マウスにおける心的外傷後ストレス障害(PTSD)様行動の誘導のためのプロトコル

要約

この研究では、マウスに心的外傷後ストレス障害(PTSD)のような行動を誘発し、避けられない電気フットショックを2回行います。PTSDに特異的な行動について、いくつかのアッセイを用いて、PTSDに特異的な動物を同定します。

要約

心的外傷後ストレス障害(PTSD)は、心的外傷性事象(TE)にさらされた個人の~10%に発症する衰弱性の精神疾患です。症状には、反復性や侵入性思考、睡眠障害、過敏症、誇張された驚愕、無謀または破壊的な行動などがあります。この疾患の複雑で不均一な性質を考えると、PTSDのような症状の動物モデルは、PTSD研究の分野にとってますます関心が高まっています。PTSDのような症状に対するレジリエンスはPTSDの重要な疫学的側面であるため、脆弱でレジリエンスのある動物を解決する動物モデルは特に価値があります。PTSDの表現型の複雑な性質と、PTSDのような行動と不安やうつ病などの他のストレス誘発性精神病理に関連する行動との間には潜在的な重複があるため、PTSDのような行動の複数の読み出しを利用する動物モデルも価値が高まっています。Lebow et al. 2012によって開発されたパラダイムを利用して、マウスのPTSD様症状の誘導と同定を行います。このパラダイムは、避けられない電気フットショックを利用しており、2日間連続して2つの非文脈化されたセッションで投与されます。ストレスを受けたマウスは、PTSD様行動の5つの行動測定値を生成するために、暗光移動、ビー玉埋設、音響驚愕、およびホームケージ活動の4つの行動テストを実行します:リスク評価(%RA)、埋もれたビー玉(%MB)、プレパルス阻害(%PPI)、ピーク驚愕振幅までの潜伏遅延(LPSA)、および光位相活性(%LPA)。PTSD様症状は、%RAの減少、%MBの増加、%PPIの減少、LPSAの減少、および%LPAの増加を特徴とする。各テストで最もPTSD様な行動を示した20%の動物には、テストに応じて一定数の点数が与えられ、十分な点数を獲得した動物をPTSD様と指定し、点数を獲得しなかった動物をPTSDレジリエントと指定しています。このパラダイムは、動物の~15%でPTSDのような行動を特定しており、これはヒトで観察されるものに匹敵する割合です。このプロトコルは、マウスにおけるPTSD様行動の誘導のための堅牢で再現性のあるパラダイムを表しています。

概要

心的外傷後ストレス障害(PTSD)は、心的外傷性事象(^TE)1にさらされた個人に引き起こす可能性のある衰弱性精神病理です。DSM-Vによると、TE曝露は、自分自身または別の人に対する実際のまたは知覚された死の脅威、身体的危害、または性的暴力への直接的または反復的な間接的な曝露を含む、さまざまな形態をとる可能性があります²。PTSDの症状は、侵入的な否定的な思考や記憶、過覚醒、過警戒、リスクテイク行動の増加、睡眠サイクルの乱れを特徴としています³。世界中の TE 曝露の生涯有病率は約 64%-70%³ と比較的高くなっていますが、PTSD の生涯有病率は比較的低く、~1.3%-12%⁴ です。PTSDの降水量と比較したTE曝露の有病率のこの格差は、PTSDに対する脆弱性における強い遺伝子x環境相互作用を示唆しています。PTSDのような行動の信頼できる脊椎動物モデルが現在存在しないことを考えると、この分野はPTSDのような症状の誘発のための行動パラダイムに依存しています⁵。

PTSDは複雑で非常に不均一な精神疾患であり、PTSD様症状の堅牢で信頼性の高い動物モデルの開発は困難でした。凍結などのPTSDのような行動に一般的に使用される測定値は、他のトラウマ誘発性精神病理学、すなわち不安神経症やうつ病の症状でもあります⁶。これは、PTSDとうつ病²の間の高い併存疾患によってさらに複雑になります。最近の研究では、トラウマ的な出来事を目撃したラットは、不安と抑うつの行動の増加を示すことが示されています^7,8,9、げっ歯類のPTSDの行動モデルを利用する際にPTSD特有の行動を評価することの重要性をさらに示しています。さらに、トラウマ性イベント曝露後のPTSD様症状に対するレジリエンスは、PTSDの重要な疫学的特徴であり、世界中でトラウマ性イベント曝露の生涯発生率はPTSDの生涯有病率をはるかに上回っています。歴史的に、恐怖記憶^10,11を調査するようなPTSD様行動の誘導のための行動モデルは、トラウマに曝露された対照群(PTSD回復性動物)からPTSD様動物を解決せず、すべてのトラウマ曝露動物をPTSD様動物として扱い、PTSDの特異的な症状ではないか、不安やうつ病などの他のトラウマ誘発性精神病理の症状である凍結などの一般的に使用される行動の読み出しはほとんどなかった¹².これらのパラダイムは恐怖記憶の神経回路を調査するのに効果的ですが、PTSDのような行動の確固とした具体的な評価の欠如は、これらのデータの翻訳に影響を与える可能性があります。したがって、この分野の現状は、PTSDのような動物と回復力のある動物の両方を特定するために、複数のPTSD固有の行動読み出しを利用するパラダイムに焦点を当てています¹²。

