Electroporación del ADN plásmido en el músculo esquelético del ratón

Resumen

La electroporación del ADN plásmido en el músculo esquelético es un método viable para modular la expresión génica sin comprometer la contractilidad muscular en ratones.

Resumen

La modulación transitoria de la expresión génica en el músculo esquelético murino por electroporación de plásmidos es una herramienta útil para evaluar la fisiología normal y patológica. La sobreexpresión o derribo de genes diana permite a los investigadores manipular eventos moleculares individuales y, por lo tanto, comprender mejor los mecanismos que afectan la masa muscular, el metabolismo muscular y la contractilidad. Además, la electroporación de plásmidos de ADN que codifican etiquetas fluorescentes permite a los investigadores medir los cambios en la localización subcelular de proteínas en el músculo esquelético in vivo. Una evaluación funcional clave del músculo esquelético incluye la medición de la contractilidad muscular. En este protocolo, demostramos que los estudios de contractilidad muscular completa aún son posibles después de la inyección de ADN plásmido, la electroporación y la modulación de la expresión génica. El objetivo de este procedimiento de instrucción es demostrar el método paso a paso de electroporación de plásmidos de ADN en el músculo esquelético del ratón para facilitar la absorción y expresión en las miofiberes de los músculos tibial anterior y extensor digitorum longus, así como demostrar que la contractilidad del músculo esquelético no se ve comprometida por la inyección y la electroporación.

Introducción

La electroporación del ADN plásmido en el músculo esquelético in vivo es una herramienta importante para evaluar los cambios en la fisiología del músculo esquelético y la señalización molecular mediante la modulación de la expresión génica en una variedad de condiciones fisiológicas y fisiopatológicas ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9} . La transferencia experimental de genes al músculo esquelético fue demostrada ya en 1990 por Wolff et al., donde tanto el ARN como el ADN se transfirieron con éxito sin electroporación, y la expresión de luciferasa se mantuvo durante al menos 2 meses¹⁰. La eficiencia de transfección relativamente baja con solo inyección es problemática, y Aihara y Miyazaki demostraron una mayor transferencia de genes con electroporación en 1998 al electroporar una construcción de pCAGGS-IL-5 en el músculo tibial anterior (TA) y medir la expresión sérica de IL-5¹¹. Desde entonces, muchos estudios han investigado la eficacia de diferentes concentraciones de ADN, volúmenes y parámetros de electroporación para garantizar la máxima eficiencia de transferencia de genes. Mir et al. probaron diferentes parámetros de electroporación, incluyendo voltaje, número de pulso, duración del pulso y frecuencia, así como la concentración de ADN, y determinaron que un mayor voltaje, número de pulso y concentración de ADN contribuyeron a aumentar la eficiencia de la electroporación¹². Una advertencia importante para el alto voltaje de electroporación es que, si bien facilita una mayor absorción de ADN en las miofiberes, también causa daño muscular, lo que puede confundir los resultados. Schertzer et al. demostraron que la electroporación a 200 V causó daño en alrededor del 50% de las miofiberes 3 días después de la electroporación, mientras que solo el 10% de las miofiberes se dañaron a 50 V¹³. Hemos tenido en cuenta las variables que afectan la transferencia eficiente de ADN frente al daño muscular y hemos encontrado que un voltaje de 125 V por centímetro de ancho de pinza es suficiente para lograr una transferencia genética efectiva.

El análisis del área transversal de la fibra muscular y la contractilidad de todo el músculo después de la electroporación son aspectos importantes del método para medir los cambios en el tamaño y la función muscular debido a la modulación génica. Nosotros y otros hemos demostrado previamente que la electroporación de vectores de control por sí sola no causa una disminución en el área de miofibra. El constructo de proteína verde fluorescente (EGFP) fue un indicador fluorescente útil de la transfección de ADN en estos estudios^13,14. Varios estudios han investigado la contractilidad in situ de la AT después de la electroporación y han encontrado resultados variables. Un estudio mostró que la electroporación de 75 V / cm causó una reducción de aproximadamente el 30% en la fuerza tetánica 3 días después de la electroporación, y a los 7 días posteriores a la electroporación, la fuerza tetánica volvió al nivel de control, mientras que la electroporación de 50 V / cm no comprometió la fuerza^13,15. Otro estudio mostró que hubo una pérdida del 30% de la fuerza tetánica 3 h después de la electroporación de 180 V / cm, que se recuperó a los niveles de fuerza simulada después de 7 días¹⁶.

