Elektroporation von Plasmid-DNA in die Skelettmuskulatur der Maus

Zusammenfassung

Die Elektroporation von Plasmid-DNA in die Skelettmuskulatur ist eine praktikable Methode, um die Genexpression zu modulieren, ohne die Muskelkontraktilität bei Mäusen zu beeinträchtigen.

Zusammenfassung

Die transiente Genexpressionsmodulation in der murinen Skelettmuskulatur durch Plasmidelektroporation ist ein nützliches Werkzeug zur Beurteilung der normalen und pathologischen Physiologie. Die Überexpression oder der Knockdown von Zielgenen ermöglicht es den Forschern, einzelne molekulare Ereignisse zu manipulieren und so die Mechanismen, die sich auf die Muskelmasse, den Muskelstoffwechsel und die Kontraktilität auswirken, besser zu verstehen. Darüber hinaus ermöglicht die Elektroporation von DNA-Plasmiden, die für fluoreszierende Tags kodieren, den Forschern, Veränderungen in der subzellulären Lokalisation von Proteinen in der Skelettmuskulatur in vivo zu messen. Eine wichtige funktionelle Beurteilung der Skelettmuskulatur umfasst die Messung der Muskelkontraktilität. In diesem Protokoll zeigen wir, dass nach Plasmid-DNA-Injektion, Elektroporation und Genexpressionsmodulation noch Studien zur Kontraktilität des gesamten Muskels möglich sind. Das Ziel dieses Lehrverfahrens ist es, die Schritt-für-Schritt-Methode der DNA-Plasmid-Elektroporation in die Skelettmuskulatur der Maus zu demonstrieren, um die Aufnahme und Expression in den Myofasern der Musculus tibialis anterior und extensor digitorum longus zu erleichtern und zu zeigen, dass die Kontraktilität der Skelettmuskulatur nicht durch Injektion und Elektroporation beeinträchtigt wird.

Einleitung

Die Plasmid-DNA-Elektroporation in die Skelettmuskulatur in vivo ist ein wichtiges Instrument zur Beurteilung von Veränderungen in der Skelettmuskelphysiologie und molekularen Signalgebung durch Modulation der Genexpression unter einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Der experimentelle Gentransfer in die Skelettmuskulatur wurde bereits 1990 von Wolff et al. demonstriert, wobei sowohl RNA als auch DNA erfolgreich ohne Elektroporation übertragen wurden und die Luciferase-Expression für mindestens 2 Monate^{aufrechterhalten wurde 10}. Die relativ geringe Transfektionseffizienz nur bei Injektion ist problematisch, und Aihara und Miyazaki zeigten¹⁹⁹⁸ einen erhöhten Gentransfer mit Elektroporation, indem sie ein pCAGGS-IL-5-Konstrukt in den Tabialis anterior (TA) -Muskel elektropolierten und die IL-5-Expression 11 des Serums maßen. Seitdem haben viele Studien die Wirksamkeit verschiedener DNA-Konzentrationen, -Volumina und -Elektroporationsparameter untersucht, um eine maximale Gentransfereffizienz zu gewährleisten. Mir et al. testeten verschiedene Elektroporationsparameter, einschließlich Spannung, Pulszahl, Pulsdauer und -frequenz sowie DNA-Konzentration, und stellten fest, dass eine höhere Spannung, Pulszahl und DNA-Konzentration zu einer erhöhten Elektroporationseffizienz beitrugen¹². Ein Hauptvorbehalt gegen eine hohe Elektroporationsspannung besteht darin, dass sie zwar eine erhöhte DNA-Aufnahme in Myofasern erleichtert, aber auch Muskelschäden verursacht, die die Ergebnisse beeinträchtigen können. Schertzer et al. zeigten, dass die Elektroporation bei 200 V in etwa 50% der Myofasern 3 Tage nach der Elektroporation Schäden verursachte, während nur 10% der Myofasern bei 50 V¹³ beschädigt wurden. Wir haben die Variablen berücksichtigt, die den effizienten DNA-Transfer im Vergleich zu Muskelschäden beeinflussen, und festgestellt, dass eine Spannung von 125 V pro Zentimeter Bremssattelbreite ausreicht, um einen effektiven Gentransfer zu erreichen.

