플라스미드 DNA를 마우스 골격근으로 전기천공

요약

플라스미드 DNA를 골격근으로 전기천공하는 것은 마우스의 근육 수축성을 손상시키지 않으면서 유전자 발현을 조절하는 실행 가능한 방법이다.

초록

플라스미드 전기천공에 의한 뮤린 골격근에서의 일시적 유전자 발현 조절은 정상 및 병리학적 생리학을 평가하는데 유용한 도구이다. 표적 유전자의 과발현 또는 녹다운을 통해 조사자는 개별 분자 사건을 조작할 수 있으며, 따라서 근육 질량, 근육 대사 및 수축성에 영향을 미치는 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있습니다. 또한, 형광 태그를 인코딩하는 DNA 플라스미드의 전기천공은 조사자가 생체 내에서 골격근에서 단백질의 세포내 국소화의 변화를 측정할 수 있게 한다. 골격근의 주요 기능 평가에는 근육 수축성의 측정이 포함됩니다. 이 프로토콜에서, 우리는 플라스미드 DNA 주입, 전기천공 및 유전자 발현 조절 후에도 전체 근육 수축성 연구가 여전히 가능하다는 것을 입증한다. 이 교육 절차의 목표는 경골 전방 및 신근 디지토럼 롱 근육의 근섬유에서 흡수 및 발현을 촉진하기 위해 마우스 골격근으로 DNA 플라스미드 전기 천공의 단계별 방법을 시연하고 골격근 수축성이 주입 및 전기 천공에 의해 손상되지 않는다는 것을 입증하는 것입니다.

서문

생체 내에서 골격근으로의 플라스미드 DNA 전기천공은 다양한 생리학적 및 병리생리학적 조건에서 유전자 발현을 조절함으로써 골격근 생리학 및 분자 신호전달의 변화를 평가하기 위한 중요한 도구이다 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . 골격근으로의 실험적 유전자 전달은 Wolff et al.에 의해 1990 년 초에 입증되었으며, RNA와 DNA는 모두 전기 천공없이 성공적으로 전달되었으며 루시퍼라제 발현은 적어도 2 개월 동안¹⁰ 년 동안 유지되었습니다. 주사만으로 비교적 낮은 형질감염 효율은 문제가 있으며, 아이하라와 미야자키는 1998년 pCAGGS-IL-5 구축물을 경골 전방(TA) 근육으로 전기천공하고 혈청 IL-5 발현¹¹을 측정함으로써 전기천공을 통한 유전자 전달 증가를 입증했다. 그 이후로 많은 연구가 최대의 유전자 전달 효율을 보장하기 위해 다양한 DNA 농도, 부피 및 전기 천공 매개 변수의 효능을 조사했습니다. Mir et al.은 DNA 농도뿐만 아니라 전압, 펄스 수, 펄스 지속 시간 및 주파수를 포함한 다양한 전기 천공 매개 변수를 테스트하고 더 큰 전압, 펄스 수 및 DNA 농도가 모두 전기 천공 효율 증가에 기여한다는 것을 확인했습니다¹². 높은 전기 천공 전압에 대한 주요 경고는 근섬유로의 DNA 흡수 증가를 촉진하지만 근육 손상을 일으켜 결과를 혼란스럽게 할 수 있다는 것입니다. Schertzer et al. 200V에서의 전기 천공은 전기 천공 후 3 일 후에 근섬유의 약 50 %에서 손상을 일으킨 반면, 근섬유의 10 %만이 50V¹³에서 손상되었음을 보여주었습니다. 우리는 근육 손상에 비해 효율적인 DNA 전달에 영향을 미치는 변수를 고려했으며 캘리퍼 너비의 센티미터 당 125V의 전압이 효과적인 유전자 전달을 달성하기에 충분하다는 것을 발견했습니다.

전기천공 후 근육 섬유 단면적 및 전체 근육 수축성의 분석은 유전자 조절에 의한 근육 크기 및 기능의 변화를 측정하는 방법의 중요한 측면이다. 우리와 다른 사람들은 이전에 제어 벡터의 전기 천공만으로는 근섬유 영역의 감소를 일으키지 않는다는 것을 입증했습니다. 녹색 형광 단백질(EGFP) 구축물은 이들 연구^13,14에서 DNA 형질감염의 유용한 형광 지표였다. 많은 연구가 전기 천공 후 TA의 계내 수축성을 조사하고 다양한 결과를 발견했습니다. 한 연구에 따르면 75V/cm 전기천공은 전기천공 후 3일 동안 파상력이 약 30% 감소했으며, 전기천공 후 7일까지 파타닉 파워가 대조군 수준으로 돌아간 반면, 50V/cm 전기천공은 힘^13,15를 손상시키지 않았다. 또 다른 연구에 따르면 180V / cm 전기 천공 후 3 시간 후에 파타닉 힘이 30 % 손실되어 7 일¹⁶ 일 후에 가짜 힘 수준으로 회복되었습니다.