En el siguiente procedimiento detallado, demostramos la inyección y electroporación de un plásmido pcDNA3-EGFP en los músculos TA y extensor digitorum longus (EDL) de ratones. También demostramos que este método no afecta la contractilidad de todo el músculo EDL. El objetivo es demostrar una absorción eficiente de plásmidos en las miofibras sin causar pérdida de función.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron en la Facultad de Medicina de Penn State, aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Penn, y se realizaron de acuerdo con los estándares éticos establecidos en la Declaración de Helsinki de 1964 y sus enmiendas posteriores. Se utilizaron ratones C57BL/6 hembra de 12 semanas de edad para este procedimiento. Todas las herramientas quirúrgicas fueron esterilizadas en autoclave para la esterilidad antes de la experimentación.

1. Preparación de inyección/electroporación de TA y EDL

NOTA: Estos pasos son idénticos para la preparación de inyección/electroporación de TA y EDL.

1. El plásmido de expresión purificada se construye a una concentración de 1 μg/μL diluido en PBS estéril antes del experimento. Para este procedimiento, se utilizó un kit de purificación libre de endotoxinas disponible en el mercado para purificar el vector vacío pcDNA3-EGFP (GFP) o pcDNA3 (control).
2. Calcular la concentración de plásmidos para asegurar un volumen de inyección adecuado (TA 50 μg de ADN en 50 μL de PBS estéril; EDL 10 μg de ADN en 10 μL de PBS estéril) y muestras alícuotas.
3. Programe la configuración del electroporador utilizando la rueda de selección y presionando la rueda para elegir los parámetros de la siguiente manera: Modo - LV, Voltaje - 12.5 V / mm (que se ajustará en el momento de la inyección), longitud del pulso - 20 ms, número de pulsos - 5, intervalo - 200 ms, polaridad - unipolar.
4. Anestesiar a los ratones usando gas isoflurano. Coloque los ratones en una caja de inducción con 5% de isoflurano. Confirmar el plano quirúrgico de la anestesia por la ausencia del reflejo de pellizco del dedo del pie utilizando fórceps y reducir el isoflurano al 2% de la dosis de mantenimiento. Transfiera los ratones a un cono nasal apropiado que descanse sobre una placa de agua circulante a 37 ° C durante el resto del procedimiento.
5. Retire el vello de ambas extremidades posteriores con pequeños cortapelos. Frote las extremidades inferiores con etanol / betadina alterna al 70% para desinfectar el área de inyección.

2. Inyección/electroporación de TA

1. Con el ratón en posición supina, localice el tendón TA visible a través de la piel en el lado lateral de la parte inferior de la pierna. Usando una microjeringuaria de 50 μL con una aguja desmontable de 30 G, inserte la aguja 1-2 mm superior a la unión miotendinosa en un ángulo poco profundo de 5 ° hasta que la aguja alcance el extremo superior del músculo.
   NOTA: La inyección en el centro del músculo es el objetivo.
2. Presione lentamente el émbolo mientras retrae lentamente la aguja a lo largo de la ruta de inyección para administrar 50 μL de solución de plásmido. El músculo debe hincharse.
3. Ajuste el temporizador durante 1 minuto y mida el grosor de la pierna en el TA. Dependiendo del tamaño del mouse, esto puede ser de 5-10 mm. Ajuste los electrodos de la pinza al grosor medido y ajuste el voltaje del electroporador a 12.5 V / mm.
4. Después de 1 min, coloque los electrodos de la pinza alrededor de la extremidad inferior. Los electrodos deben estar ajustados pero no demasiado apretados. Entregue 5 pulsos de onda cuadrada, con una duración de 20 ms e intervalos de 200 ms (el músculo debe contraerse con cada pulso).
5. Repetir con la extremidad alternativa utilizando el vector de control.
6. Retire el ratón de la anestesia y deje que se recupere en una almohadilla térmica a 37 °C. Una vez recuperado, devuelva el ratón a su jaula.

