Elettroporazione del DNA plasmidico nel muscolo scheletrico del topo

Riepilogo

L'elettroporazione del DNA plasmidico nel muscolo scheletrico è un metodo praticabile per modulare l'espressione genica senza compromettere la contrattilità muscolare nei topi.

Abstract

La modulazione transitoria dell'espressione genica nel muscolo scheletrico murino mediante elettroporazione plasmidica è uno strumento utile per valutare la fisiologia normale e patologica. La sovraespressione o l'abbattimento dei geni bersaglio consente ai ricercatori di manipolare singoli eventi molecolari e, quindi, comprendere meglio i meccanismi che influenzano la massa muscolare, il metabolismo muscolare e la contrattilità. Inoltre, l'elettroporazione dei plasmidi del DNA che codificano i tag fluorescenti consente ai ricercatori di misurare i cambiamenti nella localizzazione subcellulare delle proteine nel muscolo scheletrico in vivo. Una valutazione funzionale chiave del muscolo scheletrico include la misurazione della contrattilità muscolare. In questo protocollo, dimostriamo che gli studi di contrattilità dell'intero muscolo sono ancora possibili dopo l'iniezione di DNA plasmidico, l'elettroporazione e la modulazione dell'espressione genica. L'obiettivo di questa procedura didattica è dimostrare il metodo passo-passo dell'elettroporazione del plasmide del DNA nel muscolo scheletrico del topo per facilitare l'assorbimento e l'espressione nelle miofibre dei muscoli tibiale anteriore ed estensore digitorum longus, nonché dimostrare che la contrattilità del muscolo scheletrico non è compromessa dall'iniezione e dall'elettroporazione.

Introduzione

L'elettroporazione del DNA plasmidico nel muscolo scheletrico in vivo è uno strumento importante per valutare i cambiamenti nella fisiologia del muscolo scheletrico e nella segnalazione molecolare modulando l'espressione genica in una varietà di condizioni fisiologiche e fisiopatologiche 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Il trasferimento genico sperimentale nel muscolo scheletrico è stato dimostrato già nel 1990 da Wolff et al., dove sia l'RNA che il DNA sono stati trasferiti con successo senza elettroporazione e l'espressione della luciferasi è stata mantenuta per almeno 2 mesi¹⁰. L'efficienza di trasfezione relativamente bassa con la sola iniezione è problematica, e Aihara e Miyazaki hanno dimostrato un aumento del trasferimento genico con l'elettroporazione nel 1998 elettroporando un costrutto pCAGGS-IL-5 nel muscolo tibiale anteriore (TA) e misurando l'espressione sierica di IL-5¹¹. Da quel momento, molti studi hanno studiato l'efficacia di diverse concentrazioni di DNA, volumi e parametri di elettroporazione per garantire la massima efficienza di trasferimento genico. Mir et al. hanno testato diversi parametri di elettroporazione, tra cui tensione, numero di impulsi, durata e frequenza dell'impulso, nonché concentrazione di DNA, e hanno determinato che una maggiore tensione, numero di impulsi e concentrazione di DNA hanno contribuito ad aumentare l'efficienza dell'elettroporazione¹². Un avvertimento importante per l'alta tensione di elettroporazione è che, mentre facilita l'aumento dell'assorbimento del DNA nelle miofibre, provoca anche danni muscolari, che possono confondere i risultati. Schertzer et al. hanno dimostrato che l'elettroporazione a 200 V ha causato danni in circa il 50% delle miofibre 3 giorni dopo l'elettroporazione, mentre solo il 10% delle miofibre è stato danneggiato a 50 V¹³. Abbiamo preso in considerazione le variabili che influenzano il trasferimento efficiente del DNA rispetto al danno muscolare e abbiamo scoperto che una tensione di 125 V per centimetro di larghezza della pinza è sufficiente per realizzare un efficace trasferimento genico.

L'analisi dell'area della sezione trasversale delle fibre muscolari e la contrattilità dell'intero muscolo dopo l'elettroporazione sono aspetti importanti del metodo per misurare i cambiamenti nelle dimensioni e nella funzione muscolare dovuti alla modulazione genica. Noi e altri abbiamo precedentemente dimostrato che l'elettroporazione dei vettori di controllo da sola non causa una diminuzione dell'area della miofibra. Il costrutto della proteina fluorescente verde (EGFP) è stato un utile indicatore fluorescente della trasfezione del DNA in questi studi^13,14. Numerosi studi hanno studiato la contrattilità in situ del TA dopo elettroporazione e hanno trovato risultati variabili. Uno studio ha dimostrato che l'elettroporazione a 75 V / cm ha causato una riduzione di circa il 30% della forza tetanica 3 giorni dopo l'elettroporazione, e da 7 giorni dopo l'elettroporazione, la forza tetanica è tornata al livello di controllo, mentre l'elettroporazione a 50 V / cm non ha compromesso la forza^13,15. Un altro studio ha dimostrato che c'è stata una perdita del 30% di forza tetanica 3 ore dopo 180 V / cm di elettroporazione, che è tornata ai livelli di forza fittizia dopo 7 giorni¹⁶.

