생쥐의 외상 후 스트레스 장애(PTSD)와 같은 행동 유도를 위한 프로토콜

요약

이 연구에서는 피할 수 없는 전기 발 충격을 두 번 사용하여 생쥐에서 외상 후 스트레스 장애(PTSD)와 유사한 행동을 유도합니다. PTSD와 유사하고 회복력이 있는 동물은 PTSD 관련 행동에 대한 여러 분석을 사용하여 식별됩니다.

초록

외상 후 스트레스 장애(PTSD)는 외상 사건(TE)에 노출된 개인의 ~10%에서 발생하는 쇠약해지는 정신 질환입니다. 증상으로는 반복적이고 거슬리는 생각, 수면 장애, 과잉 경계, 과장된 놀라움, 무모하거나 파괴적인 행동 등이 있습니다. 이 질병의 복잡하고 이질적인 특성을 감안할 때, PTSD와 유사한 증상에 대한 동물 모델은 PTSD 연구 분야에서 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다. PTSD와 유사한 증상에 대한 회복력은 PTSD의 중요한 역학적 측면이기 때문에 취약하고 회복력이 있는 동물을 해결하는 동물 모델은 특히 가치가 있습니다. PTSD 표현형의 복잡한 특성과 PTSD와 같은 행동과 불안 또는 우울증과 같은 다른 스트레스 유발 정신 병리학과 관련된 행동 사이의 잠재적인 중복으로 인해 PTSD와 같은 행동에 대한 다중 판독값을 활용하는 동물 모델도 가치가 증가하고 있습니다. 우리는 Lebow et al. 2012가 개발한 패러다임을 활용하여 생쥐에서 PTSD와 유사한 증상을 유도하고 식별합니다. 이 패러다임은 피할 수 없는 전기 발 충격을 활용하며, 이틀 연속으로 두 번의 탈맥락화된 세션으로 시행됩니다. 스트레스를 받은 마우스는 PTSD와 유사한 행동에 대한 5가지 행동 판독값(% 위험 평가(%RA), % 매몰된 구슬(%MB), % 사전 펄스 억제(%PPI), 최대 놀람 진폭까지의 대기 시간(LPSA) 및 % 광상 활동(%LPA)의 4가지 행동 판독값을 생성합니다. PTSD 유사 증상은 %RA 감소, %MB 증가, %PPI 감소, LPSA 감소 및 %LPA 증가가 특징입니다. 각 테스트에서 PTSD와 유사한 행동을 가장 많이 보인 동물 중 20%는 테스트에 따라 특정 점수가 부여되며, 충분한 점수를 받은 동물은 PTSD와 유사한 동물로, 점수가 없는 동물은 PTSD 회복력으로 분류됩니다. 이 패러다임은 동물의 ~15%에서 PTSD와 유사한 행동을 식별하며, 이는 인간에서 관찰된 비율과 비슷합니다. 이 프로토콜은 마우스에서 PTSD와 유사한 행동을 유도하기 위한 강력하고 재현 가능한 패러다임을 나타냅니다.

서문

외상 후 스트레스 장애(PTSD)는 외상 사건(TE)에 노출된 개인에게 발생할 수 있는 쇠약해지는 정신 병리학입니다¹. DSM-V에 따르면, TE 노출은 자신 또는 타인에 대한 실제 또는 인지된 사망, 신체 상해 또는 성폭력의 위협에 대한 직간접적인 노출을 포함하여 다양한 형태로 나타날 수 있습니다². PTSD 증상은 거슬리는 부정적인 생각과 기억, 과각성, 과잉 경계, 위험 감수 행동 증가, 수면 주기 방해 등이 특징이다³. 전 세계적으로 TE 노출의 평생 유병률은 약 64%-70%³로 비교적 높지만, PTSD의 평생 유병률은 ~1.3%-12%⁴로 비교적 낮습니다. PTSD 강수량에 비해 TE 노출 유병률의 이러한 불균형은 PTSD에 대한 취약성에서 강력한 유전자 x 환경 상호 작용을 시사합니다. 현재 PTSD와 유사한 행동에 대한 신뢰할 수 있는 척추동물 모델이 없다는 점을 감안할 때, 이 분야는 PTSD와 유사한 증상의 유도를 위해 행동 패러다임에 의존하고 있다⁵.

