使用氧化氘定量测定棕色脂肪组织中 从头 脂肪酸合成

摘要

在这里，我们提出了一种利用氧化氘和气相色谱质谱（GCMS）的廉价定量方法，用于分析体内棕色脂肪组织中的总脂肪酸从头脂肪生成。

摘要

脂肪酸合成是一种复杂且对能量要求很高的代谢途径，在控制全身代谢稳态和其他生理和病理过程方面具有重要的功能作用。与其他关键代谢途径（如葡萄糖处理）相反，脂肪酸合成未常规进行功能评估，导致对代谢状态的解释不完整。此外，缺乏适合该领域新手的公开详细协议。在这里，我们描述了一种利用氧化氘和气相色谱质谱（GCMS）分析体内棕色脂肪组织中总脂肪酸从头合成的廉价定量方法。该方法独立于碳源测量脂肪酸合酶产物的合成，并且几乎可用于任何组织、任何小鼠模型和任何外部扰动。提供了有关GCMS样品制备和下游计算的详细信息。我们专注于棕色脂肪的分析，因为它具有高水平的从头脂肪酸合成和在维持代谢稳态中的关键作用。

引言

肥胖和相关代谢疾病是一种危害今世后代的流行病 ^1,2.通常简化为能量摄入和消耗之间不平衡的结果，与肥胖相关的代谢失调会影响大量由环境和内源性因素控制的代谢途径³.然而，只有少数途径在代谢失调的动物模型中常规测试。

例如，葡萄糖处理通常通过葡萄糖和胰岛素耐量试验来测量，这可能是由于使用便携式血糖监测仪的简单性⁴。全身葡萄糖和脂质氧化的相对速率也根据间接量热测定的呼吸交换比率常规估计 ^5,6。然而，代谢的大多数其他方面都没有常规进行功能评估。这导致对代谢状态的不完整解释和错过治疗选择。其中一种主要的途径是从头脂肪生成。

从头脂肪生成（DNL）是从前体产生新脂肪酸的过程。葡萄糖被认为是导致全身 DNL⁷ 的主要前体，但其他前体，如乙酸盐、果糖、乳酸和支链氨基酸，已被证明是空间和条件依赖性方式相关的碳源 8,9,10,11,12。DNL 是代谢稳态的关键贡献者，对正常发育至关重要¹³.此外，DNL 的改变与癌症 14,15 和代谢 16,17,18 以及心血管疾病 ^19,20 有关。

DNL 通路由核心酶促成分 ATP 柠檬酸裂解酶 （ACLY）、乙酰辅酶 A 羧化酶 （ACC1/2） 和脂肪酸合酶 （FAS） 组成，主要产生棕榈酸酯，一种 16 碳饱和脂肪酸。然而，奇链和支链脂肪酸也可以以较低的速率产生⁹。延伸酶和去饱和酶进一步修饰这些脂肪酸，产生多种脂肪酸种类，可用于多种功能（例如，长期能量储存和操纵膜流动性）。

DNL酶机制的表达受少量转录因子的控制。迄今为止描述最充分的包括甾醇调节元件结合蛋白 （SREBP） 家族、碳水化合物反应元件结合蛋白 （ChREBP） 和肝脏 X 受体 （LXR）²¹、^22、23、²⁴、^25、26。尽管它们的功能明显重叠，但已报告了基于细胞类型优势和生理或病理条件的个体调节^21,22,27,28。

值得注意的是，许多用于DNL通路特定步骤的抑制剂已被批准用于临床，或处于临床前或临床开发阶段，用于多种疾病，包括肥胖、非酒精性脂肪性肝病/非酒精性脂肪性肝炎（NAFLD/NASH）和心血管疾病²⁹。这些努力凸显了DNL在健康和疾病中的相关性。

