Электропорация плазмидной ДНК в скелетные мышцы мыши

Резюме

Электропорация плазмидной ДНК в скелетные мышцы является жизнеспособным методом модуляции экспрессии генов без ущерба для сократимости мышц у мышей.

Аннотация

Транзиторная модуляция экспрессии генов в мышиных скелетных мышцах путем плазмидной электропорации является полезным инструментом для оценки нормальной и патологической физиологии. Сверхэкспрессия или нокдаун генов-мишеней позволяет исследователям манипулировать отдельными молекулярными событиями и, таким образом, лучше понимать механизмы, которые влияют на мышечную массу, мышечный метаболизм и сократимость. Кроме того, электропорация плазмид ДНК, которые кодируют флуоресцентные метки, позволяет исследователям измерять изменения субклеточной локализации белков в скелетных мышцах in vivo. Ключевая функциональная оценка скелетных мышц включает измерение сократимости мышц. В этом протоколе мы демонстрируем, что исследования сократимости целых мышц все еще возможны после инъекции плазмидной ДНК, электропорации и модуляции экспрессии генов. Целью этой учебной процедуры является демонстрация пошагового метода плазмидной электропорации ДНК в скелетные мышцы мыши для облегчения поглощения и экспрессии в миофибрах передней и разгибательной мышц большеберцовой кости, а также демонстрация того, что сократимость скелетных мышц не нарушается инъекцией и электропорацией.

Введение

Электропорация плазмидной ДНК в скелетные мышцы in vivo является важным инструментом для оценки изменений в физиологии скелетных мышц и молекулярной сигнализации путем модуляции экспрессии генов в различных физиологических и патофизиологических условиях 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Экспериментальный перенос генов в скелетные мышцы был продемонстрирован еще в 1990 году Wolff et al., где как РНК, так и ДНК были успешно перенесены без электропорации, а экспрессия люциферазы поддерживалась в течение не менее 2 месяцев¹⁰. Относительно низкая эффективность трансфекции только при инъекции проблематична, и Айхара и Миядзаки продемонстрировали повышенный перенос генов с электропорацией в 1998 году путем электропорации конструкции pCAGGS-IL-5 в переднюю мышцу большеберцовой кости (TA) и измерения экспрессии IL-5 сыворотки¹¹. С тех пор во многих исследованиях изучалась эффективность различных концентраций ДНК, объемов и параметров электропорации для обеспечения максимальной эффективности переноса генов. Mir et al. проверили различные параметры электропорации, включая напряжение, число импульсов, продолжительность и частоту импульса, а также концентрацию ДНК, и определили, что большее напряжение, число импульсов и концентрация ДНК способствовали увеличению эффективности электропорации¹². Основным предостережением к высокому электропорационному напряжению является то, что, хотя оно способствует увеличению поглощения ДНК миофибрами, оно также вызывает повреждение мышц, что может сбить с толку результаты. Schertzer et al. показали, что электропорация при 200 В вызывала повреждение примерно у 50% миофибров через 3 дня после электропорации, тогда как только 10% миофибров были повреждены при 50 В¹³. Мы приняли во внимание переменные, влияющие на эффективный перенос ДНК по сравнению с повреждением мышц, и обнаружили, что напряжение 125 В на сантиметр ширины суппорта достаточно для достижения эффективного переноса генов.

Анализ площади поперечного сечения мышечного волокна и сократимости всей мышцы после электропорации является важным аспектом метода измерения изменений размера и функции мышц из-за модуляции генов. Мы и другие ранее продемонстрировали, что электропорация контрольных векторов сама по себе не вызывает уменьшения площади миофибры. Конструкция зеленого флуоресцентного белка (EGFP) была полезным флуоресцентным индикатором трансфекции ДНК в этих исследованиях^13,14. Ряд исследований исследовали сократимость ТА in situ после электропорации и обнаружили различные результаты. Одно исследование показало, что электропорация 75 В/см вызвала около 30% снижения тетановой силы через 3 дня после электропорации, а через 7 дней после электропорации тетаническая сила вернулась к контрольному уровню, в то время как электропорация 50 В/см не ставила под угрозу силу^13,15. Другое исследование показало, что была 30% потеря тетанической силы через 3 ч после электропорации 180 В / см, которая восстановилась до фиктивных уровней силы через 7 дней¹⁶.

