Un protocollo per l'induzione di un comportamento simile al disturbo da stress post-traumatico (PTSD) nei topi

Riepilogo

In questo studio, il comportamento simile al disturbo da stress post-traumatico (PTSD) è indotto nei topi utilizzando due sessioni di inevitabile scossa elettrica del piede. Gli animali simili al PTSD e resilienti sono identificati utilizzando diversi test per i comportamenti specifici del PTSD.

Abstract

Il disturbo da stress post-traumatico (PTSD) è una condizione psichiatrica debilitante che precipita in ~10% degli individui esposti a un evento traumatico (TE). I sintomi includono pensieri ricorrenti e intrusivi, disturbi del sonno, ipervigilanza, spavento esagerato e comportamento sconsiderato o distruttivo. Data la natura complessa ed eterogenea della malattia, i modelli animali per la sintomatologia simile al PTSD sono di crescente interesse nel campo della ricerca sul PTSD. Poiché la resilienza alla sintomatologia simile al PTSD è un importante aspetto epidemiologico del PTSD, i modelli animali che risolvono gli animali vulnerabili e resilienti sono di particolare valore. A causa della natura complessa del fenotipo PTSD e delle potenziali sovrapposizioni tra comportamenti simili al PTSD e comportamenti associati ad altre psicopatologie indotte da stress come l'ansia o la depressione, anche i modelli animali che utilizzano letture multiple per il comportamento simile al PTSD sono di valore crescente. Utilizziamo un paradigma sviluppato da Lebow et al. 2012 per l'induzione e l'identificazione di una sintomatologia simile al PTSD nei topi. Questo paradigma utilizza l'inevitabile elettroshock del piede, somministrato in due sessioni decontestualizzate nell'arco di due giorni consecutivi. I topi stressati eseguono quattro test comportamentali - trasferimento buio/luce, interramento delle biglie, sussulto acustico e attività domestica della gabbia - per generare cinque letture comportamentali del comportamento simile al PTSD: % valutazione del rischio (%RA), % biglie sepolte (%MB), % inibizione del preimpulso (%PPI), latenza rispetto all'ampiezza di spavento di picco (LPSA) e % attività della fase luminosa (%LPA). La sintomatologia simile al PTSD è caratterizzata da una diminuzione della %RA, un aumento della %MB, una diminuzione della %PPI, una diminuzione della LPSA e un aumento della %LPA. Al 20% degli animali che mostrano il comportamento più simile al PTSD in ogni test viene assegnato un certo numero di punti a seconda del test, e gli animali che ottengono punti sufficienti sono designati come PTSD-like, mentre gli animali che non ottengono punti sono designati come PTSD-resilienti. Questo paradigma identifica un comportamento simile al PTSD in ~ 15% degli animali, un tasso paragonabile a quello osservato negli esseri umani. Questo protocollo rappresenta un paradigma robusto e riproducibile per l'induzione di un comportamento simile al PTSD nei topi.

Introduzione

Il disturbo post-traumatico da stress (PTSD) è una psicopatologia debilitante che può precipitare in individui che sono stati esposti a un evento traumatico (TE)¹. Secondo il DSM-V, L'esposizione all'TE può assumere molte forme, tra cui l'esposizione diretta o indiretta ripetuta a una minaccia reale o percepita di morte, danni fisici o violenza sessuale a se stessi o ad altri². La sintomatologia del PTSD è caratterizzata da pensieri e ricordi negativi intrusivi, ipereccitazione, ipervigilanza, aumento del comportamento a rischio e cicli di sonno interrotti³. La prevalenza una tantum dell'esposizione a TE in tutto il mondo è relativamente alta, pari a circa il 64%-70%³, sebbene la prevalenza una tantum di PTSD rimanga relativamente bassa, a ~1,3%-12%⁴. Questa disparità nella prevalenza dell'esposizione al TE rispetto alla precipitazione del PTSD suggerisce una forte interazione gene x ambiente nella vulnerabilità al PTSD. Data l'attuale assenza di un modello affidabile di comportamento simile al PTSD nei vertebrati, il campo si basa su paradigmi comportamentali per l'induzione della sintomatologia PTSD-like⁵.