Nella seguente procedura dettagliata, dimostriamo l'iniezione e l'elettroporazione di un plasmide pcDNA3-EGFP nei muscoli TA ed estensore digitorum longus (EDL) dei topi. Dimostriamo anche che questo metodo non influisce sulla contrattilità del muscolo intero EDL. L'obiettivo è dimostrare un efficace assorbimento del plasmide nelle miofibre senza causare perdita di funzione.

Protocollo

Tutti gli esperimenti che utilizzano animali sono stati eseguiti presso il Penn State College of Medicine, approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Penn State University, ed eseguiti in conformità con gli standard etici stabiliti nella Dichiarazione di Helsinki del 1964 e nei suoi successivi emendamenti. Per questa procedura sono stati utilizzati topi C57BL/6 di 12 settimane. Tutti gli strumenti chirurgici sono stati autoclavati per la sterilità prima della sperimentazione.

1. Preparazione per iniezione/elettroporazione TA ed EDL

NOTA: questi passaggi sono identici per la preparazione all'iniezione/elettroporazione TA ed EDL.

1. Purificare i costrutti plasmidici di espressione ad una concentrazione di 1 μg/μL diluito in PBS sterile prima dell'esperimento. Per questa procedura, è stato utilizzato un kit di purificazione privo di endotossine disponibile in commercio per purificare il vettore vuoto pcDNA3-EGFP (GFP) o pcDNA3 (controllo).
2. Calcolare la concentrazione del plasmide per garantire un adeguato volume di iniezione (TA 50 μg di DNA in 50 μL di PBS sterile; EDL 10 μg di DNA in 10 μL di PBS sterile) e campioni di aliquota.
3. Programmare le impostazioni dell'elettroporatore utilizzando la ruota di selezione e premendo la ruota per scegliere i parametri come segue: Modalità - LV, Tensione - 12,5 V / mm (da regolare al momento dell'iniezione), lunghezza dell'impulso - 20 ms, numero di impulsi - 5, intervallo - 200 ms, polarità - unipolare.
4. Anestetizzare i topi usando gas isoflurano. Posizionare i topi in una scatola di induzione con il 5% di isoflurano. Confermare il piano chirurgico dell'anestesia con l'assenza del riflesso del pizzico della punta usando una pinza e ridurre l'isoflurano alla dose di mantenimento del 2%. Trasferire i topi in un cono nasale appropriato appoggiato su una piastra d'acqua circolante a 37 °C per il resto della procedura.
5. Rimuovere i peli da entrambi gli arti posteriori usando piccoli tagliacapelli. Strofinare gli arti inferiori con alternanza 70% etanolo/betadina per sanificare l'area di iniezione.

2. Iniezione/elettroporazione TA

1. Con il mouse in posizione supina, individuare il tendine TA visibile attraverso la pelle sul lato laterale della parte inferiore della gamba. Utilizzando una microsiringa da 50 μL con un ago staccabile da 30 G, inserire l'ago 1-2 mm superiore alla giunzione miotendinea con un angolo di 5° poco profondo fino a quando l'ago raggiunge l'estremità superiore del muscolo.
   NOTA: l'iniezione nel mezzo del muscolo è l'obiettivo.
2. Premere lentamente lo stantuffo mentre si ritrae lentamente l'ago lungo il percorso di iniezione per erogare 50 μL di soluzione plasmidica. Il muscolo dovrebbe gonfiarsi.
3. Impostare il timer per 1 minuto e misurare lo spessore della gamba al TA. A seconda delle dimensioni del mouse, questo può essere da 5-10 mm. Impostare gli elettrodi della pinza sullo spessore misurato e impostare la tensione dell'elettroporatore su 12,5 V/mm.
4. Dopo 1 minuto, posizionare gli elettrodi della pinza attorno all'arto inferiore. Gli elettrodi devono essere aderenti ma non eccessivamente stretti. Erogare 5 impulsi a onda quadra, con una durata di 20 ms e intervalli di 200 ms (il muscolo dovrebbe contrarsi ad ogni impulso).
5. Ripetete con l'arto alternativo utilizzando il vettore di controllo.
6. Rimuovere il mouse dall'anestesia e lasciarlo recuperare su una piastra riscaldante impostata a 37 °C. Una volta recuperato, riporta il mouse nella sua gabbia.

