Eletroporação do DNA plasmídeo no músculo esquelético do rato

Resumo

A eletroporação do DNA plasmídeo no músculo esquelético é um método viável para modular a expressão genética sem comprometer a contratilidade muscular em camundongos.

Resumo

A modulação da expressão genética transitória no músculo esquelético murino por eletroporação plasmida é uma ferramenta útil para avaliar a fisiologia normal e patológica. A superexpressão ou derrubada de genes-alvo permite aos pesquisadores manipular eventos moleculares individuais e, assim, entender melhor os mecanismos que afetam a massa muscular, o metabolismo muscular e a contralidade. Além disso, a eletroporação de plasmídeos de DNA que codificam etiquetas fluorescentes permite aos pesquisadores medir mudanças na localização subcelular de proteínas no músculo esquelético in vivo. Uma avaliação funcional chave do músculo esquelético inclui a medição da contralução muscular. Neste protocolo, demonstramos que estudos de contratude muscular ainda são possíveis após injeção de DNA plasmid, eletroporação e modulação da expressão genética. O objetivo deste procedimento instrucional é demonstrar o método passo-a-passo da eletroporação plasmóide de DNA no músculo esquelético do camundongo para facilitar a absorção e a expressão nos miofibers dos músculos tibialis anterior e extensor digitorum longus, bem como demonstrar que a contratilação muscular esquelética não está comprometida pela injeção e eletroporação.

Introdução

A eletroporação de DNA plasmídeo no músculo esquelético in vivo é uma ferramenta importante para avaliar alterações na fisiologia muscular esquelética e na sinalização molecular, modulando a expressão genética em uma variedade de condições fisiológicas e fisiofisiológicas 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . A transferência genética experimental para o músculo esquelético foi demonstrada já em 1990 por Wolff et al., onde tanto o RNA quanto o DNA foram transferidos com sucesso sem eletroporação, e a expressão da luciferase foi mantida por pelo menos 2 meses^{e 10}. A eficiência relativamente baixa de transfecção com injeção é apenas problemática, e Aihara e Miyazaki demonstraram aumento da transferência genética com eletroporação em 1998, eletroporando uma construção pCAGGS-IL-5 no músculo tibialis anterior (TA) e medindo a expressão sérica IL-5¹¹. Desde então, muitos estudos têm investigado a eficácia de diferentes concentrações de DNA, volumes e parâmetros de eletroporação para garantir a eficiência máxima da transferência genética. Mir et al. testaram diferentes parâmetros de eletroporação, incluindo tensão, número de pulso, duração do pulso e frequência, bem como concentração de DNA, e determinaram que maior tensão, número de pulso e concentração de DNA contribuíram para o aumento da eficiência da eletroporação¹². Uma grande ressalva à alta tensão eletroporação é que, embora facilite o aumento da absorção de DNA em miofibers, também causa danos musculares, o que pode confundir resultados. Schertzer et al. mostraram que a eletroporação a 200 V causou danos em cerca de 50% dos myofibers 3 dias após a eletroporação, enquanto apenas 10% dos myofibers foram danificados em 50 V¹³. Levamos em consideração as variáveis que afetam a transferência eficiente de DNA versus dano muscular e descobrimos que uma tensão de 125 V por centímetro de largura de pinça é suficiente para realizar uma transferência genética eficaz.

A análise da área transversal da fibra muscular e da contralidade muscular inteira após a eletroporação são aspectos importantes do método para medir mudanças no tamanho e função muscular devido à modulação genética. Nós e outros já demonstramos anteriormente que a eletroporação de vetores de controle por si só não causa uma diminuição na área de miofibra. A construção da proteína fluorescente verde (EGFP) foi um indicador fluorescente útil da transfecção de DNA nestes estudos^13,14. Vários estudos investigaram a contração in situ do TA após a eletroporação e encontraram resultados variados. Um estudo mostrou que a eletroporação de 75 V/cm causou uma redução de cerca de 30% na força tetanica 3 dias após a eletroporação, e em 7 dias após a eletroporação, a força tetanica voltou ao nível de controle, enquanto a eletroporação de 50 V/cm não comprometeu a força^13,15. Outro estudo mostrou que houve uma perda de 30% da força tetanica 3h após a eletroporação de 180 V/cm, que se recuperou para os níveis de força falsa após 7 dias¹⁶.