Il PTSD è un disturbo psichiatrico complesso e altamente eterogeneo e lo sviluppo di un modello animale robusto e affidabile per la sintomatologia simile al PTSD è stato impegnativo. Le letture comunemente usate per comportamenti simili al PTSD, come il congelamento, sono anche sintomatiche di altre psicopatologie indotte da traumi, vale a dire ansia e depressione⁶. Ciò è ulteriormente complicato dall'elevata comorbilità tra PTSD e depressione². Recenti indagini hanno dimostrato che i ratti che hanno assistito a eventi traumatici mostrano un aumento dei comportamenti di ansia e depressione ^7,8,9, dimostrando ulteriormente l'importanza di valutare i comportamenti specifici del PTSD quando si utilizzano modelli comportamentali di PTSD nei roditori. Inoltre, la resilienza alla sintomatologia simile al PTSD a seguito dell'esposizione a eventi traumatici è una caratteristica epidemiologica significativa del PTSD, poiché l'incidenza nel corso della vita dell'esposizione a eventi traumatici in tutto il mondo supera di gran lunga la prevalenza nel corso della vita del PTSD. Storicamente, i modelli comportamentali per l'induzione di comportamenti simili al PTSD, come quelli che indagano la memoria della paura^10,11, non hanno risolto gli animali simili al PTSD dai controlli esposti al trauma (animali resistenti al PTSD), trattando tutti gli animali esposti al trauma come simili al PTSD e comunemente usati poche letture comportamentali, come il congelamento, che non sono specificamente sintomatiche di PTSD o sono sintomatiche di altre psicopatologie indotte da traumi come ansia o depressione¹². Sebbene questi paradigmi siano efficaci nello studio dei circuiti neurali della memoria della paura, la mancanza di una valutazione solida e specifica del comportamento simile al PTSD può influire sulla traduzione di questi dati. Lo stato attuale del campo, quindi, si concentra su paradigmi che utilizzano più letture comportamentali specifiche per il PTSD per identificare sia gli animali simili al PTSD che quelli resilienti¹².

Utilizziamo un paradigma recentemente sviluppato per l'induzione di comportamenti simili al PTSD nei topi che identifica sia gli animali simili al PTSD che quelli resilienti utilizzando una serie di quattro test comportamentali per testare cinque letture comportamentali simili al PTSD^13,14. Il comportamento simile al PTSD viene indotto utilizzando una scossa elettrica del piede decontestualizzata in due sessioni. Gli animali vengono prima esposti a una sessione di trauma grave il primo giorno, seguita da una sessione di trigger relativamente lieve il giorno successivo (Figura 1). È stato dimostrato che questa combinazione aumenta significativamente la precipitazione del comportamento simile al PTSD. Questo paradigma utilizza un modello di stress acuto per l'induzione del PTSD piuttosto che lo stress cronico (che può indurre un fenotipo¹⁵ più depressivo) o la lesione cerebrale traumatica (che può portare a un distinto fenotipo¹⁴ simile al PTSD). Allo stesso modo, le letture comportamentali utilizzate per identificare il comportamento simile al PTSD in questo paradigma - riduzione del comportamento a rischio, aumento dell'interramento del marmo, ridotta inibizione del preimpulso, ridotta latenza al picco di ampiezza dello spavento e aumento dell'attività della fase luminosa (Figura 1) - sono specifiche per il comportamento simile al PTSD, piuttosto che per altre psicopatologie indotte da traumi come l'ansia o la depressione. Inoltre, l'uso di più letture comportamentali e la necessità per gli animali di mostrare più comportamenti simili al PTSD per essere designati come PTSD, aumenta la probabilità che gli animali designati come PTSD mostrino veramente un fenotipo simile al PTSD. Insieme, queste caratteristiche del protocollo assicurano che questo paradigma sia un mezzo robusto e affidabile per indurre una sintomatologia simile al PTSD nei topi.

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Protocollo

Tutte le procedure qui descritte sono approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali della Mayo Clinic (IACUC).

1. Animali e stabulazione

1. Ospita topi maschi C57BL/6J di 10 settimane in gabbia 4-to-a-cg in condizioni di stabulazione standard (gabbia per microisolatore standard, temperatura ambiente (RT) di 70 °F, cibo e acqua ad libitum, ciclo luce/buio di 12 ore/12 ore).