Die Analyse der Muskelfaserquerschnittsfläche und der gesamten Muskelkontraktilität nach der Elektroporation sind wichtige Aspekte der Methode zur Messung von Veränderungen der Muskelgröße und -funktion aufgrund der Genmodulation. Wir und andere haben bereits gezeigt, dass die Elektroporation von Kontrollvektoren allein keine Abnahme der Myofaserfläche verursacht. Das Konstrukt des grün fluoreszierenden Proteins (EGFP) war in diesen Studien ein nützlicher fluoreszierender Indikator für die DNA-Transfektion^13,14. Eine Reihe von Studien haben die In-situ-Kontraktilität der TA nach der Elektroporation untersucht und unterschiedliche Ergebnisse gefunden. Eine Studie zeigte, dass die 75 V / cm-Elektroporation 3 Tage nach der Elektroporation eine Verringerung der Tetankraft um etwa 30% verursachte, und 7 Tage nach der Elektroporation war die tetanische Kraft wieder auf dem Kontrollniveau, während die 50 V / cm-Elektroporation die Kraft^13,15 nicht beeinträchtigte. Eine andere Studie zeigte, dass es einen 30% igen Verlust der Tetankraft 3 h nach 180 V / cm Elektroporation gab, die sich nach 7 Tagen¹⁶ auf die Scheinkraftniveaus erholte.

Im folgenden detaillierten Verfahren demonstrieren wir die Injektion und Elektroporation eines pcDNA3-EGFP-Plasmids in den TA- und Extensor digitorum longus (EDL) Muskeln von Mäusen. Wir zeigen auch, dass diese Methode die EDL-Kontraktilität des gesamten Muskels nicht beeinflusst. Ziel ist es, eine effiziente Plasmidaufnahme in Myofasern zu demonstrieren, ohne einen Funktionsverlust zu verursachen.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden am Penn State College of Medicine durchgeführt, vom Institutional Animal Care and Use Committee der Penn State University genehmigt und in Übereinstimmung mit den ethischen Standards durchgeführt, die in der Deklaration von Helsinki von 1964 und ihren späteren Änderungen festgelegt wurden. Für dieses Verfahren wurden 12 Wochen alte weibliche C57BL/6-Mäuse verwendet. Alle chirurgischen Werkzeuge wurden vor dem Experimentieren auf Sterilität autoklaviert.

1. TA- und EDL-Injektions-/Elektroporationsvorbereitung

HINWEIS: Diese Schritte sind für die TA- und EDL-Injektions- / Elektroporationsvorbereitung identisch.

1. Reinigen Sie Expressionsplasmidkonstrukte auf eine Konzentration von 1 μg / μL, die vor dem Experiment in sterilem PBS verdünnt werden. Für dieses Verfahren wurde ein handelsübliches endotoxinfreies Reinigungskit verwendet, um den leeren Vektor von pcDNA3-EGFP (GFP) oder pcDNA3 (Kontrolle) zu reinigen.
2. Berechnen Sie die Plasmidkonzentration, um ein ausreichendes Injektionsvolumen (TA 50 μg DNA in 50 μL sterilem PBS; EDL 10 μg DNA in 10 μL sterilen PBS) und aliquot Proben.
3. Programmieren Sie die Elektroporatoreinstellungen, indem Sie das Auswahlrad verwenden und das Rad drücken, um die Parameter wie folgt auszuwählen: Modus - LV, Spannung - 12,5 V/mm (zum Zeitpunkt der Einspritzung einzustellen), Pulslänge - 20 ms, Anzahl der Impulse - 5, Intervall - 200 ms, Polarität - unipolar.
4. Anästhesieren Sie die Mäuse mit Isoflurangas. Legen Sie die Mäuse in eine Induktionsbox mit 5% Isofluran. Bestätigen Sie die chirurgische Ebene der Anästhesie durch das Fehlen des Zehenquetschreflexes mit einer Pinzette und reduzieren Sie Isofluran auf 2% Erhaltungsdosis. Bringen Sie die Mäuse für den Rest des Verfahrens zu einem geeigneten Nasenkonus, der auf einer zirkulierenden Wasserplatte bei 37 ° C ruht.
5. Entfernen Sie Haare von beiden Hinterbeinen mit kleinen Haarschneidemaschinen. Schrubben Sie die unteren Gliedmaßen mit abwechselnd 70% Ethanol / Betadin, um den Injektionsbereich zu desinfizieren.