No procedimento detalhado a seguir, demonstramos injeção e eletroporação de um plasmídeo pcDNA3-EGFP nos músculos TA e extensor digitorum longus (EDL) de camundongos. Também demonstramos que este método não afeta a contratude muscular total edl. O objetivo é demonstrar uma absorção plasmida eficiente em myofibers sem causar perda de função.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados no Penn State College of Medicine, aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Penn State University, e realizados de acordo com os padrões éticos estabelecidos na Declaração de Helsinque de 1964 e suas alterações posteriores. Foram utilizados camundongos C57BL/6 fêmeas de 12 semanas de idade para este procedimento. Todas as ferramentas cirúrgicas foram autoclavadas para esterilidade antes da experimentação.

1. Preparação de injeção/eletroporação ta e EDL

NOTA: Estes passos são idênticos para a preparação de injeção/eletroporação TA e EDL.

1. Purificar construções plasmídeos de expressão a uma concentração de 1 μg/μL diluída em PBS estéril antes do experimento. Para este procedimento, foi utilizado um kit de purificação comercialmente disponível sem endotoxinas para purificar o vetor vazio pcDNA3-EGFP (GFP) ou o pcDNA3 vazio (controle).
2. Calcule a concentração plasmida para garantir o volume adequado de injeção (TA 50 μg de DNA em 50 μL de PBS estéril; EDL 10 μg de DNA em 10 μL de PBS estéril) e amostras de alíquota.
3. Programe as configurações do eletroporador utilizando a roda selecionada e deprimindo a roda para escolher os parâmetros da seguinte forma: Modo - LV, Tensão - 12,5 V/mm (a ser ajustado no momento da injeção), comprimento do pulso - 20 ms, número de pulsos - 5, intervalo - 200 ms, polaridade - unipolar.
4. Anestesiar os ratos usando gás isoflurane. Coloque os ratos em uma caixa de indução com 5% de isoflurane. Confirme o plano cirúrgico da anestesia pela ausência do reflexo do dedo do pé usando fórceps e reduza a isoflurane para 2% de dose de manutenção. Transfira os ratos para um cone de nariz apropriado descansando em uma placa de água circulante a 37 °C para o resto do procedimento.
5. Remova o cabelo de ambos os traseiros usando pequenos cortadores de cabelo. Esfregue os membros inferiores com 70% de etanol/betadina alternados para higienizar a área de injeção.

2. Injeção/eletroporação de TA

1. Com o rato em posição supina, localize o tendão ta visível através da pele no lado lateral da perna inferior. Utilizando uma microeringa de 50 μL com uma agulha destacável de 30 G, insira a agulha 1-2 mm superior à junção miotendinous em um ângulo raso de 5° até que a agulha atinja a extremidade superior do músculo.
   NOTA: A injeção no meio do músculo é o objetivo.
2. Deprimir lentamente o êmbolo enquanto retrai lentamente a agulha ao longo do caminho da injeção para fornecer 50 μL de solução plasmida. O músculo deve inchar.
3. Coloque o temporizador por 1 min e meça a espessura da perna no TA. Dependendo do tamanho do mouse, isso pode ser de 5 a 10 mm. Coloque os eletrodos de pinça na espessura medida e coloque a tensão eletroporante em 12,5 V/mm.
4. Depois de 1 min, coloque os eletrodos de pinça ao redor do membro inferior. Os eletrodos devem ser aconchegantes, mas não muito apertados. Entregue 5 pulsos de ondas quadradas, com 20 ms de duração e intervalos de 200 ms (o músculo deve se contrair com cada pulso).
5. Repita com o membro alternativo usando o vetor de controle.
6. Remova o mouse da anestesia e deixe que ele se recupere em uma almofada de aquecimento a 37 °C. Uma vez recuperado, devolva o rato para sua gaiola.