近年来，定量评估从头脂肪酸合成的方法的使用增加了³⁰。评估这一点的最常见方法是使用重标记水 （D₂O），其中重标记的氢在合成过程中通过与 DNL 底物 NAPDH、乙酰辅酶 A 和丙二酰辅酶 A 的氢交换直接或间接地掺入酰基链中。尽管这种方法越来越受欢迎，但缺乏适合该领域新手的公开可用详细协议。在这里，我们概述了一种使用 D₂O 和气相色谱质谱 （GCMS） 定量评估 FAS 产物从头合成的方法，其计算方法先前由 Lee 等人 ³¹ 开发。该方法独立于碳源测量从头脂肪酸合成，并且几乎可用于任何组织、任何小鼠模型和任何外部扰动。在这里，我们专注于棕色脂肪组织 （BAT） 的分析，因为它具有高水平的 DNL 和在维持代谢稳态中的关键作用。

研究方案

所有实验均由辛辛那提儿童医院医疗中心机构动物护理和使用委员会批准。

1. D₂O的制备

注意:为避免实验变化，在实验期间为所有小鼠准备足够的溶液/饮用水。

1. 对于腹膜内注射:通过溶解每升D 2 O中的9g NaCl，产生0.9%w / v盐水D₂O.通过非热原0.2μm过滤器过滤以灭菌。
2. 饮用 D 2 O 水:每 920 mL 普通饮用水混合 80 mL D₂O，产生 8% v/v D₂O 富集水用作饮用水。可以从老鼠设施获得常规饮用水。通过非热原 0.2 μm 过滤器过滤以进行灭菌。

2. 通过温度驯化调节BAT活性

1. 将小鼠分开，以便在温度驯化开始前2周每个笼子有两只小鼠。将供水改为水瓶，使小鼠适应并将所有笼子保持在22°C。
2. 在开始温度驯化前1周通过设置适当的温度来准备小鼠环境室:30°C用于热中性，22°C用于室温，18°C用于冷暴露。
3. 在温度适应开始时，用没有环境富集的新笼子替换笼子（以避免巢穴）。将笼子移动到各自的温度。
   注意:指定为热中性的笼子将在30°C下保持4周。指定在室温下的笼子将在 22 °C 下保持 4 周。分配给冷暴露的笼子将每周逐渐变冷:第一周为18°C，第二周为14°C，第三周为10°C，第四周为6°C。
4. 针对所有情况，每周更换弄脏的笼子。此外，用在适当温度下预先适应的新瓶更换食物瓶和水瓶至少 24 小时。
   注意:注意每周添加的食物量，特别是对于寒冷的小鼠，因为与正常情况相比，它们会消耗更多的食物。 随意提供食物。

3. D₂O 的管理

1. 在组织收集前12小时-3天，通过腹膜内注射，使用1mL注射器和26G针头，以35μL / g体重向每只动物注射0.9%w / v盐水D₂O。
   注意:有关选择适当贴标时间的更多信息，请参阅讨论部分。
2. 将水瓶更换为含有 8% v/v D₂富含 O 的饮用水的瓶子。

4. 血浆和组织的采集、处理和储存

1. 在实验结束时，使用批准的方法（例如，二氧化碳过量，然后颈椎脱位）处死小鼠。
   1. 使用热/冷垫或其他方法避免安乐死前温度突然变化，这可能会影响结果。按照批准的方法对小鼠实施安乐死。立即进行血液和组织采集。
2. 使用26G针头通过心脏穿刺收集血液，并储存在乙二胺四乙酸采血管中。将血液放在冰上，直到进一步处理。
3. 沿着鼠标背部的中线从胸腔下部区域切开皮肤，直到颈部的上部区域，同时将皮肤向上拉，以免影响皮肤以下的组织。肩胛间BAT位于肩胛骨之间，在一层薄薄的白色脂肪组织下，由两个金字塔形的叶组成。
   1. 通过在冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤来清洁组织。轻拍在纸巾上以去除多余的液体，在分析秤上称重，然后收集在微管中。
   2. 立即使用液氮快速冷冻组织。也可以收集其他 BAT 仓库。
4. 将血液样品在4°C下以10,000× g 离心10分钟。 离心后，小心地收集血浆，不要干扰红细胞沉淀。将其转移到新的冰冷微管中，并在液氮中快速冷冻。
5. 将棕色脂肪和血浆样品储存在-80°C直至使用。

