Électroporation de l’ADN plasmidique dans le muscle squelettique de la souris

Résumé

L’électroporation de l’ADN plasmidique dans le muscle squelettique est une méthode viable pour moduler l’expression des gènes sans compromettre la contractilité musculaire chez la souris.

Résumé

La modulation transitoire de l’expression génique dans le muscle squelettique murin par électroporation plasmidique est un outil utile pour évaluer la physiologie normale et pathologique. La surexpression ou l’élimination des gènes cibles permet aux chercheurs de manipuler des événements moléculaires individuels et, par conséquent, de mieux comprendre les mécanismes qui ont un impact sur la masse musculaire, le métabolisme musculaire et la contractilité. De plus, l’électroporation des plasmides d’ADN qui codent des étiquettes fluorescentes permet aux chercheurs de mesurer les changements dans la localisation subcellulaire des protéines dans le muscle squelettique in vivo. Une évaluation fonctionnelle clé du muscle squelettique comprend la mesure de la contractilité musculaire. Dans ce protocole, nous démontrons que les études de contractilité musculaire entière sont encore possibles après l’injection d’ADN plasmidique, l’électroporation et la modulation de l’expression génique. L’objectif de cette procédure pédagogique est de démontrer la méthode étape par étape de l’électroporation du plasmide d’ADN dans le muscle squelettique de la souris pour faciliter l’absorption et l’expression dans les myofibres des muscles tibialis antérieur et extenseur digitorum longus, ainsi que de démontrer que la contractilité des muscles squelettiques n’est pas compromise par l’injection et l’électroporation.

Introduction

L’électroporation de l’ADN plasmidique dans le muscle squelettique in vivo est un outil important pour évaluer les changements dans la physiologie des muscles squelettiques et la signalisation moléculaire en modulant l’expression des gènes dans diverses conditions physiologiques et physiopathologiques ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9} . Le transfert expérimental de gènes dans le muscle squelettique a été démontré dès 1990 par Wolff et al., où l’ARN et l’ADN ont été transférés avec succès sans électroporation, et l’expression de la luciférase a été maintenue pendant au moins 2 mois¹⁰. L’efficacité de transfection relativement faible avec injection seulement est problématique, et Aihara et Miyazaki ont démontré une augmentation du transfert de gènes avec l’électroporation en 1998 en électroporatant une construction pCAGGS-IL-5 dans le muscle tibialis antérieur (TA) et en mesurant l’expression sérique de l’IL-5¹¹. Depuis lors, de nombreuses études ont étudié l’efficacité de différentes concentrations d’ADN, volumes et paramètres d’électroporation pour assurer une efficacité maximale du transfert de gènes. Mir et al. ont testé différents paramètres d’électroporation, y compris la tension, le nombre d’impulsions, la durée et la fréquence des impulsions, ainsi que la concentration d’ADN, et ont déterminé qu’une tension, un nombre d’impulsions et une concentration d’ADN plus élevés contribuaient tous à une efficacité accrue de l’électroporation¹². Une mise en garde majeure à la tension d’électroporation élevée est que, bien qu’elle facilite l’absorption accrue de l’ADN dans les myofibres, elle provoque également des dommages musculaires, ce qui peut confondre les résultats. Schertzer et al. ont montré que l’électroporation à 200 V causait des dommages dans environ 50% des myofibres 3 jours après l’électroporation, alors que seulement 10% des myofibres étaient endommagés à 50 V¹³. Nous avons pris en considération les variables affectant le transfert efficace de l’ADN par rapport aux dommages musculaires et avons constaté qu’une tension de 125 V par centimètre de largeur d’étrier est suffisante pour réaliser un transfert de gène efficace.

L’analyse de la section transversale des fibres musculaires et de la contractilité musculaire entière après électroporation sont des aspects importants de la méthode de mesure des changements de taille et de fonction musculaires dus à la modulation des gènes. Nous et d’autres avons déjà démontré que l’électroporation des vecteurs de contrôle seule ne provoque pas une diminution de la zone myofibre. La construction de la protéine fluorescente verte (EGFP) était un indicateur fluorescent utile de la transfection de l’ADN dans ces études^13,14. Un certain nombre d’études ont étudié la contractilité in situ de l’AT après électroporation et ont trouvé des résultats variables. Une étude a montré que l’électroporation de 75 V / cm entraînait une réduction d’environ 30% de la force tétanique 3 jours après l’électroporation, et 7 jours après l’électroporation, la force tétanique était revenue au niveau de contrôle, tandis que l’électroporation de 50 V / cm ne compromettait pas la force^13,15. Une autre étude a montré qu’il y avait une perte de 30% de la force tétanique 3 h après une électroporation de 180 V / cm, qui a retrouvé les niveaux de force simulée après 7 jours¹⁶.