2. TA-Injektion/Elektroporation

1. Wenn sich die Maus in Rückenlage befindet, lokalisieren Sie die TA-Sehne, die durch die Haut auf der seitlichen Seite des Unterschenkels sichtbar ist. Mit einer 50 μL Mikrospritze mit einer abnehmbaren 30 G Nadel führen Sie die Nadel 1-2 mm höher als die myotendinöse Verbindung in einem flachen 5°-Winkel ein, bis die Nadel das obere Ende des Muskels erreicht.
   HINWEIS: Die Injektion in die Mitte des Muskels ist das Ziel.
2. Drücken Sie langsam den Kolben, während Sie die Nadel langsam entlang des Injektionspfades zurückziehen, um 50 μL Plasmidlösung zu liefern. Der Muskel sollte anschwellen.
3. Stellen Sie den Timer auf 1 min und messen Sie die Dicke des Beines am TA. Je nach Größe der Maus kann dies zwischen 5-10 mm liegen. Stellen Sie die Bremssattelelektroden auf die gemessene Dicke ein und stellen Sie die Elektroporatorspannung auf 12,5 V/mm ein.
4. Legen Sie nach 1 min die Bremssattelelektroden um die untere Extremität. Die Elektroden sollten eng anliegen, aber nicht zu dicht sein. Liefern Sie 5 Rechteckwellenimpulse mit 20 ms Dauer und 200 ms Intervallen (der Muskel sollte bei jedem Puls zucken).
5. Wiederholen Sie dies mit dem alternativen Glied unter Verwendung des Kontrollvektors.
6. Entfernen Sie die Maus aus der Narkose und lassen Sie sie sich auf einem auf 37 ° C eingestellten Heizkissen erholen. Nach der Wiederherstellung bringen Sie die Maus in ihren Käfig zurück.

3. EDL-Injektion / Elektroporation

1. Mit der Maus in Rückenlage lokalisieren Sie den vorderen Kamm des Tibiaknochens visuell und durch sanfte Palpation.
   1. Machen Sie mit einem Skalpell einen flachen Schnitt durch die Haut auf der lateralen Seite des Tibia-Vorderkamms, der dem Knie um 5 mm unterlegen ist, um 2 mm über der TA-myotendinösen Verbindung zu sein.
   2. Mit einer kleinen Schere die Faszie stumpf sezieren und den TA-Muskel freilegen.
   3. Trennen Sie den TA-Muskel vorsichtig von der Tibia, indem Sie den Muskel seitlich ziehen und die EDL freilegen. Kleine, gekrümmte Pinzetten können verwendet werden, um die TA während des Eingriffs von der EDL fernzuhalten.
2. Führen Sie die Nadel mit einer 50-μL-Mikrospritze mit einer abnehmbaren 30-G-Nadel in Längsrichtung in die EDL ein, bis die Nadel das obere Ende des Muskels erreicht.
3. Drücken Sie langsam den Kolben, während Sie die Nadel langsam entlang des Injektionspfades zurückziehen, um 10 μL der Plasmidlösung zu injizieren (der Muskel sollte anschwellen).
4. Stellen Sie einen Timer für 1 min ein und messen Sie die Dicke des Beines am EDL. Je nach Größe der Maus kann dies zwischen 5-10 mm liegen. Stellen Sie die Bremssattelelektroden auf die gemessene Dicke ein und stellen Sie die Elektroporatorspannung auf 12,5 V/mm ein.
5. Legen Sie nach 1 min die Bremssattelelektroden um die untere Extremität. Die Elektroden sollten eng anliegen, aber nicht zu dicht sein. Liefern Sie 5 Rechteckwellenimpulse mit 20 ms Dauer und 200 ms Intervallen (der Muskel sollte mit jedem Puls zucken).
6. Schließen Sie den Einschnitt mit Einweg-4/0-nicht resorbierbaren Nylonnähten.
7. Wiederholen Sie dies mit dem alternativen Glied oder lassen Sie das Glied als absolute Kontrolle unberührt.
8. Entfernen Sie die Maus aus der Narkose und lassen Sie sie sich auf einem auf 37 ° C eingestellten Heizkissen erholen. Verabreichen Sie ein geeignetes subkutanes Analgetikum unmittelbar nach der Operation und 12-24 h nach der Operation. Nach der Wiederherstellung bringen Sie die Maus in ihren Käfig zurück.
   HINWEIS: Frühere Studien haben ein Muskelkontraktilitätsdefizit in der TA unmittelbar nach der Elektroporation gezeigt und dass die kontraktile Erholung im Laufe von 3 Tagen^{auftritt 13,15}. Aus diesem Grund wird die Analyse der TA- und EDL-Muskeln auf Histologie, Proteinexpression oder Muskelkontraktilität 3-10 Tage nach der Elektroporation durchgeführt. Eine verlängerte Expression von EGFP wurde bis zu 3 Wochen nach dem Verfahren^{beobachtet 13}.