다음의 상세한 절차에서, 우리는 마우스의 TA 및 신근 디지토럼 롱구스 (EDL) 근육에서 pcDNA3-EGFP 플라스미드의 주사 및 전기천공을 입증한다. 우리는 또한이 방법이 EDL 전체 근육 수축성에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증합니다. 목표는 기능 손실을 일으키지 않고 근섬유로의 효율적인 플라스미드 흡수를 입증하는 것입니다.

프로토콜

동물을 이용한 모든 실험은 Penn State College of Medicine에서 수행되었으며, Penn State University의 Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았으며 1964 년 헬싱키 선언 및 이후 개정안에 명시된 윤리적 기준에 따라 수행되었습니다. 12주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 이 절차에 사용하였다. 모든 수술 도구는 실험 전에 불임성을 위해 오토클레이브되었다.

1. TA 및 EDL 주입 / 전기 천공 준비

참고: 이 단계는 TA 및 EDL 주입/전기천공 준비에 대해 동일합니다.

1. 발현 플라스미드 구축물을 실험 전에 멸균 PBS에 희석된 1 μg/μL의 농도로 정제한다. 이 절차를 위해, pcDNA3-EGFP (GFP) 또는 pcDNA3 빈 벡터 (대조군)를 정제하기 위해 상업적으로 이용가능한 내독소 없는 정제 키트를 사용하였다.
2. 적절한 주입 부피를 보장하기 위해 플라스미드 농도를 계산한다 (멸균 PBS의 50 μL 중의 TA 50 μg의 DNA; EDL 10 μg의 DNA를 멸균 PBS의 10 μL) 및 분취량 샘플.
3. 선택 휠을 사용하고 휠을 눌러 다음과 같이 매개 변수를 선택하여 전기 기공기 설정을 프로그래밍하십시오 : 모드 - LV, 전압 - 12.5V / mm (사출시 조정), 펄스 길이 - 20ms, 펄스 수 - 5, 간격 - 200ms, 극성 - 단극.
4. 이소플루란 가스를 사용하여 마우스를 마취하십시오. 마우스를 5% 이소플루란이 있는 유도 박스에 넣는다. 포셉을 사용하여 발가락 핀치 반사의 부재에 의해 마취의 수술 평면을 확인하고 이소플루란을 2 % 유지 용량으로 줄입니다. 나머지 절차를 위해 37°C에서 순환 플레이트 상에 놓여 있는 적절한 코콘으로 마우스를 옮긴다.
5. 작은 머리 깎기를 사용하여 양쪽 뒷다리에서 머리카락을 제거하십시오. 주사 부위를 소독하기 위해 70 % 에탄올 / 베타 딘을 번갈아 가며 하지를 문질러 닦으십시오.

2. TA 주입/전기천공

1. 마우스를 수핀 위치에 두고, 아래쪽 다리의 측면 측면에 있는 피부를 통해 보이는 TA 힘줄을 찾습니다. 분리 가능한 30G 바늘이 있는 50μL 마이크로 주사기를 사용하여 바늘이 근육의 우수한 끝에 도달할 때까지 얕은 5° 각도로 근관 접합부보다 우수한 1-2mm 바늘을 삽입합니다.
   참고 : 근육의 중앙에 주사가 목표입니다.
2. 주입 경로를 따라 바늘을 천천히 후퇴시키면서 플런저를 천천히 감압하여 50 μL의 플라스미드 용액을 전달하였다. 근육이 부풀어 오른다.
3. 타이머를 1분 동안 설정하고 TA에서 다리의 두께를 측정한다. 마우스의 크기에 따라 5-10mm 일 수 있습니다. 캘리퍼 전극을 측정된 두께로 설정하고 전기천공 전압을 12.5V/mm로 설정합니다.
4. 1분 후, 캘리퍼 전극을 하지에 놓습니다. 전극은 꼭 맞아야 하지만 지나치게 꽉 조여서는 안 됩니다. 20ms 지속 시간과 200ms 간격으로 5 개의 구형파 펄스를 전달하십시오 (근육은 각 펄스마다 경련을 일으켜야합니다).
5. 제어 벡터를 사용하여 대체 사지로 반복하십시오.
6. 마우스를 마취로부터 분리하고 37°C로 설정된 가열 패드 상에서 회수하도록 허용한다. 복구되면 마우스를 케이지로 되돌립니다.