Dans la procédure détaillée suivante, nous démontrons l’injection et l’électroporation d’un plasmide pcDNA3-EGFP dans les muscles TA et extenseur digitorum longus (EDL) de souris. Nous démontrons également que cette méthode n’affecte pas la contractilité musculaire entière de l’EDL. L’objectif est de démontrer une absorption efficace des plasmides dans les myofibres sans entraîner de perte de fonction.

Protocole

Toutes les expériences utilisant des animaux ont été réalisées au Penn State College of Medicine, approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université d’État de Pennsylvanie, et réalisées conformément aux normes éthiques établies dans la Déclaration d’Helsinki de 1964 et ses amendements ultérieurs. Des souris femelles C57BL/6 âgées de 12 semaines ont été utilisées pour cette procédure. Tous les outils chirurgicaux ont été autoclavés pour la stérilité avant l’expérimentation.

1. Préparation d’injection/électroporation TA et EDL

REMARQUE: Ces étapes sont identiques pour la préparation d’injection / électroporation TA et EDL.

1. Purifier les constructions plasmidiques d’expression à une concentration de 1 μg/μL diluée dans du PBS stérile avant l’expérience. Pour cette procédure, un kit de purification sans endotoxine disponible dans le commerce a été utilisé pour purifier le vecteur vide pcDNA3-EGFP (GFP) ou pcDNA3 (témoin).
2. Calculer la concentration en plasmides pour assurer un volume d’injection adéquat (TA 50 μg d’ADN dans 50 μL de PBS stérile; EDL 10 μg d’ADN dans 10 μL de PBS stérile) et des échantillons aliquotes.
3. Programmez les réglages de l’électroporateur en utilisant la roue de sélection et en appuyant sur la roue pour choisir les paramètres comme suit: Mode - BT, Tension - 12,5 V / mm (à ajuster au moment de l’injection), longueur d’impulsion - 20 ms, nombre d’impulsions - 5, intervalle - 200 ms, polarité - unipolaire.
4. Anesthésier les souris à l’aide de gaz isoflurane. Placez les souris dans une boîte à induction contenant 5% d’isoflurane. Confirmer le plan chirurgical de l’anesthésie par l’absence du réflexe de pincement de l’orteil à l’aide de pinces et réduire l’isoflurane à 2% de dose d’entretien. Transférer les souris dans un cône de nez approprié reposant sur une plaque d’eau circulante à 37 ° C pour le reste de la procédure.
5. Enlevez les poils des deux membres postérieurs à l’aide de petites tondeuses à cheveux. Frottez les membres inférieurs avec une alternance de 70% d’éthanol / bétadine pour assainir la zone d’injection.

2. Injection/électroporation d’AT

1. Avec la souris en position couchée, localisez le tendon TA visible à travers la peau sur le côté latéral de la jambe. À l’aide d’une micro-seringue de 50 μL avec une aiguille détachable de 30 G, insérez l’aiguille de 1 à 2 mm au-dessus de la jonction myoténdineuse à un angle peu profond de 5 ° jusqu’à ce que l’aiguille atteigne l’extrémité supérieure du muscle.
   REMARQUE: L’injection au milieu du muscle est l’objectif.
2. Appuyez lentement sur le piston tout en rétractant lentement l’aiguille le long du chemin d’injection pour délivrer 50 μL de solution plasmidique. Le muscle devrait gonfler.
3. Réglez la minuterie pendant 1 min et mesurez l’épaisseur de la jambe au niveau de l’AT. Selon la taille de la souris, cela peut aller de 5 à 10 mm. Réglez les électrodes de l’étrier sur l’épaisseur mesurée et réglez la tension de l’électroporateur sur 12,5 V/mm.
4. Après 1 min, placez les électrodes de l’étrier autour du membre inférieur. Les électrodes doivent être bien ajustées mais pas trop serrées. Délivrer 5 impulsions d’ondes carrées, avec une durée de 20 ms et des intervalles de 200 ms (le muscle doit se contracter à chaque impulsion).
5. Répétez l’opération avec l’autre membre à l’aide du vecteur témoin.
6. Retirez la souris de l’anesthésie et laissez-la récupérer sur un coussin chauffant réglé à 37 °C. Une fois récupérée, retournez la souris dans sa cage.