5. 从脂肪组织中提取脂质

1. 在开始提取之前
   1. 在玻璃小瓶中制备1mM十六碳烯酸-_{d 31} 酸的甲醇溶液。这将作为内部脂肪酸标准品。
   2. 在-80°C冰箱或干冰上预冷所需量的氯仿（_CHCl 3）和甲醇（CH₃OH）。
      注:抗氧化剂二叔丁基-4-甲基苯酚 （BHT） 可以以 0.01% w/v （2.5 mg/25 mL） 的浓度添加到 CHCl₃ 中，以防止不饱和脂肪酸中的双键氧化。
   3. 为每个组织样本预先标记微量离心管，并额外标记用于空白提取的管。
      注意:CH₃OH 和 CHCl₃ 吸入时具有高度挥发性和毒性。仅在通风橱中使用。
      注意:不同品牌的微量离心管具有不同水平的背景棕榈酸酯和防止溶剂泄漏的能力。我们建议首先测试各种试管，以确保防止溶剂泄漏，并且试管的棕榈酸酯污染水平最低。参见 Yao et ^al.32 进行进一步讨论。
2. 将样品从冰箱中取出并放在干冰上。
3. 将预先标记的微量离心管放在分析天平上并去皮。将镊子和手术刀/钢制剃须刀片放在干冰上 10-20 秒冷却。
   1. 使用镊子将冷冻组织样品从试管中取出并放在塑料称重船上。称重舟可以放置在平坦的干冰块或其他预冷的表面上。
   2. 使用手术刀或钢制剃须刀片，解剖一小部分组织，相当于5-15毫克的重量。放入微量离心管中并记录确切的重量。对每个标本重复上述步骤。此时，样品可以储存在冰箱中，也可以推进到以下步骤进行脂质提取。
      注意: 确保在样品之间用 70% 乙醇正确清洁手术刀，并在每个样品之间使用新鲜的称重船amps.
4. 向每个样品中加入 1 μL/mg 的 10 mM 十六碳烯酸-d 31（C16:0-d₃₁）。
   注意: 由于溶剂有吸入风险，以下步骤（5.4 至 5.8）应在通风橱下进行。
5. 用三个 5 mm 不锈钢珠向每个样品中加入 250 μL CH 3 OH、250 μL H₂O 和 500 μL_{CHCl 3}。将试管置于研磨机的预冷块中，并以25Hz的振动频率混合样品5分钟，或使用制造商推荐的组织样品指南。使用磁铁取出珠子。
6. 将样品在4°C下以12,000× g 离心10分钟。
   注:离心后，应观察到明显的双相分离，上层水相含有极性代谢物，下层有机相含有脂质和脂肪酸。如果未观察到分离，则加入 250 μL H₂O 并重复涡旋和离心步骤。
7. 使用微量移液器，从每个样品的底部相中取固定体积的微量离心管中。
8. 向剩余样品中加入 500 μL_{CHCl 3} ，并重复步骤 5.6-5.7。
9. 将样品置于氮气下或在4°C下置于耐_{CHCl 3}的冷冻离心真空中，直至完全干燥。干燥的样品可以储存在-20°C，直到准备衍生化。
   注:此时也可以收集每个样品的顶层并按照步骤5.9进行干燥，以分析极性代谢物。