3. Inyección/electroporación de EDL

1. Con el ratón en posición supina, localice la cresta anterior del hueso de la tibia visualmente y a través de una palpación suave.
   1. Usando un bisturí, haga una incisión poco profunda a través de la piel en el lado lateral de la cresta anterior de la tibia 5 mm inferior a la rodilla a 2 mm superior a la unión miotendinosa TA.
   2. Usando tijeras pequeñas, diseccionar la fascia con romo, exponiendo el músculo TA.
   3. Una vez más, usando la disección contundente con tijeras, separe el músculo TA de la tibia suavemente tirando del músculo lateralmente, exponiendo el EDL. Se pueden usar fórceps pequeños y curvos para mantener la TA libre del EDL durante el procedimiento.
2. Usando una microjeringuaria de 50 μL con una aguja desmontable de 30 G, inserte la aguja en el EDL longitudinalmente hasta que la aguja llegue al extremo superior del músculo.
3. Presione lentamente el émbolo mientras retrae lentamente la aguja a lo largo de la ruta de inyección para inyectar 10 μL de la solución de plásmido (el músculo debe hincharse).
4. Ajuste un temporizador durante 1 minuto y mida el grosor de la pierna en el EDL. Dependiendo del tamaño del mouse, esto puede ser de 5-10 mm. Ajuste los electrodos de la pinza al grosor medido y ajuste el voltaje del electroporador a 12.5 V / mm.
5. Después de 1 min, coloque los electrodos de la pinza alrededor de la extremidad inferior. Los electrodos deben estar ajustados pero no demasiado apretados. Entregue 5 pulsos de onda cuadrada, con una duración de 20 ms e intervalos de 200 ms (el músculo debe contraerse con cada pulso).
6. Cierre la incisión con suturas de nylon desechables 4/0 no absorbibles.
7. Repita con la extremidad alternativa o deje la extremidad intacta como control absoluto.
8. Retire el ratón de la anestesia y deje que se recupere en una almohadilla térmica a 37 °C. Administrar un analgésico subcutáneo apropiado inmediatamente después de la cirugía y 12-24 h después de la cirugía. Una vez recuperado, devuelva el ratón a su jaula.
   NOTA: Estudios previos han demostrado un déficit de contractilidad muscular en la AT inmediatamente después de la electroporación y que la recuperación contráctil ocurre en el transcurso de 3 días^13,15. Por esta razón, el análisis de los músculos TA y EDL para histología, expresión de proteínas o contractilidad muscular se realiza de 3 a 10 días después de la electroporación. Se ha observado una expresión prolongada de EGFP hasta 3 semanas después del procedimiento¹³.

Resultados

La electroporación para facilitar la transferencia de genes en el músculo esquelético es una técnica útil utilizada para evaluar los cambios en la fisiología muscular. Hemos demostrado un procedimiento detallado paso a paso para lograr una transferencia de genes eficiente tanto en los músculos TA como en los EDL. Las diferencias en la eficiencia de la transfección se producen debido a una serie de variables. Entre estas variables se encuentran los parámetros de electroporación (pulsos, voltaje, duración del pu...

Discusión

La transferencia de genes in vivo en el músculo esquelético mejorada por electroporación es una herramienta útil y relativamente simple para modular la expresión de proteínas en el músculo. Hemos demostrado los pasos necesarios para lograr una transferencia de genes eficiente en los músculos EDL y TA y hemos demostrado que la medición de la contractilidad del EDL es viable después del procedimiento. Esta técnica no requiere vectores virales más complicados y permite la comparación del área transver...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Nylon suture (non-absorbable)	Ethicon	662G	Suture to close skin incision
50µl Hamilton syringe	Hamilton	80501	microsyringe
C57BLl/6NHsd mice	Envigo	044	12 week-old female mice used for experimentation
Caliper Electrode	BTX	45-0102	1.0cm x 1.0cm stainless steel
Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis	Aurora Scientific	605A	Software used for muscle contractility measurement and analysis
ECM 830 Electroporation System	BTX	45-0662	electroporator
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Plasmid purification kit
Extra Narrow Scissors	Fine Science Tools	14088-10	Scissors for blunt dissection
Force Transducer	Aurora Scientific	407A	To measure force from EDL
Micro-Masquito Hemastats	Fine Science Tools	13010-12	Hemastats for surturing
pcDNA3.1 mammalian expression vector	Fisher Scientific	V79020	Control Vector
pcDNA3-EGFP expression plasmid	Addgene	13031	Plasmid for GFP expression
Semken curved forceps	Fine Science Tools	11009-13	Forceps for surgery
Surgical blades stainless steel no. 10	Becton Dickinson	37 1210	Scalpel blades
Tissue-Tek O.C.T. media	VWR	25608-930	Freezing media for histology
Wheat Germ Agglutinin- Texas Red	Thermo-Fisher Scientific	W21405	Membrane staining for muscle cross section