3. Injeção/eletroporação de EDL

1. Com o rato em uma posição supina, localize a crista anterior do osso da tíbia visualmente e através de uma palpação suave.
   1. Usando um bisturi, faça uma incisão rasa através da pele no lado lateral da crista anterior da tíbia 5 mm inferior ao joelho até 2 mm superior à junção miotendinous TA.
   2. Usando uma tesoura pequena, disseque a fáscia, expondo o músculo TA.
   3. Novamente, usando dissecção sem corte com tesoura, separe o músculo TA da tíbia suavemente puxando o músculo lateralmente, expondo o EDL. Fórceps pequenos e curvos podem ser usados para manter o TA afastado do EDL durante o procedimento.
2. Usando uma micro-seringa de 50 μL com uma agulha destacável de 30 G, insira a agulha no EDL longitudinalmente até que a agulha atinja a extremidade superior do músculo.
3. Deprimir lentamente o êmbolo enquanto retrai lentamente a agulha ao longo do caminho da injeção para injetar 10 μL da solução plasmida (o músculo deve inchar).
4. Defina um temporizador por 1 min e meça a espessura da perna no EDL. Dependendo do tamanho do mouse, isso pode ser de 5 a 10 mm. Coloque os eletrodos de pinça na espessura medida e coloque a tensão eletroporante em 12,5 V/mm.
5. Depois de 1 min, coloque os eletrodos de pinça ao redor do membro inferior. Os eletrodos devem ser aconchegantes, mas não muito apertados. Entregue 5 pulsos de ondas quadradas, com 20 ms de duração e intervalos de 200 ms (o músculo deve se contrair com cada pulso).
6. Feche a incisão usando suturas descartáveis de nylon 4/0 não absorvíveis.
7. Repita com o membro alternativo ou deixe o membro intocado como controle absoluto.
8. Remova o mouse da anestesia e deixe que ele se recupere em uma almofada de aquecimento a 37 °C. Administre um analgésico subcutâneo apropriado imediatamente após a cirurgia e 12-24 h após a cirurgia. Uma vez recuperado, devolva o rato para sua gaiola.
   NOTA: Estudos anteriores mostraram um déficit de contratilidade muscular no TS imediatamente após a eletroporação e que a recuperação contratil ocorre ao longo de 3 dias ^13,15. Por essa razão, a análise dos músculos TA e EDL para histologia, expressão proteica ou contralidade muscular é realizada de 3 a 10 dias após a eletroporação. A expressão prolongada de EGFP foi observada até 3 semanas após o procedimento¹³.

Resultados

A eletroporação para facilitar a transferência genética no músculo esquelético é uma técnica útil usada para avaliar alterações na fisiologia muscular. Demonstramos um procedimento detalhado passo a passo para realizar uma transferência genética eficiente nos músculos TA e EDL. As diferenças na eficiência da transfecção ocorrem devido a uma série de variáveis. Entre essas variáveis estão parâmetros de eletroporação (pulsos, tensão, duração do pulso, etc.), tamanho da construção genética e c...

Discussão

A transferência genética in vivo no músculo esquelético reforçada pela eletroporação é uma ferramenta útil e relativamente simples para modular a expressão proteica no músculo. Mostramos as etapas necessárias para alcançar uma transferência genética eficiente nos músculos EDL e TA e demonstramos que a medição da contratilidade do EDL é viável após o procedimento. Esta técnica não requer vetores virais mais complicados e permite a comparação de fibras transfeinadas e não transfectadas tr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Nylon suture (non-absorbable)	Ethicon	662G	Suture to close skin incision
50µl Hamilton syringe	Hamilton	80501	microsyringe
C57BLl/6NHsd mice	Envigo	044	12 week-old female mice used for experimentation
Caliper Electrode	BTX	45-0102	1.0cm x 1.0cm stainless steel
Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis	Aurora Scientific	605A	Software used for muscle contractility measurement and analysis
ECM 830 Electroporation System	BTX	45-0662	electroporator
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Plasmid purification kit
Extra Narrow Scissors	Fine Science Tools	14088-10	Scissors for blunt dissection
Force Transducer	Aurora Scientific	407A	To measure force from EDL
Micro-Masquito Hemastats	Fine Science Tools	13010-12	Hemastats for surturing
pcDNA3.1 mammalian expression vector	Fisher Scientific	V79020	Control Vector
pcDNA3-EGFP expression plasmid	Addgene	13031	Plasmid for GFP expression
Semken curved forceps	Fine Science Tools	11009-13	Forceps for surgery
Surgical blades stainless steel no. 10	Becton Dickinson	37 1210	Scalpel blades
Tissue-Tek O.C.T. media	VWR	25608-930	Freezing media for histology
Wheat Germ Agglutinin- Texas Red	Thermo-Fisher Scientific	W21405	Membrane staining for muscle cross section