PTSD는 복잡하고 매우 이질적인 정신 질환이며, PTSD와 유사한 증상에 대한 강력하고 신뢰할 수 있는 동물 모델을 개발하는 것은 어려운 일입니다. 얼어붙는 것과 같은 PTSD와 유사한 행동에 대해 일반적으로 사용되는 판독값은 다른 외상으로 유발된 정신 병리학, 즉 불안 및 우울증의 증상이기도 하다⁶. 이는 PTSD와 우울증 사이의 높은 동반 질환으로 인해 더욱 복잡해진다². 최근 연구에 따르면 외상성 사건을 목격한 쥐는 불안과 우울증 행동이 증가했으며^{, 7,8,9} 이는 설치류에서 PTSD의 행동 모델을 활용할 때 PTSD 특정 행동을 평가하는 것의 중요성을 더욱 입증합니다. 또한, 전 세계적으로 외상성 사건 노출의 평생 발생률이 PTSD의 평생 유병률을 훨씬 능가하기 때문에 외상성 사건 노출 후 PTSD와 유사한 증상에 대한 복원력은 PTSD의 중요한 역학적 특징입니다. 역사적으로 공포 기억을 조사하는 것과 같은 PTSD와 유사한 행동의 유도를 위한 행동 모델^10,11은 PTSD와 유사한 동물을 외상에 노출된 대조군(PTSD-resilient animals)으로부터 해결하지 못하고, 외상에 노출된 모든 동물을 PTSD와 유사한 동물로 취급하며, PTSD의 특별한 증상이 없거나 불안 또는 우울증과 같은 다른 외상에 의한 다른 정신병리의 증상인 동결과 같은 행동 판독이 거의 사용되지 않았다¹². 이러한 패러다임은 공포 기억의 신경 회로를 조사하는 데 효과적이지만, PTSD와 유사한 행동에 대한 강력하고 구체적인 평가가 부족하기 때문에 이러한 데이터의 번역에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 이 분야의 현재 상태는 PTSD와 유사한 동물과 회복력 있는 동물을 모두 식별하기 위해 여러 PTSD 관련 행동 판독값을 활용하는 패러다임에 초점을 맞추고 있습니다¹².

우리는 생쥐에서 PTSD와 유사한 행동을 유도하기 위해 최근에 개발된 패러다임을 활용하며, 일련의 4가지 행동 테스트를 사용하여 5개의 PTSD와 유사한 행동 판독값을 분석하기 위해 PTSD와 유사한 동물과 탄력적인 동물을 모두 식별합니다^13,14. PTSD와 유사한 행동은 두 세션에 걸쳐 탈맥락화된 전기 발 충격을 사용하여 유도됩니다. 동물은 첫째 날에 심각한 외상 세션에 먼저 노출되고 다음 날에는 비교적 가벼운 트리거 세션에 노출됩니다(그림 1). 이 조합은 PTSD와 유사한 행동의 강수량을 크게 증가시키는 것으로 나타났습니다. 이 패러다임은 만성 스트레스(더 우울한 표현형¹⁵를 유발할 수 있음) 또는 외상성 뇌 손상(뚜렷한 PTSD와 유사한 표현형¹⁴를 초래할 수 있음)보다는 PTSD 유도를 위해 급성 스트레스 모델을 사용합니다. 마찬가지로, 이 패러다임에서 PTSD와 유사한 행동을 식별하는 데 사용되는 행동 판독값(위험 감수 행동 감소, 대리석 매몰 증가, 사전 펄스 억제 감소, 최대 놀람 진폭에 대한 대기 시간 감소, 광상 활동 증가)은 불안이나 우울증과 같은 다른 외상 유발 정신 병리학이 아닌 PTSD와 유사한 행동에 특이적입니다. 또한, 다중 행동 판독 값의 사용과 PTSD와 유사한 것으로 지정되기 위해 동물이 여러 PTSD와 유사한 행동을 보여야 할 필요성으로 인해 PTSD와 유사한 것으로 지정된 동물이 실제로 PTSD와 유사한 표현형을 보일 가능성이 높아집니다. 이러한 프로토콜의 이러한 특징은 이 패러다임이 생쥐에서 PTSD와 유사한 증상을 유발하는 강력하고 신뢰할 수 있는 수단임을 보장합니다.

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프로토콜

여기에 설명된 모든 절차는 Mayo Clinic 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다.

1. 동물과 주거

1. 10주 된 수컷 C57BL/6J 마우스 4-to-a-cage를 표준 사육 조건(표준 미세절연체 케이지, 70°F 실온(RT), 음식 및 물 임시, 12시간/12시간 라이트/다크 사이클)에 수용합니다.