В следующей подробной процедуре мы демонстрируем инъекцию и электропорацию плазмиды PCDNA3-EGFP в мышцах ТА и разгибателя digitorum longus (EDL) мышей. Мы также демонстрируем, что этот метод не влияет на сократимость всей мышцы EDL. Цель состоит в том, чтобы продемонстрировать эффективное поглощение плазмид в миофибрах, не вызывая потери функции.

протокол

Все эксперименты с использованием животных проводились в Медицинском колледже штата Пенсильвания, одобрены Комитетом по институциональным уходу и использованию животных Университета штата Пенсильвания и проводились в соответствии с этическими стандартами, изложенными в Хельсинкской декларации 1964 года и последующих поправках к ней. Для этой процедуры использовались 12-недельные самки мышей C57BL/6. Все хирургические инструменты были автоклавированы для стерильности перед экспериментами.

1. Препарат для инъекций/электропорации ТА и ЭДЛ

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти этапы идентичны для приготовления инъекций/электропорации ТА и ЭДЛ.

1. Плазмиды очищения экспрессии до концентрации 1 мкг/мкл, разбавленной в стерильном PBS до начала эксперимента. Для этой процедуры использовался коммерчески доступный набор для очистки без эндотоксинов для очистки пустого вектора pcDNA3-EGFP (GFP) или pcDNA3 (контроль).
2. Рассчитать концентрацию плазмиды для обеспечения адекватного объема инъекции (ТА 50 мкг ДНК в 50 мкл стерильного PBS; EDL 10 мкг ДНК в 10 мкл стерильных PBS) и аликвотные образцы.
3. Запрограммируйте настройки электропоратора с помощью выбранного колеса и нажатием на колесо для выбора параметров следующим образом: Режим - НН, Напряжение - 12,5 В/мм (регулируется в момент впрыска), длина импульса - 20 мс, количество импульсов - 5, интервал - 200 мс, полярность - униполярная.
4. Обезболивайте мышей, используя газ изофлуран. Поместите мышей в индукционную коробку с 5% изофлураном. Подтверждают хирургическую плоскость анестезии отсутствием рефлекса защемления пальца ноги с помощью щипцов и снижают изофлуран до 2% поддерживающей дозы. Переведите мышей в соответствующий носовой конус, опирающийся на пластину циркулирующей воды при 37 °C для остальной части процедуры.
5. Удалите волосы с обеих задних конечностей с помощью небольших машинок для резания волос. Очистите нижние конечности чередованием 70% этанола / бетадина для дезинфекции области инъекции.

2. Впрыск ТА/электропорация

1. Когда мышь находится в положении лежа, найдите сухожилие TA, видимое через кожу на боковой стороне голени. Используя микрошприц объемом 50 мкл со съемной иглой 30 Г, вставьте иглу на 1-2 мм выше миотендинозного соединения под небольшим углом 5°, пока игла не достигнет верхнего конца мышцы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция в середину мышцы является целью.
2. Медленно нажмите на плунжер, медленно втягивая иглу вдоль пути инъекции, чтобы доставить 50 мкл плазмидного раствора. Мышца должна набухать.
3. Установите таймер на 1 мин и измерьте толщину ножки на ТА. В зависимости от размера мыши это может быть от 5-10 мм. Установите электроды суппорта на измеряемую толщину и установите напряжение электропоратора на 12,5 В/мм.
4. Через 1 мин поместите электроды суппорта вокруг нижней конечности. Электроды должны быть плотными, но не чрезмерно плотными. Подайте 5 импульсов квадратной волны с длительностью 20 мс и интервалами 200 мс (мышца должна дергаться с каждым импульсом).
5. Повторите с альтернативной конечностью, используя контрольный вектор.
6. Выньте мышь из наркоза и дайте ей восстановиться на грелке, установленной на 37 °C. После выздоровления верните мышь в клетку.