3. EDL 주입/전기천공

1. 마우스를 수핀 위치에 두고, 경골 뼈 앞쪽 볏을 시각적으로 그리고 부드러운 촉진을 통해 찾습니다.
   1. 메스를 사용하여 경골 전방 볏의 측면 측면의 피부를 통해 얕은 절개를 무릎보다 5mm 열등하게 하여 TA 근관 접합부보다 2mm 우수하게 만듭니다.
   2. 작은 가위를 사용하여 근막을 무딘 해부하여 TA 근육을 노출시킵니다.
   3. 다시 말하지만, 가위로 무딘 해부를 사용하여 근육을 옆으로 당겨 EDL을 노출시켜 경골에서 TA 근육을 부드럽게 분리하십시오. 작고 곡선 포셉을 사용하여 절차 중에 EDL에서 TA를 깨끗하게 유지할 수 있습니다.
2. 분리 가능한 30G 바늘이 있는 50μL 마이크로 주사기를 사용하여 바늘이 근육의 우수한 끝에 도달할 때까지 바늘을 EDL에 세로 방향으로 삽입합니다.
3. 주입 경로를 따라 바늘을 천천히 후퇴시키면서 플런저를 천천히 감압하여 플라스미드 용액 10 μL를 주입한다(근육이 부풀어 오름).
4. 타이머를 1 분 동안 설정하고 EDL에서 다리의 두께를 측정하십시오. 마우스의 크기에 따라 5-10mm 일 수 있습니다. 캘리퍼 전극을 측정된 두께로 설정하고 전기천공 전압을 12.5V/mm로 설정합니다.
5. 1분 후, 캘리퍼 전극을 하지에 놓습니다. 전극은 꼭 맞아야 하지만 지나치게 꽉 조여서는 안 됩니다. 20ms 지속 시간과 200ms 간격으로 5개의 구형파 펄스를 전달합니다(근육은 각 펄스마다 경련을 일으켜야 함).
6. 일회용 4/0 비흡수성 나일론 봉합사를 사용하여 절개를 닫습니다.
7. 대체 사지로 반복하거나 절대 통제로 팔다리를 손대지 않은 채로 두십시오.
8. 마우스를 마취로부터 분리하고 37°C로 설정된 가열 패드 상에서 회수하도록 허용한다. 수술 직후와 수술 후 12-24 시간 동안 적절한 피하 진통제를 투여하십시오. 복구되면 마우스를 케이지로 되돌립니다.
   참고 : 이전 연구는 전기 천공 직후 TA에서 근육 수축성 결핍을 보여 주었고 수축 회복은 3 일 동안 발생합니다^13,15. 이러한 이유로, 조직학, 단백질 발현 또는 근육 수축성에 대한 TA 및 EDL 근육 둘 다의 분석은 전기천공 후 3-10일 후에 수행된다. EGFP의 장기간 발현은 절차¹³ 이후 3주까지 관찰되었다.

결과

골격근에서 유전자 전달을 촉진하기 위한 전기천공은 근육 생리학의 변화를 평가하는데 사용되는 유용한 기술이다. 우리는 TA 및 EDL 근육 모두에서 효율적인 유전자 전달을 달성하기위한 상세하고 단계별 절차를 입증했습니다. 형질감염 효율의 차이는 다수의 변수로 인해 발생한다. 이러한 변수 중에는 전기 천공 매개 변수 (펄스, 전압, 펄스 지속 시간 등), 유전자 구성 크기 및 주입 된 DNA의 농도...

토론

전기천공에 의해 강화된 골격근에서의 생체내 유전자 전달은 근육에서 단백질 발현을 조절하기 위한 유용하고 비교적 간단한 도구이다. 우리는 EDL 및 TA 근육에서 효율적인 유전자 전달을 달성하는 데 필요한 단계를 보여 주었고 EDL의 수축성 측정이 절차에 따라 실행 가능하다는 것을 입증했습니다. 이 기술은 더 복잡한 바이러스 벡터를 필요로 하지 않으며, 단일 근육에서 형질감염된 근?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Nylon suture (non-absorbable)	Ethicon	662G	Suture to close skin incision
50µl Hamilton syringe	Hamilton	80501	microsyringe
C57BLl/6NHsd mice	Envigo	044	12 week-old female mice used for experimentation
Caliper Electrode	BTX	45-0102	1.0cm x 1.0cm stainless steel
Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis	Aurora Scientific	605A	Software used for muscle contractility measurement and analysis
ECM 830 Electroporation System	BTX	45-0662	electroporator
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Plasmid purification kit
Extra Narrow Scissors	Fine Science Tools	14088-10	Scissors for blunt dissection
Force Transducer	Aurora Scientific	407A	To measure force from EDL
Micro-Masquito Hemastats	Fine Science Tools	13010-12	Hemastats for surturing
pcDNA3.1 mammalian expression vector	Fisher Scientific	V79020	Control Vector
pcDNA3-EGFP expression plasmid	Addgene	13031	Plasmid for GFP expression
Semken curved forceps	Fine Science Tools	11009-13	Forceps for surgery
Surgical blades stainless steel no. 10	Becton Dickinson	37 1210	Scalpel blades
Tissue-Tek O.C.T. media	VWR	25608-930	Freezing media for histology
Wheat Germ Agglutinin- Texas Red	Thermo-Fisher Scientific	W21405	Membrane staining for muscle cross section