6. 脂肪酸甲酯（FAMEs）的制备及GCMS分析

1. 酸催化酯化和酯交换反应制备FAME
   注意: 由于溶剂的吸入风险，以下步骤应在通风橱下进行。
   1. 如果样品已储存在冰箱中，则在氮气下干燥5分钟，以确保不存在水。
   2. 使用 MS 级溶剂，将 98 mL 无水 CH₃OH 移液到玻璃培养基瓶中。在通风橱中缓慢加入 2 mL 无水硫酸，使 CH₃OH 中的 2% H₂SO₄。通过旋转封闭的瓶子进行混合。
   3. 向每个样品中加入 500 μL 的 2% H₂SO₄ 溶于 CH₃OH 溶液中，并短暂涡旋。
   4. 将样品在50°C的加热块上孵育2小时。
   5. 从加热块中取出样品，向每个样品中加入 100 μL 饱和 NaCl 溶液和 500 μL 己烷。
   6. 在室温下剧烈涡旋样品1分钟。让样品静置1分钟;在此之后，应该有两个阶段是显而易见的。
   7. 将上层相收集到新鲜的微量离心管中（有关微量离心管的适当选择，请参见第 5.1.3 节中的注释）。
   8. 为了最大限度地提高产量，重复步骤6.1.5-6.1.7，将第二个样品收集到相同的标记管中。
   9. 在室温下在氮气下干燥样品。
   10. 将样品重悬于相对于原始组织重量的 20 μL/mg 己烷中，并立即转移到带有玻璃插件的玻璃 GC 小瓶中。
       注意:转移样品时快速工作，以尽量减少蒸发。
2. GCMS分析
   1. 为了确定FAME同位素异构体的丰度，将样品注入单个四极杆气相色谱质谱仪（GCMS）上。
      注:虽然许多色谱柱类型可用于检测棕榈酸酯，但为GCMS色谱柱建立了以下温度程序，该色谱柱是为分离脂肪酸顺式/反式异构体而开发的，详见 材料表。该柱的长度为 50 m，内径为 0.25 mm。
   2. 在入口温度为270°C的分流/不分流入口中注入1μL样品，使用氦气作为载气，以1mL / min的速度流动。对总流速为 19 mL/min 的低丰度脂肪酸使用不分流进样，隔膜吹扫为 3 mL/min，在 0.75 min 时使用清扫流速至 15 mL/min 的分流通气。对棕榈酸酯和油酸酯等高丰度脂肪酸使用 10:1-40:1 的分流比。
   3. 使用以下烘箱参数:初始温度为 80 °C;以 20 °C/min 的增量增加至 170 °C;以 1 °C/min 的增量增加至 204 °C;以 20 °C/min 的增量增加至 250 °C;然后在250°C下保持10分钟。
   4. 使用以下质量选择检测器 （MSD） 参数:70 eV 的电子撞击电离模式，扫描范围为 50-400 m/z，扫描速度为 1,562 （u/s），扫描频率为 4.1 次扫描/秒。使用280°C的传输线，230°C的离子源和150°C的四极杆。
      注意:可以使用其他色谱柱，但温度程序会有所不同。
   5. 样品序列:随机化进样顺序，在序列开始时、序列中每五个样品之后以及序列结束时至少进样两到三个己烷空白。
   6. 使用仪器专用软件或免费的开放访问软件（如 Metabolite-Detector³³）对 表 1 中每种脂肪酸甲酯的离子进行积分。
      注意:我们在 表 1 中概述了覆盖 M1-M5 同位素异构体的离子，我们发现这些离子涵盖了该标记窗口的氘掺入量。但是，如果 从头 通量明显更高和/或使用更长的标记时间，则可能需要扩大剂量。
   7. 使用每个积分离子的丰度来生成质量同位素体分布，其中离子强度可以转换为分数丰度，以便质量同位素体分布的总和等于 1。请参阅 补充文件中的示例电子表格。
      注:为了准确确定氘掺入，必须对天然同位素丰度进行校正，以允许存在天然存在的同位素，例如 ¹³C、¹⁵N 和 ²H。这是通过应用Fernandez等人^34,35概述的校正矩阵来执行的^，并且不能通过从标记的代谢物中减去未标记的测量代谢物的MID来执行。在实践中，我们建议使用免费提供的软件，如fluxfix 36、polyMID³⁷或IsoCor³⁸，将原始数据转换为分数MID，我们在表1中提供了FAS甲酯产物的同位素校正公式。
   8. 要确定棕榈酸酯的含量，请使用以下公式:
       