2. Induzione del disturbo da stress post-traumatico

1. Sessione traumatologica
   1. Prepara l'attrezzatura e la camera per il condizionamento della paura.
      1. Programma il protocollo del trauma nel software di condizionamento della paura. Impostare un tempo totale su 5100 s (85 min). Aggiungi luce bianca da Tempo 0 s - Tempo 5.100 s. Aggiungere quattordici correnti di 1 s a un intervallo casuale tra le prove (ITI). Regolare la corrente a 1,0 mA.
      2. Pulire tutte le superfici interne di ciascuna camera di condizionamento della paura con una soluzione di acido acetico all'1%.
      3. Spegnere la luce della sala operatoria e accendere una lampada dotata di lampadina a luce rossa per illuminare la stanza.
      4. Trasporta gli animali da analizzare direttamente in sala operatoria sotto una copertura opaca.
      5. Lasciare che gli animali si acclimatino alla sala operatoria per 30 minuti al buio con un rumore bianco di 65 db(A).
      6. Metti ogni animale in una camera di condizionamento della paura, assicurati che la camera sia bloccata e avvia il protocollo utilizzando il software di condizionamento della paura.
      7. Al termine del protocollo, rimuovete gli animali dalle camere di condizionamento della paura e rimetteteli nella loro gabbia. Se lo stesso giorno devono essere analizzate altre gabbie di animali, trasportare gli animali esposti al trauma in una sala di risveglio separata dalla stanza della gabbia domestica per evitare che gli animali traumatizzati comunichino informazioni agli animali naïve al trauma.
   2. Pulire l'interno delle camere di condizionamento della paura con etanolo al 70%. Se è necessario analizzare altri animali, pulire l'interno della camera con acido acetico all'1% e ripetere il protocollo fino a quando tutti gli animali non sono stati analizzati.
   3. Sessione trigger
      1. Programmare il protocollo di attivazione. Impostare il tempo totale su 300 s (5 min). Aggiungere correnti di 1 s a volte 60 s, 120 s, 180 s, 240 s e 300 s. Regolare la corrente a 0,7 mA.
      2. Installa gli inserti in plexiglass con telaio ad A nella camera di condizionamento della paura e pulisci tutte le superfici interne con il 10% di etanolo. Posizionare una macchina per il rumore bianco in ogni cabina di attenuazione del suono e regolare l'uscita sonora a 70 dB(A).
      3. Trasporta gli animali scoperti alla sala operatoria per il condizionamento della paura attraverso un percorso indiretto, che richiede più tempo rispetto al percorso diretto seguito per la sessione traumatica.
      4. Lasciare che gli animali si acclimatino alla stanza per il condizionamento della paura per 30 minuti.
      5. Metti ogni animale in una camera di condizionamento della paura, accendi la macchina del rumore bianco e avvia il protocollo.
      6. Al termine del protocollo, rimuovete gli animali dalle camere di condizionamento della paura e rimetteteli nella loro gabbia.
      7. Pulire l'interno delle camere di condizionamento della paura con etanolo al 70%. Se è necessario analizzare altri animali, pulire l'interno della camera con etanolo al 10%. Se non è necessario analizzare altri animali, pulire l'interno della camera con etanolo al 70%.