3. Впрыск/электропорация EDL

1. Когда мышь находится в положении лежа, найдите передний гребень большеберцовой кости визуально и с помощью мягкой пальпации.
   1. С помощью скальпеля делают неглубокий разрез через кожу на боковой стороне переднего гребня большеберцовой кости на 5 мм ниже колена на 2 мм выше миотендинозного соединения ТА.
   2. С помощью небольших ножниц тупое рассечение фасции, обнажая мышцу ТА.
   3. Опять же, используя тупое рассечение ножницами, отделите мышцу ТА от большеберцовой кости осторожно, потянув мышцу сбоку, обнажив EDL. Небольшие, изогнутые щипцы могут быть использованы для поддержания ТА чистым от EDL во время процедуры.
2. Используя микрошприц объемом 50 мкл со съемной иглой 30 г, вставьте иглу в EDL продольно, пока игла не достигнет верхнего конца мышцы.
3. Медленно нажмите на плунжер, медленно втягивая иглу вдоль пути инъекции, чтобы ввести 10 мкл плазмидного раствора (мышца должна набухать).
4. Установите таймер на 1 мин и измерьте толщину ножки на EDL. В зависимости от размера мыши это может быть от 5-10 мм. Установите электроды суппорта на измеряемую толщину и установите напряжение электропоратора на 12,5 В/мм.
5. Через 1 мин поместите электроды суппорта вокруг нижней конечности. Электроды должны быть плотными, но не чрезмерно плотными. Подайте 5 импульсов квадратной волны с длительностью 20 мс и интервалами 200 мс (мышцы должны дергаться с каждым импульсом).
6. Закройте разрез одноразовыми нерассасывающимися нейлоновыми швами 4/0.
7. Повторите с альтернативной конечностью или оставьте конечность нетронутой в качестве абсолютного контроля.
8. Выньте мышь из наркоза и дайте ей восстановиться на грелке, установленной на 37 °C. Вводят соответствующий подкожный анальгетик сразу после операции и через 12-24 ч после операции. После выздоровления верните мышь в клетку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предыдущие исследования показали дефицит сократимости мышц в ТА сразу после электропорации и то, что сократительное восстановление происходит в течение 3 дней^13,15. По этой причине анализ мышц ТА и ЭДЛ на гистологию, экспрессию белка или сократимость мышц проводится через 3-10 дней после электропорации. Длительная экспрессия EGFP наблюдалась до 3 недель после процедуры¹³.

Результаты

Электропорация для облегчения переноса генов в скелетных мышцах является полезным методом, используемым для оценки изменений в физиологии мышц. Мы продемонстрировали подробную, пошаговую процедуру для достижения эффективного переноса генов как в мышцах ТА, так и в мышцах EDL. Различия ...

Обсуждение

Перенос генов in vivo в скелетных мышцах, усиленный электропорацией, является полезным и относительно простым инструментом для модуляции экспрессии белка в мышцах. Мы показали шаги, необходимые для достижения эффективного переноса генов в мышцах EDL и TA, и продемонстрировали, что изме...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Nylon suture (non-absorbable)	Ethicon	662G	Suture to close skin incision
50µl Hamilton syringe	Hamilton	80501	microsyringe
C57BLl/6NHsd mice	Envigo	044	12 week-old female mice used for experimentation
Caliper Electrode	BTX	45-0102	1.0cm x 1.0cm stainless steel
Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis	Aurora Scientific	605A	Software used for muscle contractility measurement and analysis
ECM 830 Electroporation System	BTX	45-0662	electroporator
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Plasmid purification kit
Extra Narrow Scissors	Fine Science Tools	14088-10	Scissors for blunt dissection
Force Transducer	Aurora Scientific	407A	To measure force from EDL
Micro-Masquito Hemastats	Fine Science Tools	13010-12	Hemastats for surturing
pcDNA3.1 mammalian expression vector	Fisher Scientific	V79020	Control Vector
pcDNA3-EGFP expression plasmid	Addgene	13031	Plasmid for GFP expression
Semken curved forceps	Fine Science Tools	11009-13	Forceps for surgery
Surgical blades stainless steel no. 10	Becton Dickinson	37 1210	Scalpel blades
Tissue-Tek O.C.T. media	VWR	25608-930	Freezing media for histology
Wheat Germ Agglutinin- Texas Red	Thermo-Fisher Scientific	W21405	Membrane staining for muscle cross section