao longo do ensaio para garantir que cada animal tenha acesso suficiente a comida e água.
   5. Alojar os animais nas gaiolas de atividade da gaiola doméstica por 3 ciclos claro/escuro (72 h).
   6. Após o período de 72 horas, pare a gravação e remova todos os animais de suas gaiolas domésticas.
   7. Calcule a % de atividade da fase de luz dividindo o número total de episódios de atividade durante a segunda e terceira fases de luz pelo número total de períodos de atividade das últimas 48 h de monitoramento.
5. Pontuação e inclusão
   1. Calcule o valor Z para % de avaliação de risco, % de bolinhas enterradas, % média de inibição de pré-pulso, latência para amplitude de pico de sobressalto e % de leitura de atividade de fase de luz para cada animal, subtraindo o valor médio para esse teste comportamental nessa coorte e, em seguida, dividindo pelo desvio padrão desse teste comportamental nessa coorte.
   2. Atribua pontos aos 20% dos animais mais parecidos com TEPT para cada leitura comportamental. Os 20% melhores animais que exibem a menor avaliação de risco, maior porcentagem de bolinhas enterradas, menor % média de inibição de pré-pulso, menor latência para amplitude de sobressalto de pico e maior % de atividade de fase de luz, recebem 3, 1, 2, 3 e 1 pontos, respectivamente (Tabela 1).
   3. Some todos os pontos recebidos por cada animal nos testes comportamentais. Designe os animais que recebem 5 pontos ou mais como semelhantes ao TEPT e designe os animais que recebem 0 pontos como resilientes.

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Resultados

Esperamos ver animais exibindo comportamento semelhante ao TEPT em cada teste comportamental distribuído uniformemente em todas as coortes. Uma concentração de animais semelhantes ao TEPT em qualquer coorte pode indicar artefatos introduzidos durante a indução de TEPT ou teste comportamental. Os animais que pontuam em cada leitura comportamental são distribuídos igualmente em todas as coortes testadas (Figura 2). 7 dos 48 animais (14,6%) expostos ao p...

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Discussão

O TEPT é uma doença psiquiátrica complexa e heterogênea. Infelizmente, atualmente não existe um modelo animal confiável para o comportamento semelhante ao TEPT, e os paradigmas comportamentais para a indução de comportamento semelhante ao TEPT são os meios mais confiáveis de gerar animais exibindo um fenótipo comportamental semelhante ao TEPT. O paradigma descrito aqui fornece um meio robusto e confiável de precipitar um fenótipo comportamental semelhante ao TEPT devido ao u...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid, glacial	Sigma Aldrich	AX0073
Benchtop Balance	Fisher Scientific	01-913-925
Clocklab Data Collection Suite	Actimetrics	-	Home cage activity cages
Deciblemeter
Ethovision XT14 Software	Noldus	-	Movement tracking software
Ethyl alcohol	Sigma Aldrich	443611
Light/Dark Box	Noldus	-	Light/dark transfer box
Lux Meter
Monochrome GigE Camera	Noldus	-	Requires Ceiling Mounting Hardware Available from Noldus
NIR Video Fear Conditioning Package for Mouse [Standard, USB]	Med Associates	MED-VFC2-USB-M	Fear conditioning equipment and chamber. Package includes all equipment needed to assay 1 animal at a time.
Spray Bottle	Thermo Scientific	BirA500
SR LAB Software	San Diego Instruments	-	Startle response software
SR LAB Startle Response Unit	San Diego Instruments	-	Acoustic startle unit
Video Fear Coniditioning "Video Freeze " Software	Med Associates	SOF-843	Fear conditioning software
White noise machine	Med Associates	ENV-230