3. Iniezione/elettroporazione EDL

1. Con il mouse in posizione supina, individuare la cresta anteriore dell'osso della tibia visivamente e attraverso una delicata palpazione.
   1. Usando un bisturi, fare un'incisione superficiale attraverso la pelle sul lato laterale della cresta anteriore della tibia 5 mm inferiore al ginocchio a 2 mm superiore alla giunzione miotendinea TA.
   2. Usando piccole forbici, smussare la fascia, esponendo il muscolo TA.
   3. Ancora una volta, usando la dissezione smussata con le forbici, separare delicatamente il muscolo TA dalla tibia tirando il muscolo lateralmente, esponendo l'EDL. Piccole pinze curve possono essere utilizzate per mantenere l'AT libero dall'EDL durante la procedura.
2. Utilizzando una microsiringa da 50 μL con un ago staccabile da 30 G, inserire l'ago nell'EDL longitudinalmente fino a quando l'ago raggiunge l'estremità superiore del muscolo.
3. Premere lentamente lo stantuffo mentre si ritrae lentamente l'ago lungo il percorso di iniezione per iniettare 10 μL della soluzione plasmidica (il muscolo dovrebbe gonfiarsi).
4. Impostare un timer per 1 minuto e misurare lo spessore della gamba all'EDL. A seconda delle dimensioni del mouse, questo può essere da 5-10 mm. Impostare gli elettrodi della pinza sullo spessore misurato e impostare la tensione dell'elettroporatore su 12,5 V/mm.
5. Dopo 1 minuto, posizionare gli elettrodi della pinza attorno all'arto inferiore. Gli elettrodi devono essere aderenti ma non eccessivamente stretti. Erogare 5 impulsi a onda quadra, con una durata di 20 ms e intervalli di 200 ms (il muscolo dovrebbe contrarsi ad ogni impulso).
6. Chiudere l'incisione utilizzando suture di nylon monouso 4/0 non assorbibili.
7. Ripeti con l'arto alternativo o lascia l'arto intatto come controllo assoluto.
8. Rimuovere il mouse dall'anestesia e lasciarlo recuperare su una piastra riscaldante impostata a 37 °C. Somministrare un analgesico sottocutaneo appropriato immediatamente dopo l'intervento chirurgico e 12-24 ore dopo l'intervento chirurgico. Una volta recuperato, riporta il mouse nella sua gabbia.
   NOTA: Studi precedenti hanno dimostrato un deficit di contrattilità muscolare nel TA immediatamente dopo l'elettroporazione e che il recupero contrattile avviene nel corso di 3 giorni^13,15. Per questo motivo, l'analisi dei muscoli TA ed EDL per l'istologia, l'espressione proteica o la contrattilità muscolare viene condotta 3-10 giorni dopo l'elettroporazione. L'espressione prolungata di EGFP è stata osservata fino a 3 settimane dopo la procedura¹³.

Risultati

L'elettroporazione per facilitare il trasferimento genico nel muscolo scheletrico è una tecnica utile utilizzata per valutare i cambiamenti nella fisiologia muscolare. Abbiamo dimostrato una procedura dettagliata e passo-passo per realizzare un trasferimento genico efficiente sia nei muscoli TA che EDL. Le differenze nell'efficienza di trasfezione si verificano a causa di una serie di variabili. Tra queste variabili ci sono i parametri di elettroporazione (impulsi, tensione, durata dell'impulso, ecc.), La dimensione del...

Discussione

Il trasferimento genico in vivo nel muscolo scheletrico potenziato dall'elettroporazione è uno strumento utile e relativamente semplice per modulare l'espressione proteica nel muscolo. Abbiamo mostrato i passaggi necessari per ottenere un trasferimento genico efficiente nei muscoli EDL e TA e dimostrato che la misurazione della contrattilità dell'EDL è praticabile seguendo la procedura. Questa tecnica non richiede vettori virali più complicati e consente il confronto trasfettato e non trasfettato dell'area d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Nylon suture (non-absorbable)	Ethicon	662G	Suture to close skin incision
50µl Hamilton syringe	Hamilton	80501	microsyringe
C57BLl/6NHsd mice	Envigo	044	12 week-old female mice used for experimentation
Caliper Electrode	BTX	45-0102	1.0cm x 1.0cm stainless steel
Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis	Aurora Scientific	605A	Software used for muscle contractility measurement and analysis
ECM 830 Electroporation System	BTX	45-0662	electroporator
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Plasmid purification kit
Extra Narrow Scissors	Fine Science Tools	14088-10	Scissors for blunt dissection
Force Transducer	Aurora Scientific	407A	To measure force from EDL
Micro-Masquito Hemastats	Fine Science Tools	13010-12	Hemastats for surturing
pcDNA3.1 mammalian expression vector	Fisher Scientific	V79020	Control Vector
pcDNA3-EGFP expression plasmid	Addgene	13031	Plasmid for GFP expression
Semken curved forceps	Fine Science Tools	11009-13	Forceps for surgery
Surgical blades stainless steel no. 10	Becton Dickinson	37 1210	Scalpel blades
Tissue-Tek O.C.T. media	VWR	25608-930	Freezing media for histology
Wheat Germ Agglutinin- Texas Red	Thermo-Fisher Scientific	W21405	Membrane staining for muscle cross section