3. Valutazione comportamentale

1. Trasferimento buio/luce
   1. Disporre la scatola di trasferimento chiaro/scuro sotto la telecamera montata a soffitto. Ingrandisci la fotocamera fino a quando la casella chiara/scura riempie il campo visivo e regola la messa a fuoco in modo che l'immagine sia chiara. Posiziona un pezzo di plastica opaca sopra la porta che collega le arene chiare e scure.
      1. Definisci l'arena luminosa e l'area di valutazione del rischio (un'area di 1 pollice x 3 pollici direttamente fuori dalla porta nell'arena luminosa) nel software di tracciamento del movimento.
      2. Regola l'illuminazione nell'arena luminosa a 1.000-1.100 lux.
      3. Trasporta gli animali nella sala operatoria e lascia che gli animali si acclimatino per 30 minuti.
      4. Posiziona ogni animale nell'arena buia e rimetti il coperchio. Rimuovi la porta che separa le camere chiare e buie e registra il movimento dell'animale per 5 minuti.
      5. Estrarre l'animale dall'apparecchio e pulire tutte le superfici con etanolo al 70%.
      6. Calcola la percentuale di valutazione del rischio per ogni animale dividendo il tempo trascorso nell'area di valutazione del rischio per il tempo totale trascorso nell'arena luminosa.
      7. Riporta tutti gli animali nelle loro gabbie di casa. Pulisci accuratamente la scatola chiara/scura con etanolo al 70%.
2. Test di interramento del marmo
   1. Eseguire il test di interramento del marmo in una gabbia standard per microisolatori per ratti o in un involucro simile. Riempi ogni gabbia con 5 cm di lettiera fresca. Disporre le gabbie sul banco della sala operatoria e regolare le luci a <10 lux.
   2. Disponi 20 biglie di vetro nero pulite in una griglia 5 x 4 uniformemente distanziata sul fondo di ogni gabbia.
   3. Trasferire gli animali nella sala di interramento dei biglie per consentire agli animali di acclimatarsi per 30 minuti.
   4. Metti ogni animale in un'arena per seppellire le biglie per 25 minuti. Dopo 25 minuti, rimuovi ogni topo dalla sua arena e rimettilo nella sua gabbia.
   5. Calcola la % di biglie sepolte dividendo il numero di biglie sepolte per 20.
3. Risposta acustica allo spavento
   1. Definisci le prove di spavento, assenza di stimolo e prepulsazione nel software di risposta allo spavento.
      1. Definire lo stimolo di trasato di 120 dB(A) per emettere un tono di 40 ms di 120 dB(A) durante la misurazione dell'ampiezza di trasalimento.
      2. Definire gli stimoli di preimpulso da 75 dB(A), 80 dB(A) e 85 dB(A) per emettere un tono di 40 ms di 75 dB(A), 80 dB(A) o 85 dB(A), rispettivamente, seguito da un tono di 40 ms di 120 dB(A) durante la misurazione dell'ampiezza di spavento.
      3. Definite lo stimolo di assenza di trasalimento per emettere un tono di 40 ms di 65 dB(A) (sfondo) durante la misurazione dell'ampiezza di trasalimento.
   2. Definire la sessione di risposta acustica allo spavento.
      1. Impostare lo sfondo sul livello analogico correlato a 65 db(A).
      2. Aggiungi sette prove di startle da 120 db(A) all'inizio della sessione, seguite da altre dieci prove di startle da 120 db(A) intervallate casualmente da dodici prove senza stimolo, dodici prove di prepulse da 75 db(A), dodici prove di prepulse da 80 db(A) e dodici prove di prepulse da 85 db(A), seguite da sette stimoli di startle finali da 120 db(A).
   3. Trasferire gli animali in una stanza adiacente alla sala delle procedure di risposta acustica allo spavento e lasciare che gli animali si acclimatino per 30 minuti.
   4. Dopo l'acclimatazione di 30 minuti, trasferire gli animali da valutare nella sala operatoria al buio.
   5. Posizionare ogni animale nel sistema di ritenuta dell'unità di allarme acustico, sostituire gli inserti per trattenere ogni animale e chiudere la porta della cuccetta di attenuazione del suono. Assicurarsi che gli inserti siano posizionati in modo tale che l'animale sia centrato sul sensore di vibrazione ma sia ancora in grado di girarsi liberamente.
   6. Avviare il protocollo utilizzando il software startle response.
   7. Al termine del protocollo, rimuovere tutti gli animali dall'apparato di allarme acustico alla gabbia di trasferimento.
   8. Pulisci il sistema di ritenuta per animali strofinando accuratamente le superfici interne con etanolo al 70%.
   9. Calcola la latenza per spaventare il picco dell'ampiezza facendo la media del tempo ai valori di velocità massima per tutti gli stimoli di spavento di 120 dB(A) per ciascun animale.
   10. Calcolare la % di inibizione del prepulso. Calcolare il valore medio Vmax per stimoli di spavento di 120 dB(A), nessun sussulto, 75 dB(A) di spaccio, 80 db(A) di stimoli di spavento e 85 dB(A) di stimoli di spavento. Calcolare l'ampiezza media netta dello spavento sottraendo la Vmax media per gli stimoli senza spavento dalla Vmax media per 120 dB(A). Calcolare la % di inibizione del preimpulso per gli scatti di preimpulso di 75 db(A), 80 dB(A) e 85 dB(A) dividendo ogni Vmax media di preimpulso per la Vmax media di 120 dB(A), sottraendo tale rapporto da 1 e moltiplicando per 100. Calcolare la % media di inibizione pre-impulso calcolando la media delle inibizioni pre-impulso di 75 dB(A), 80 dB(A) e 85 db(A).
4. Attività in gabbia domestica
   1. Eseguire l'attività di gabbia domestica in gabbie di microisolatori con coperchi modificati dotati di sensori a infrarossi passivi che rilevano il movimento degli animali. Sostituire le borracce standard con tubi conici da 50 ml dotati di un tappo, per ridurre l'area del fondo della gabbia ostruita dalla vista del sensore di movimento. Mettere una quantità limitata di cibo (50-75 g) nell'inserto della gabbia metallica per ridurre l'ostruzione del sensore di movimento.
   2. Trasporta gli animali nella stanza delle attività della gabbia domestica dopo il test di risposta acustica allo spavento.
   3. Posizionare ogni animale in una gabbia per microisolatori modificata e assicurarsi che il sensore IR stia leggendo il movimento. Riposizionare la parte superiore e il coperchio della gabbia metallica.
   4. Controlla gli animali quotidianamente nel corso del test per assicurarti che ogni animale abbia accesso sufficiente sia al cibo che all'acqua.
   5. Alloggiare gli animali nelle gabbie di attività domestiche per 3 cicli luce/buio (72 h).
   6. Dopo il periodo di 72 ore, interrompere la registrazione e rimuovere tutti gli animali dalle gabbie domestiche.
   7. Calcolare la % di attività della fase leggera dividendo il numero totale di periodi di attività durante la seconda e la terza fase di luce per il numero totale di periodi di attività delle ultime 48 ore di monitoraggio.
5. Punteggio e inclusione
   1. Calcola il valore Z per la % di valutazione del rischio, la % di biglie sepolte, la % media di inibizione del preimpulso, la latenza rispetto all'ampiezza di sorpresa di picco e la % di lettura dell'attività della fase leggera per ciascun animale sottraendo il valore medio per quel test comportamentale in quella coorte e quindi dividendo per la deviazione standard di quel test comportamentale in quella coorte.
   2. Assegna punti al 20% degli animali più simili al disturbo da stress post-traumatico per ogni lettura comportamentale. Il 20% degli animali che mostrano la più bassa % di valutazione del rischio, la più alta % di biglie sepolte, la più bassa % media di inibizione del preimpulso, la più bassa latenza rispetto all'ampiezza di picco di spavento e la più alta % di attività della fase luminosa, ricevono rispettivamente 3, 1, 2, 3 e 1 punti (Tabella 1).
   3. Somma tutti i punti ricevuti da ciascun animale nei test comportamentali. Designa gli animali che ricevono 5 punti o più come simili al disturbo da stress post-traumatico e designa gli animali che ricevono 0 punti come resilienti.