マウスにおけるPTSD様行動の誘導のために最近開発されたパラダイムを利用し、一連の4つの行動テストを使用してPTSD様動物と回復力のある動物の両方を特定し、5つのPTSD様行動の読み取り値をアッセイします^13,14。PTSDのような行動は、2つのセッションで脱文脈化された電気フットショックを使用して誘発されます。動物は、初日に最初に重度のトラウマセッションにさらされ、次に翌日に比較的軽度のトリガーセッションにさらされます(図1)。この組み合わせは、PTSD様行動の沈殿を有意に増加させることが示されています。このパラダイムは、慢性ストレス(より抑うつ的な表現型¹⁵を誘発する可能性がある)や外傷性脳損傷(PTSDのような明確な表現型^{をもたらす可能性がある14})ではなく、PTSD誘発のための急性ストレスモデルを利用しています。同様に、このパラダイムでPTSDのような行動を特定するために利用される行動の読み出し(リスクテイク行動の減少、大理石の埋没の増加、プレパルス抑制の減少、ピーク驚愕振幅までの潜伏時間の減少、光相活動の増加（図1)−は、不安やうつ病などの他のトラウマ誘発性精神病理ではなく、PTSD様行動に特異的である。さらに、複数の行動測定値の使用、および動物がPTSDのような行動を示すために複数のPTSDのような行動を示す必要があるため、PTSDのような動物と指定された動物が本当にPTSDのような表現型を示している可能性が高くなります。これらのプロトコルの特徴が組み合わさって、このパラダイムがマウスにPTSD様症状を誘発するための堅牢で信頼性の高い手段であることが保証されます。

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プロトコル

ここに記載されているすべての手順は、メイヨークリニックの施設用動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. 動物と住居

1. 標準的な飼育条件(標準的なマイクロアイソレーターケージ、70°Fの室温(RT)、食物と水の 自由度、12時間/12時間の明暗サイクル)で、10週齢の雄C57BL/6Jマウスを4対ケージで飼育します。

2. PTSD導入

1. トラウマセッション
   1. 恐怖条件付け機器とチャンバーを準備します。
      1. 恐怖条件付けソフトウェアでトラウマプロトコルをプログラムします。合計時間を 5100 秒 (85 分) に設定します。時間 0 秒から時間 5,100 秒までの白色光を追加します。ランダムな試行間間隔(ITI)で14個の1s電流を追加します。電流を1.0mAに調整します。
      2. 各恐怖コンディショニングチャンバーのすべての内面を1%酢酸溶液で拭き取ります。.
      3. 処置室の照明を消し、赤色電球付きのランプを点灯して部屋を照らします。
      4. アッセイする動物は、不透明なカバーの下で直接処置室に運びます。
      5. 動物が65 db(A)のホワイトノイズで暗闇の中で30分間処置室に順応するのを待ちます。
      6. 各動物を恐怖条件付けチャンバーに入れ、チャンバーがラッチされていることを確認し、恐怖条件付けソフトウェアを使用してプロトコルを開始します。
      7. プロトコルが終了したら、動物を恐怖条件付けチャンバーから取り出し、ケージに戻します。同じ日に動物の追加のケージを分析する場合は、トラウマにさらされた動物を自宅のケージルームとは別の回復室に輸送して、トラウマを負った動物がトラウマナイーブな動物に情報を伝えるのを防ぎます。
   2. 恐怖コンディショニングチャンバーの内部を70%エタノールで洗浄します。追加の動物をアッセイする場合は、チャンバーの内部を1%酢酸で洗浄し、すべての動物がアッセイされるまでプロトコルを繰り返します。
   3. トリガー セッション
      1. トリガープロトコルをプログラムします。合計時間を 300 秒 (5 分) に設定します。60 秒、120 秒、180 秒、240 秒、300 秒の時点で 1 秒の電流を追加します。電流を0.7mAに調整します。
      2. Aフレームプレキシガラスインサートを恐怖コンディショニングチャンバーに取り付け、10%エタノールですべての内面を拭き取ります。各消音キュービクルにホワイトノイズマシンを設置し、音の出力を70 dB(A)に調整します。
      3. 発見された動物を間接的なルート で 恐怖条件付け処置室に運びますが、これはトラウマセッションの直接ルートよりも時間がかかります。
      4. 動物が恐怖のコンディショニングルームに30分間順応するのを待ちます。
      5. 各動物を恐怖条件付けチャンバーに入れ、ホワイトノイズマシンの電源を入れ、プロトコルを開始します。
      6. プロトコルが終了したら、動物を恐怖条件付けチャンバーから取り出し、ケージに戻します。
      7. 恐怖コンディショニングチャンバーの内部を70%エタノールで洗浄します。追加の動物をアッセイする場合は、10%エタノールでチャンバー内を洗浄します。追加の動物をアッセイしない場合は、70%エタノールでチャンバー内を洗浄します。