Ergebnisse

Elektroporation zur Erleichterung des Gentransfers in der Skelettmuskulatur ist eine nützliche Technik, um Veränderungen in der Muskelphysiologie zu bewerten. Wir haben ein detailliertes, schrittweises Verfahren demonstriert, um einen effizienten Gentransfer sowohl in den TA- als auch in den EDL-Muskeln zu erreichen. Unterschiede in der Transfektionseffizienz treten aufgrund einer Reihe von Variablen auf. Zu diesen Variablen gehören Elektroporationsparameter (Impulse, Spannung, Pulsdauer usw.), die Größe des Genkons...

Diskussion

Der In-vivo-Gentransfer in der Skelettmuskulatur, der durch Elektroporation verstärkt wird, ist ein nützliches und relativ einfaches Werkzeug zur Modulation der Proteinexpression im Muskel. Wir haben die Schritte gezeigt, die erforderlich sind, um einen effizienten Gentransfer in den EDL- und TA-Muskeln zu erreichen, und gezeigt, dass die Kontraktilitätsmessung der EDL nach dem Verfahren praktikabel ist. Diese Technik erfordert keine komplizierteren viralen Vektoren und ermöglicht den Vergleich von transfizi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Nylon suture (non-absorbable)	Ethicon	662G	Suture to close skin incision
50µl Hamilton syringe	Hamilton	80501	microsyringe
C57BLl/6NHsd mice	Envigo	044	12 week-old female mice used for experimentation
Caliper Electrode	BTX	45-0102	1.0cm x 1.0cm stainless steel
Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis	Aurora Scientific	605A	Software used for muscle contractility measurement and analysis
ECM 830 Electroporation System	BTX	45-0662	electroporator
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Plasmid purification kit
Extra Narrow Scissors	Fine Science Tools	14088-10	Scissors for blunt dissection
Force Transducer	Aurora Scientific	407A	To measure force from EDL
Micro-Masquito Hemastats	Fine Science Tools	13010-12	Hemastats for surturing
pcDNA3.1 mammalian expression vector	Fisher Scientific	V79020	Control Vector
pcDNA3-EGFP expression plasmid	Addgene	13031	Plasmid for GFP expression
Semken curved forceps	Fine Science Tools	11009-13	Forceps for surgery
Surgical blades stainless steel no. 10	Becton Dickinson	37 1210	Scalpel blades
Tissue-Tek O.C.T. media	VWR	25608-930	Freezing media for histology
Wheat Germ Agglutinin- Texas Red	Thermo-Fisher Scientific	W21405	Membrane staining for muscle cross section