3. Injection/électroporation EDL

1. Avec la souris en décubitus dorsal, localisez la crête antérieure de l’os du tibia visuellement et par palpation douce.
   1. À l’aide d’un scalpel, faites une incision peu profonde à travers la peau du côté latéral de la crête antérieure du tibia de 5 mm inférieure au genou à 2 mm supérieure à la jonction myoténdineuse TA.
   2. À l’aide de petits ciseaux, disséquez le fascia émoussé, exposant le muscle TA.
   3. Encore une fois, en utilisant une dissection émoussée avec des ciseaux, séparez doucement le muscle TA du tibia en tirant le muscle latéralement, exposant l’EDL. De petites pinces incurvées peuvent être utilisées pour garder l’AT à l’écart de l’EDL pendant la procédure.
2. À l’aide d’une micro-seringue de 50 μL avec une aiguille détachable de 30 G, insérez l’aiguille dans l’EDL longitudinalement jusqu’à ce que l’aiguille atteigne l’extrémité supérieure du muscle.
3. Appuyez lentement sur le piston tout en rétractant lentement l’aiguille le long du chemin d’injection pour injecter 10 μL de la solution plasmidique (le muscle doit gonfler).
4. Réglez une minuterie pendant 1 min et mesurez l’épaisseur de la jambe à l’EDL. Selon la taille de la souris, cela peut aller de 5 à 10 mm. Réglez les électrodes de l’étrier sur l’épaisseur mesurée et réglez la tension de l’électroporateur sur 12,5 V/mm.
5. Après 1 min, placez les électrodes de l’étrier autour du membre inférieur. Les électrodes doivent être bien ajustées mais pas trop serrées. Délivrer 5 impulsions d’ondes carrées, d’une durée de 20 ms et d’intervalles de 200 ms (le muscle doit se contracter à chaque impulsion).
6. Fermez l’incision à l’aide de sutures en nylon jetables 4/0 non résorbables.
7. Répétez avec le membre alternatif ou laissez le membre intact comme contrôle absolu.
8. Retirez la souris de l’anesthésie et laissez-la récupérer sur un coussin chauffant réglé à 37 °C. Administrer un analgésique sous-cutané approprié immédiatement après la chirurgie et 12-24 h après la chirurgie. Une fois récupérée, retournez la souris dans sa cage.
   NOTE: Des études antérieures ont montré un déficit de contractilité musculaire dans l’AT immédiatement après l’électroporation et que la récupération contractile se produit au cours de 3 jours^13,15. Pour cette raison, l’analyse des muscles TA et EDL pour l’histologie, l’expression des protéines ou la contractilité musculaire est effectuée 3 à 10 jours après l’électroporation. Une expression prolongée de l’EGFP a été observée jusqu’à 3 semaines après la procédure¹³.

Résultats

L’électroporation pour faciliter le transfert de gènes dans le muscle squelettique est une technique utile utilisée pour évaluer les changements dans la physiologie musculaire. Nous avons démontré une procédure détaillée, étape par étape, pour réaliser un transfert efficace de gènes dans les muscles TA et EDL. Les différences dans l’efficacité de la transfection se produisent en raison d’un certain nombre de variables. Parmi ces variables figurent les paramètres d’électroporation (impulsions, ten...

Discussion

Le transfert de gènes in vivo dans le muscle squelettique amélioré par électroporation est un outil utile et relativement simple pour moduler l’expression des protéines dans le muscle. Nous avons montré les étapes nécessaires pour obtenir un transfert efficace de gènes dans les muscles EDL et TA et démontré que la mesure de la contractilité de l’EDL est viable après la procédure. Cette technique ne nécessite pas de vecteurs viraux plus compliqués et permet de comparer la section transversale ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Nylon suture (non-absorbable)	Ethicon	662G	Suture to close skin incision
50µl Hamilton syringe	Hamilton	80501	microsyringe
C57BLl/6NHsd mice	Envigo	044	12 week-old female mice used for experimentation
Caliper Electrode	BTX	45-0102	1.0cm x 1.0cm stainless steel
Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis	Aurora Scientific	605A	Software used for muscle contractility measurement and analysis
ECM 830 Electroporation System	BTX	45-0662	electroporator
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Plasmid purification kit
Extra Narrow Scissors	Fine Science Tools	14088-10	Scissors for blunt dissection
Force Transducer	Aurora Scientific	407A	To measure force from EDL
Micro-Masquito Hemastats	Fine Science Tools	13010-12	Hemastats for surturing
pcDNA3.1 mammalian expression vector	Fisher Scientific	V79020	Control Vector
pcDNA3-EGFP expression plasmid	Addgene	13031	Plasmid for GFP expression
Semken curved forceps	Fine Science Tools	11009-13	Forceps for surgery
Surgical blades stainless steel no. 10	Becton Dickinson	37 1210	Scalpel blades
Tissue-Tek O.C.T. media	VWR	25608-930	Freezing media for histology
Wheat Germ Agglutinin- Texas Red	Thermo-Fisher Scientific	W21405	Membrane staining for muscle cross section