3. 行動評価

1. ダーク/ライト転送
   1. 天井に取り付けられたカメラの下に明暗トランスファーボックスを配置します。明るい/暗いボックスが視野いっぱいになるまでカメラを拡大し、画像が鮮明になるようにフォーカスを調整します。明るいアリーナと暗いアリーナをつなぐ出入り口に不透明なプラスチック片を置きます。
      1. 動き追跡ソフトウェアで、ライトアリーナとリスク評価エリア(ライトアリーナのドアのすぐ外側にある1インチ×3インチのエリア)を定義します。
      2. 明るいアリーナの照明を1,000〜1,100ルクスに調整します。
      3. 動物を処置室に運び、動物が30分間順応するのを待ちます。
      4. 各動物を暗いアリーナに置き、蓋を元に戻します。明暗室を隔てる出入り口を取り外し、動物の動きを5分間記録します。
      5. 動物を装置から取り外し、70%エタノールですべての表面を清掃します。
      6. リスク評価エリアで費やした時間をライトアリーナで費やした合計時間で割ることにより、各動物のリスク評価の%を計算します。
      7. すべての動物を自宅のケージに戻します。ライト/ダークボックスを70%エタノールで完全に清掃します。
2. 大理石埋設試験
   1. 大理石埋設試験は、標準的なラットマイクロアイソレータケージまたは同様のエンクロージャーで実施します。各ケージに5cmの新鮮な寝具を入れます。処置室のベンチにケージを配置し、照明を<10ルクスに調整します。
   2. 20個のきれいな黒いガラスのビー玉を、各ケージの底に等間隔の5 x 4のグリッドに配置します。
   3. 動物を大理石埋葬処置室に移し、動物が30分間順応できるようにします。
   4. 各動物を大理石を埋めるアリーナに25分間置きます。25分後、各マウスをアリーナから取り出し、ケージに戻します。
   5. 埋もれたビー玉の数を20で割って、埋もれたビー玉の割合を計算します。
3. 音響驚愕応答
   1. 驚愕応答ソフトウェアで、驚愕、刺激なし、およびプレパルス驚愕の試行を定義します。
      1. 120 dB(A) の驚愕刺激を定義して、驚愕の振幅を測定しながら 120 dB(A) の 40 ms トーンを発します。
      2. 75 dB(A)、80 dB(A)、85 dB(A) のプリパルス スティミュラスを定義して、それぞれ 75 dB(A)、80 dB(A)、85 dB(A) の 40 ミリ秒トーンを放出し、その後に 120 dB(A) の 40 ミリ秒トーンを放出し、驚愕振幅を測定します。
      3. 驚愕の振幅を測定しながら、65 dB(A)(バックグラウンド)の40 msトーンを発する驚愕刺激を定義します。
   2. 音響驚愕応答セッションを定義します。
      1. バックグラウンドを65 db(A)に相関するアナログ・レベルに設定します。
      2. セッションの開始時に120 db(A)の驚愕試験を7回追加し、その後、120 db(A)の驚愕試験を10回、刺激なしの試験を12回、75 db(A)のプレパルスを12回、80 db(A)のプレパルスを12回、85 db(A)のプレパルスを12回、最後に120 db(A)の驚愕刺激を7回加えます。
   3. 動物を音響驚愕反応手順室に隣接する部屋に移し、動物が30分間順応するのを待ちます。
   4. 30分間の順応後、評価する動物を暗闇の中で処置室に移します。
   5. 各動物を音響驚愕ユニットの拘束具に入れ、インサートを交換して各動物を拘束し、音響減衰キュービクルのドアを閉めます。動物が振動センサーの中央に配置されているが、それでも自由に向きを変えることができるようにインサートが配置されていることを確認してください。
   6. startle レスポンスソフトウェアを使用してプロトコルを開始します。
   7. プロトコールが終了したら、すべての動物を音響驚愕装置からトランスファーケージに移します。
   8. 70%エタノールで内面を完全に拭き取って、動物用拘束具を清掃します。
   9. 各動物のすべての120 dB(A)驚愕刺激の最大速度値までの時間を平均することにより、振幅のピーク驚愕までの遅延を計算します。
   10. % プリパルス阻害を計算します。120 dB(A) 驚愕刺激、驚愕なし、75 dB(A) 驚愕刺激、80 dB(A) 驚愕刺激、および 85 dB(A) 驚愕刺激の平均 Vmax 値を計算します。120 dB(A) の平均 Vmax から、驚愕刺激がない場合の平均 Vmax を差し引くことにより、正味平均驚愕振幅を計算します。75 db(A)、80 dB(A)、および 85 dB(A) のプリパルス アスタードの % プリパルス阻害を、各平均プリパルス Vmax を平均 120 dB(A) Vmax で割り、その比率を 1 から減算して 100 を掛けて計算します。75 dB(A)、80 dB(A)、85 dB(A) % のパルス前抑制を平均して、平均 % のパルス前抑制を計算します。
4. ホームケージの活動
   1. 動物の動きを検出するパッシブ赤外線センサーが取り付けられた改良型蓋を備えたマイクロアイソレーターケージで、ホームケージの活動を行います。標準のウォーターボトルをストッパーシッパーが取り付けられた50mLコニカルチューブに交換して、モーションセンサーの視界から遮られるケージ底の領域を減らします。モーションセンサーの障害物を減らすために、ワイヤーケージインサートに限られた量の食品(50〜75 g)を入れます。
   2. 音響驚愕反応テストの後、動物をホームケージ活動室に運びます。
   3. 各動物を改造されたマイクロアイソレーターケージに入れ、IRセンサーが動きを読み取りていることを確認します。ワイヤーケージの上部と蓋を元に戻します。
   4. アッセイの過程で動物を毎日チェックし、各動物が食物と水の両方に十分にアクセスできることを確認します。
   5. 3つの明るい/暗いサイクル(72時間)のためのホームケージアクティビティケージに動物を収容します。
   6. 72時間の期間の後、録音を停止し、すべての動物を自宅のケージから取り出します。
   7. 第 2 および第 3 の光期の活動発作の総数を、モニタリングの過去 48 時間の活動発作の総数で割ることにより、光期の活動量 % を計算します。
5. スコアリングとインクルージョン
   1. 各動物のリスク評価率、埋もれたビー玉の割合、平均パルス阻害率、ピーク驚愕振幅までの潜伏期間、および光相活動の読み出しのZ値を計算しますそのコホートの行動テストの平均値を差し引き、次にそのコホートの行動テストの標準偏差で除算します。
   2. 各行動の読み出しについて、最もPTSDのような上位20%の動物に賞がポイントされます。リスク評価が最も低い動物、埋もれたビー玉の割合が最も低い、平均パルス阻害率が最も低い、驚愕振幅がピークに達するまでの潜伏期間が最も低い、および光相活性が最も高い上位20%の動物は、それぞれ3、1、2、3、および1ポイントを受け取ります(表1)。
   3. 行動テストで各動物が受け取ったすべてのポイントを追加します。5点以上を獲得した動物をPTSD様と指定し、0点を獲得した動物をレジリエンスと指定します。