2. PTSD 유도

1. 트라우마 세션
   1. 공포 조절 장비와 약실을 준비하십시오.
      1. 공포 조절 소프트웨어에서 트라우마 프로토콜을 프로그래밍합니다. 총 시간을 5100초(85분)로 설정합니다. 시간 0초 - 시간 5,100초의 백색광을 추가합니다. 임의의 ITI(Inter-Trial Interval)에서 14개의 1초 전류를 추가합니다. 전류를 1.0mA로 조정합니다.
      2. 각 공포 조절 챔버의 모든 내부 표면을 1% 아세트산 용액으로 닦습니다.
      3. 시술실의 불을 끄고 빨간불 전구가 장착된 램프를 켜서 시술실을 밝힙니다.
      4. 분석할 동물을 불투명한 덮개 아래의 시술실로 직접 운반합니다.
      5. 동물이 65db(A) 백색 소음으로 어둠 속에서 30분 동안 시술실에 적응하도록 합니다.
      6. 각 동물을 공포 조절 챔버에 넣고, 챔버가 잠겨 있는지 확인한 다음 공포 조절 소프트웨어를 사용하여 프로토콜을 시작합니다.
      7. 프로토콜이 끝나면, 공포 조절실에서 동물들을 꺼내 우리로 돌려보낸다. 같은 날 동물의 추가 케이지를 분석해야 하는 경우, 외상에 노출된 동물을 가정용 케이지실과 분리된 회복실로 이송하여 외상을 입은 동물이 외상을 입지 않은 동물에게 정보를 전달하는 것을 방지합니다.
   2. 공포 조절 챔버 내부를 70% 에탄올로 청소합니다. 추가 동물을 분석해야 하는 경우 1% 아세트산으로 챔버 내부를 청소하고 모든 동물이 분석될 때까지 프로토콜을 반복합니다.
   3. 트리거 세션
      1. 트리거 프로토콜을 프로그래밍합니다. 총 시간을 300초(5분)로 설정합니다. 1초, 60초, 120초, 180초, 240초 및 300초에 1초 전류를 추가합니다. 전류를 0.7mA로 조정합니다.
      2. 공포 조절 챔버에 A-프레임 플렉시 유리 인서트를 설치하고 10% 에탄올로 모든 내부 표면을 닦습니다. 각 사운드 감쇠 큐비클에 백색 잡음 기계를 배치하고 사운드 출력을 70dB(A)로 조정합니다.
      3. 발견된 동물들을 간접 경로를 통해 공포 조절 절차실로 이송하는데, 이는 외상 세션을 위해 취한 직접 경로보다 더 오래 걸립니다.
      4. 동물들이 30분 동안 공포 조절실에 적응할 수 있도록 합니다.
      5. 각 동물을 공포 조절실에 넣고 백색 소음 기계를 켠 다음 프로토콜을 시작합니다.
      6. 프로토콜이 끝나면, 공포 조절실에서 동물들을 꺼내 우리로 돌려보낸다.
      7. 공포 조절 챔버 내부를 70% 에탄올로 청소합니다. 추가 동물을 분석해야 하는 경우 10% 에탄올로 챔버 내부를 청소하십시오. 추가로 동물을 분석할 필요가 없는 경우, 70% 에탄올로 챔버 내부를 청소합니다.

