将质粒DNA电穿孔到小鼠骨骼肌中

摘要

将质粒DNA电穿孔到骨骼肌中是一种在不损害小鼠肌肉收缩力的情况下调节基因表达的可行方法。

摘要

通过质粒电穿孔在小鼠骨骼肌中瞬时基因表达调节是评估正常和病理生理学的有用工具。靶基因的过表达或敲低使研究人员能够操纵单个分子事件，从而更好地了解影响肌肉质量，肌肉代谢和收缩力的机制。此外，编码荧光标签的DNA质粒的电穿孔使研究人员能够测量 体内骨骼肌中蛋白质亚细胞定位的变化。骨骼肌的关键功能评估包括肌肉收缩力的测量。在该协议中，我们证明在质粒DNA注射，电穿孔和基因表达调节后，整个肌肉收缩力研究仍然是可能的。该指导程序的目的是演示DNA质粒电穿孔到小鼠骨骼肌中的分步方法，以促进胫骨前伸肌肌的摄取和表达，以及证明骨骼肌收缩力不会受到注射和电穿孔的影响。

引言

体内骨骼肌质粒DNA电穿孔是通过调节各种生理和病理生理条件下的基因表达来评估骨骼肌生理学和分子信号传导变化的重要工具^1，2，^{3，4，5，6，7，8，9}.Wolff等人早在1990年就证明了向骨骼肌的实验性基因转移，其中RNA和DNA在没有电穿孔的情况下成功转移，并且荧光素酶表达维持至少2个月¹⁰。仅注射的转染效率相对较低是有问题的，爱原和宫崎骏在1998年通过将pCAGGS-IL-5构建体电穿孔到胫骨前肌中并测量血清IL-5表达¹¹来证明电穿孔增加了基因转移。从那时起，许多研究已经研究了不同DNA浓度，体积和电穿孔参数的功效，以确保最大的基因转移效率。Mir等人测试了不同的电穿孔参数，包括电压，脉冲数，脉冲持续时间和频率，....

研究方案

所有使用动物的实验都是在宾夕法尼亚州立大学医学院进行的，该学院由宾夕法尼亚州立大学的机构动物护理和使用委员会批准，并按照1964年赫尔辛基宣言及其后来的修正案中规定的道德标准进行。使用12周龄雌性C57BL / 6小鼠进行该程序。在实验之前，所有手术工具都经过高压灭菌以进行无菌。

1. TA和EDL注射/电穿孔制备

注意：对于 TA 和 EDL 注射/电穿孔制备，这些步骤是相同的。

1. 在实验前将表达质粒构建体纯化至在无菌PBS中稀释的1μg/ μL浓度。对于该过程，使用市售的无内毒素纯化试剂盒来纯化pcDNA3-EGFP（GFP）或pcDNA3空载体（对照）。
2. 计算质粒浓度以确保足够的注射体积（TA 50μg DNA在50μL无菌PBS中;EDL 10微克DNA在10微升无菌PBS）和等分试样中。
3. 通过使用选择轮并按下轮来编程电脉冲器设置以选择参数，如下所示：模式 - LV，电压 - 12.5 V / mm（在注射时进行调整），脉冲长度 - 20 ms，脉冲数 - 5，间隔 - 200 ms，极性 - 单极性。
4. 使用异氟醚气体麻醉小鼠。将小鼠置于含有5%异氟醚的诱导盒中。通过使用镊子没有脚趾捏反射来确认麻醉的手术平面，并将异氟醚降低至2%的维持剂量。将小鼠转移到适当的鼻锥中，在37°C的循环水板上停留，以进行其....

结果

电穿孔以促进骨骼肌中的基因转移是一种用于评估肌肉生理学变化的有用技术。我们已经展示了一个详细的分步程序，可以在TA和EDL肌肉中实现有效的基因转移。转染效率的差异是由许多变量引起的。这些变量包括电穿孔参数（脉冲，电压，脉冲持续时间等），基因构建体大小以及注入的DNA的浓度/体积。我们之前已经证明，5个脉冲在125 V/cm的电穿孔参数，20 ms持续时间间隔200 ms，足以在TA

讨论

通过电穿孔增强的骨骼肌体内基因转移是调节肌肉中蛋白质表达的有用且相对简单的工具。我们已经展示了在EDL和TA肌肉中实现有效基因转移所需的步骤，并证明EDL的收缩性测量在手术后是可行的。该技术不需要更复杂的病毒载体，并允许比较单个肌肉中转染和非转染的肌肉纤维横截面积。该程序的局限性在于构建摄取效率不完整，并且一些肌纤维仍未转染。

所讨论的.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Nylon suture (non-absorbable)	Ethicon	662G	Suture to close skin incision
50µl Hamilton syringe	Hamilton	80501	microsyringe
C57BLl/6NHsd mice	Envigo	044	12 week-old female mice used for experimentation
Caliper Electrode	BTX	45-0102	1.0cm x 1.0cm stainless steel
Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis	Aurora Scientific	605A	Software used for muscle contractility measurement and analysis
ECM 830 Electroporation System	BTX	45-0662	electroporator
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Plasmid purification kit
Extra Narrow Scissors	Fine Science Tools	14088-10	Scissors for blunt dissection
Force Transducer	Aurora Scientific	407A	To measure force from EDL
Micro-Masquito Hemastats	Fine Science Tools	13010-12	Hemastats for surturing
pcDNA3.1 mammalian expression vector	Fisher Scientific	V79020	Control Vector
pcDNA3-EGFP expression plasmid	Addgene	13031	Plasmid for GFP expression
Semken curved forceps	Fine Science Tools	11009-13	Forceps for surgery
Surgical blades stainless steel no. 10	Becton Dickinson	37 1210	Scalpel blades
Tissue-Tek O.C.T. media	VWR	25608-930	Freezing media for histology
Wheat Germ Agglutinin- Texas Red	Thermo-Fisher Scientific	W21405	Membrane staining for muscle cross section