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結果

各行動テストでPTSDのような行動を示す動物が、すべてのコホートに均等に分布することを期待しています。いずれかのコホートにPTSD様動物が集中していることは、PTSD導入または行動試験中に導入されたアーティファクトを示している可能性があります。各行動の読み出しでポイントを獲得した動物は、テストしたすべてのコホートに均等に分配されます(

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ディスカッション

PTSDは、複雑で異質な精神疾患です。残念ながら、PTSD様行動の信頼できる動物モデルは現在なく、PTSD様行動の誘導のための行動パラダイムは、PTSD様行動表現型を示す動物を生成する最も信頼できる手段です。ここで説明するパラダイムは、急性トラウマを使用してPTSDのような行動を引き起こし、複数のPTSD特異的な行動を読み出してPTSDのような動物を特定すること?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid, glacial	Sigma Aldrich	AX0073
Benchtop Balance	Fisher Scientific	01-913-925
Clocklab Data Collection Suite	Actimetrics	-	Home cage activity cages
Deciblemeter
Ethovision XT14 Software	Noldus	-	Movement tracking software
Ethyl alcohol	Sigma Aldrich	443611
Light/Dark Box	Noldus	-	Light/dark transfer box
Lux Meter
Monochrome GigE Camera	Noldus	-	Requires Ceiling Mounting Hardware Available from Noldus
NIR Video Fear Conditioning Package for Mouse [Standard, USB]	Med Associates	MED-VFC2-USB-M	Fear conditioning equipment and chamber. Package includes all equipment needed to assay 1 animal at a time.
Spray Bottle	Thermo Scientific	BirA500
SR LAB Software	San Diego Instruments	-	Startle response software
SR LAB Startle Response Unit	San Diego Instruments	-	Acoustic startle unit
Video Fear Coniditioning "Video Freeze " Software	Med Associates	SOF-843	Fear conditioning software
White noise machine	Med Associates	ENV-230