3. 행동 평가

1. 다크/라이트 전송
   1. 천장에 장착된 카메라 아래에 라이트/다크 전송 상자를 배치합니다. 라이트/다크 박스가 시야를 채울 때까지 카메라를 확대하고 이미지가 선명하도록 초점을 조정합니다. 밝은 경기장과 어두운 경기장을 연결하는 출입구에 불투명한 플라스틱 조각을 놓습니다.
      1. 이동 추적 소프트웨어에서 조명 영역과 위험 평가 영역(조명 영역에서 도어 바로 바깥쪽에 있는 1인치 x 3인치 영역)을 정의합니다.
      2. 밝은 경기장의 조명을 1,000-1,100lux로 조정합니다.
      3. 동물을 시술실로 옮기고 30분 동안 동물이 적응할 수 있도록 합니다.
      4. 각 동물을 어두운 투기장에 넣고 뚜껑을 교체하십시오. 밝은 방과 어두운 방을 구분하는 출입구를 제거하고 5분 동안 동물의 움직임을 기록합니다.
      5. 장치에서 동물을 제거하고 70% 에탄올로 모든 표면을 청소합니다.
      6. 위험 평가 구역에서 보낸 시간을 라이트 아레나에서 보낸 총 시간으로 나누어 각 동물에 대한 위험 평가 %를 계산합니다.
      7. 모든 동물을 집 우리로 되돌립니다. 70% 에탄올로 라이트/다크 박스를 철저히 청소합니다.
2. 대리석 매몰 시험
   1. 표준 쥐 마이크로 아이솔레이터 케이지 또는 유사한 인클로저에서 대리석 매몰 테스트를 수행합니다. 각 케이지에 5cm의 새 침구를 채웁니다. 시술실 벤치에 케이지를 배치하고 조명을 <10lux로 조정합니다.
   2. 20개의 깨끗한 검은색 유리 구슬을 각 케이지 바닥을 가로질러 균일한 간격의 5 x 4 그리드로 배열합니다.
   3. 동물들을 대리석 매몰 절차실로 옮겨 30분 동안 적응할 수 있도록 합니다.
   4. 각 동물을 대리석 묻기 경기장에 25분 동안 놓습니다. 25분 후, 투기장에서 각 쥐를 제거하고 우리로 되돌립니다.
   5. 묻힌 구슬의 수를 20으로 나누어 묻힌 구슬의 %를 계산합니다.
3. 음향 놀람 반응
   1. 놀람 반응 소프트웨어에서 놀람, 자극 없음, 프리펄스 놀람 시도를 정의합니다.
      1. 120dB(A) 놀람 진폭을 측정하면서 120dB(A)의 40ms 톤을 방출하도록 120dB(A) 놀람 자극을 정의합니다.
      2. 75dB(A), 80dB(A) 및 85dB(A) 프리펄스 자극을 각각 75dB(A), 80dB(A) 또는 85dB(A)의 40ms 톤을 방출한 다음 120dB(A)의 40ms 톤을 방출하도록 정의하면서 놀람 진폭을 측정합니다.
      3. 놀람 진폭을 측정하면서 65dB(A)(배경)의 40ms 톤을 방출하도록 놀람 없음 자극을 정의합니다.
   2. acoustic startle response session을 정의합니다.
      1. 배경을 65db(A)에 상관관계가 있는 아날로그 레벨로 설정합니다.
      2. 세션 시작 시 7번의 120 db(A) 놀람 시도를 추가하고, 12개의 무자극 시도, 12개의 75 db(A) 프리펄스 시도, 12개의 80 db(A) 프리펄스 시도, 12개의 85 db(A) 프리펄스 시도, 12개의 85 db(A) 프리펄스 시도, 마지막으로 7개의 120 db(A) 놀람 자극을 추가합니다.
   3. 동물들을 음향 놀람 반응 절차실에 인접한 방으로 옮기고 동물들이 30분 동안 적응할 수 있도록 합니다.
   4. 30분 동안 적응한 후, 평가할 동물을 어둠 속의 시술실로 옮깁니다.
   5. 각 동물을 음향 놀람 장치의 구속기에 넣고, 각 동물을 구속하기 위해 삽입물을 교체하고, 소리 감쇠 칸막이의 문을 닫습니다. 동물이 진동 센서의 중앙에 있지만 여전히 자유롭게 회전할 수 있도록 인서트가 배치되었는지 확인하십시오.
   6. 놀람 응답 소프트웨어를 사용하여 프로토콜을 시작합니다.
   7. 프로토콜이 종료되면, 모든 동물을 음향 놀람 장치에서 이송 케이지로 옮긴다.
   8. 70% 에탄올로 내부 표면을 철저히 닦아 동물 보호구를 청소하십시오.
   9. 각 동물에 대한 모든 120dB(A) 놀람 자극에 대한 최대 속도 값까지의 시간을 평균화하여 진폭을 최고조로 놀라게 하는 대기 시간을 계산합니다.
   10. 프리펄스 억제 %를 계산합니다. 120dB(A) 놀람 자극, 놀람 없음, 75dB(A) 놀람 자극, 80db(A) 놀람 자극 및 85dB(A) 놀람 자극에 대한 평균 Vmax 값을 계산합니다. 120dB(A)에 대한 평균 Vmax에서 놀람 자극이 없는 경우 평균 Vmax를 빼서 순 평균 놀람 진폭을 계산합니다. 각 평균 사전 펄스 Vmax를 평균 120dB(A) Vmax로 나누고 1에서 해당 비율을 빼고 100을 곱하여 75dB(A), 80dB(A) 및 85dB(A) 사전 펄스 놀라움에 대한 % 사전 펄스 억제를 계산합니다. 75dB(A), 80dB(A) 및 85db(A) % 프리 펄스 억제의 평균을 구하여 평균 % 프리 펄스 억제를 계산합니다.
4. 홈 케이지 활동
   1. 동물의 움직임을 감지하는 수동 적외선 센서가 장착된 수정된 뚜껑이 있는 미세 격리 케이지에서 가정 케이지 활동을 수행합니다. 표준 물병을 스토퍼 시퍼가 장착된 50mL 원추형 튜브로 교체하여 모션 센서의 시야에서 케이지 바닥의 면적을 줄입니다. 모션 센서의 방해를 줄이기 위해 와이어 케이지 인서트에 제한된 양의 음식(50-75g)을 넣으십시오.
   2. 음향 놀람 반응 테스트 후 동물을 가정용 케이지 활동실로 운반합니다.
   3. 각 동물을 개조된 미세 절연체 케이지에 넣고 IR 센서가 움직임을 읽고 있는지 확인합니다. 와이어 케이지 상단과 뚜껑을 교체합니다.
   4. 분석 과정에서 매일 동물을 확인하여 각 동물이 음식과 물에 충분히 접근할 수 있는지 확인합니다.
   5. 동물을 가정용 케이지 활동 케이지에 3번의 라이트/다크 주기(72시간) 동안 수용합니다.
   6. 72시간이 지나면 녹음을 중지하고 집 우리에서 모든 동물을 제거합니다.
   7. 두 번째 및 세 번째 광 단계 동안의 총 활동 시합 수를 마지막 48시간 모니터링의 총 활동 시합 수로 나누어 % 광 위상 활성을 계산합니다.
5. 채점 및 포용
   1. 해당 코호트에서 해당 행동 테스트의 평균값을 뺀 다음 해당 코호트에서 해당 행동 테스트의 표준 편차로 나누어 각 동물에 대한 위험 평가 %, 매몰된 구슬 %, 평균 사전 펄스 억제 %, 최대 놀람 진폭까지의 대기 시간 및 % 광 위상 활동 판독에 대한 Z 값을 계산합니다.
   2. 각 행동 판독에 대해 PTSD와 가장 유사한 상위 20% 동물에게 점수를 줍니다. 가장 낮은 % 위험 평가, 가장 높은 % 매몰된 구슬, 가장 낮은 평균 % prepulse 억제, 가장 낮은 지연 시간 to peak 놀람 진폭, 가장 높은 % 광위상 활성을 보이는 동물의 상위 20%는 각각 3, 1, 2, 3 및 1점을 받습니다(표 1).
   3. 행동 테스트에서 각 동물이 받은 모든 점수를 추가하십시오. 5점 이상을 받은 동물을 PTSD 유사 동물로 지정하고, 0점을 받은 동물을 회복력 동물로 지정합니다.