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Risultati

Ci aspettiamo di vedere animali che mostrano un comportamento simile al PTSD in ogni test comportamentale distribuito uniformemente in tutte le coorti. Una concentrazione di animali simili al PTSD in una qualsiasi coorte può indicare artefatti introdotti durante l'induzione del PTSD o i test comportamentali. Gli animali che ottengono punti in ogni lettura comportamentale sono equamente distribuiti in tutte le coorti testate (Figura 2). 7 dei 48 animali (14,...

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Discussione

Il PTSD è una malattia psichiatrica complessa ed eterogenea. Sfortunatamente, attualmente non esiste un modello animale affidabile per il comportamento simile al PTSD e i paradigmi comportamentali per l'induzione di un comportamento simile al PTSD sono il mezzo più affidabile per generare animali che mostrano un fenotipo comportamentale simile al PTSD. Il paradigma qui descritto fornisce un mezzo robusto e affidabile per precipitare un fenotipo comportamentale simile al PTSD dovuto all...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid, glacial	Sigma Aldrich	AX0073
Benchtop Balance	Fisher Scientific	01-913-925
Clocklab Data Collection Suite	Actimetrics	-	Home cage activity cages
Deciblemeter
Ethovision XT14 Software	Noldus	-	Movement tracking software
Ethyl alcohol	Sigma Aldrich	443611
Light/Dark Box	Noldus	-	Light/dark transfer box
Lux Meter
Monochrome GigE Camera	Noldus	-	Requires Ceiling Mounting Hardware Available from Noldus
NIR Video Fear Conditioning Package for Mouse [Standard, USB]	Med Associates	MED-VFC2-USB-M	Fear conditioning equipment and chamber. Package includes all equipment needed to assay 1 animal at a time.
Spray Bottle	Thermo Scientific	BirA500
SR LAB Software	San Diego Instruments	-	Startle response software
SR LAB Startle Response Unit	San Diego Instruments	-	Acoustic startle unit
Video Fear Coniditioning "Video Freeze " Software	Med Associates	SOF-843	Fear conditioning software
White noise machine	Med Associates	ENV-230