Électroporation de l’ADN plasmidique dans le muscle squelettique de la souris

Résumé

L’électroporation de l’ADN plasmidique dans le muscle squelettique est une méthode viable pour moduler l’expression des gènes sans compromettre la contractilité musculaire chez la souris.

Résumé

La modulation transitoire de l’expression génique dans le muscle squelettique murin par électroporation plasmidique est un outil utile pour évaluer la physiologie normale et pathologique. La surexpression ou l’élimination des gènes cibles permet aux chercheurs de manipuler des événements moléculaires individuels et, par conséquent, de mieux comprendre les mécanismes qui ont un impact sur la masse musculaire, le métabolisme musculaire et la contractilité. De plus, l’électroporation des plasmides d’ADN qui codent des étiquettes fluorescentes permet aux chercheurs de mesurer les changements dans la localisation subcellulaire des protéines dans le muscle squelettique in vivo. Une évaluation fonctionnelle clé du muscle squelettique comprend la mesure de la contractilité musculaire. Dans ce protocole, nous démontrons que les études de contractilité musculaire entière sont encore possibles après l’injection d’ADN plasmidique, l’électroporation et la modulation de l’expression génique. L’objectif de cette procédure pédagogique est de démontrer la méthode étape par étape de l’électroporation du plasmide d’ADN dans le muscle squelettique de la souris pour faciliter l’absorption et l’expression dans les myofibres des muscles tibialis antérieur et extenseur digitorum longus, ainsi que de démontrer que la contractilité des muscles squelettiques n’est pas compromise par l’injection et l’électroporation.

Introduction

L’électroporation de l’ADN plasmidique dans le muscle squelettique in vivo est un outil important pour évaluer les changements dans la physiologie des muscles squelettiques et la signalisation moléculaire en modulant l’expression des gènes dans diverses conditions physiologiques et physiopathologiques ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9} . Le transfert expérimental de gènes dans ....

Protocole

Toutes les expériences utilisant des animaux ont été réalisées au Penn State College of Medicine, approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université d’État de Pennsylvanie, et réalisées conformément aux normes éthiques établies dans la Déclaration d’Helsinki de 1964 et ses amendements ultérieurs. Des souris femelles C57BL/6 âgées de 12 semaines ont été utilisées pour cette procédure. Tous les outils chirurgicaux ont été autoclavés pour la stérilité avant l’expérimentation.

1. Préparation d’injection/électroporation TA et EDL

REMARQUE: Ces étapes sont ident....

Résultats

L’électroporation pour faciliter le transfert de gènes dans le muscle squelettique est une technique utile utilisée pour évaluer les changements dans la physiologie musculaire. Nous avons démontré une procédure détaillée, étape par étape, pour réaliser un transfert efficace de gènes dans les muscles TA et EDL. Les différences dans l’efficacité de la transfection se produisent en raison d’un certain nombre de variables. Parmi ces variables figurent les paramètres d’électroporation (impulsions, ten.......

Discussion

Le transfert de gènes in vivo dans le muscle squelettique amélioré par électroporation est un outil utile et relativement simple pour moduler l’expression des protéines dans le muscle. Nous avons montré les étapes nécessaires pour obtenir un transfert efficace de gènes dans les muscles EDL et TA et démontré que la mesure de la contractilité de l’EDL est viable après la procédure. Cette technique ne nécessite pas de vecteurs viraux plus compliqués et permet de comparer la section transversale .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Nylon suture (non-absorbable)	Ethicon	662G	Suture to close skin incision
50µl Hamilton syringe	Hamilton	80501	microsyringe
C57BLl/6NHsd mice	Envigo	044	12 week-old female mice used for experimentation
Caliper Electrode	BTX	45-0102	1.0cm x 1.0cm stainless steel
Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis	Aurora Scientific	605A	Software used for muscle contractility measurement and analysis
ECM 830 Electroporation System	BTX	45-0662	electroporator
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Plasmid purification kit
Extra Narrow Scissors	Fine Science Tools	14088-10	Scissors for blunt dissection
Force Transducer	Aurora Scientific	407A	To measure force from EDL
Micro-Masquito Hemastats	Fine Science Tools	13010-12	Hemastats for surturing
pcDNA3.1 mammalian expression vector	Fisher Scientific	V79020	Control Vector
pcDNA3-EGFP expression plasmid	Addgene	13031	Plasmid for GFP expression
Semken curved forceps	Fine Science Tools	11009-13	Forceps for surgery
Surgical blades stainless steel no. 10	Becton Dickinson	37 1210	Scalpel blades
Tissue-Tek O.C.T. media	VWR	25608-930	Freezing media for histology
Wheat Germ Agglutinin- Texas Red	Thermo-Fisher Scientific	W21405	Membrane staining for muscle cross section