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결과

우리는 동물들이 모든 코호트에 고르게 분포된 각 행동 테스트에서 PTSD와 유사한 행동을 보이는 것을 볼 수 있을 것으로 기대합니다. 한 코호트에 PTSD와 유사한 동물이 집중되어 있다는 것은 PTSD 유도 또는 행동 테스트 중에 도입된 인공물을 나타낼 수 있습니다. 각 행동 판독에서 점수를 받은 동물은 테스트된 모든 코호트에 균등하게 분포되어 있습니다(?...

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토론

PTSD는 복잡하고 이질적인 정신 질환입니다. 불행히도 현재 PTSD와 유사한 행동에 대한 신뢰할 수 있는 동물 모델은 없으며, PTSD와 유사한 행동의 유도를 위한 행동 패러다임은 PTSD와 유사한 행동 표현형을 보이는 동물을 생성하는 가장 신뢰할 수 있는 수단입니다. 여기에 설명된 패러다임은 PTSD와 유사한 행동을 촉진하기 위해 급성 외상을 사용하고 PTSD와 유사한 동물을 식?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid, glacial	Sigma Aldrich	AX0073
Benchtop Balance	Fisher Scientific	01-913-925
Clocklab Data Collection Suite	Actimetrics	-	Home cage activity cages
Deciblemeter
Ethovision XT14 Software	Noldus	-	Movement tracking software
Ethyl alcohol	Sigma Aldrich	443611
Light/Dark Box	Noldus	-	Light/dark transfer box
Lux Meter
Monochrome GigE Camera	Noldus	-	Requires Ceiling Mounting Hardware Available from Noldus
NIR Video Fear Conditioning Package for Mouse [Standard, USB]	Med Associates	MED-VFC2-USB-M	Fear conditioning equipment and chamber. Package includes all equipment needed to assay 1 animal at a time.
Spray Bottle	Thermo Scientific	BirA500
SR LAB Software	San Diego Instruments	-	Startle response software
SR LAB Startle Response Unit	San Diego Instruments	-	Acoustic startle unit
Video Fear Coniditioning "Video Freeze " Software	Med Associates	SOF-843	Fear conditioning software
White noise machine	Med Associates	ENV-230