      其中离子计数是指表1中集成的所有棕榈酸酯同位素异构体的总和，C16:0-d 31是指内标hexadecenoic-d₃₁。内标与内源性棕榈酸酯的峰形成一个单独的峰。也可以测定其他脂肪酸的相对丰度，但可能需要使用脂肪酸特异性同位素内标（质量位移大于从D₂O掺入时观察到的质量位移）或外部标准曲线进行完全定量。使用空白提取的样品确定背景棕榈酸酯的量，并将其从最终组织值中减去。
   9. 通过以下公式计算棕榈酸酯的摩尔富集 （ME）:
      
      其中 M_i 是棕榈酸酯同位素异构体的归一化分数丰度，n 是可能的棕榈酸酯同位素异构体的数量。例如，具有以下分数分布的棕榈酸酯分子的 ME，M1 = 0.25，M2 = 0.08，M3 = 0.02，为:（0.025*1） + （0.08*2） + （0.02*3） = 0.245（见 补充文件）。

7.血浆样品的氘丙酮交换以确定体内水分富集

1. 反应
   1. 制备 10 种氘水溶液，范围为 0-9% v/v。
   2. 制备 5% v/v 丙酮/乙腈溶液，每个样品允许 4 μL，包括步骤 5.1.1 中的标准品。
   3. 在标记的安全锁微量离心管中，混合 10 μL 每种血浆样品或标准品、4 μL 10 M NaOH 和 4 μL 5% 丙酮/乙腈。对每个样品一式三份。
   4. 通过移液轻轻混合样品。让样品在室温下孵育过夜。
2. 萃取
   1. 孵育后，向每个样品中加入 450-550 mg Na₂SO₄ 。
   2. 在通风橱中，向每个试管中加入 600 μL_{CHCl 3} ，并剧烈涡旋 15 秒。
   3. 将样品以300×g离心2分钟。
   4. 在通风橱下，将每个样品中一式三份的 80 μL 上清液等分试样转移到带有玻璃插件的标记玻璃 GCMS 小瓶中，并盖紧盖子。
3. GCMS分析
   1. 在色谱柱（30 m，0.25 mm内径，Agilent DB-35MS）上分离样品，并在连接的质谱仪上进行分析。
      1. 将 1 μL 样品注入分流/不分流进样口，分流比为 40:1，氦气流量为 1 mL/min，进样口温度为 270 °C。
      2. 使用以下烘箱参数:初始温度为 60 °C，以 20 °C/min 的增量增加至 100 °C，以 50 °C/min 的增量增加至 220 °C，然后在 220 °C 下保持 1 分钟。
      3. 使用以下质量选择检测器 （MSD） 参数:70 eV 的电子撞击电离模式，选择离子监测为 58 和 59 m/z。使用280°C的传输线，230°C的离子源和150°C的四极杆。
         注意:可以使用其他低流失、键合、交联、中极性色谱柱，但温度程序会有所不同。
   2. 将液体采样器方法设置为从_CHCl 3 洗涤开始，然后是样品的随机序列，包括每六个样品进行额外的 CHCl₃ 洗涤步骤。
      注:如果丙酮用作自动进样器的洗针剂，请用CHCl 3或己烷代替，并进样多个空白_{CHCl 3}样品，直到色谱图中不再明显任何污染丙酮峰。
   3. 使用这种方法，丙酮峰在约1.25分钟时洗脱。按照步骤6.2.6-6.2.7整合数据并计算丙酮富集的丰度分数，并进行调整以分析含有58-60的m/z比的峰，如 表1所示。
   4. 使用标准品生成标准曲线，以根据丙酮的富集分数确定测试样品的体内水分富集百分比 （p）。

8. 体内 从头 脂肪生成计算

1. 使用以下公式计算每个样品中作为 FAS 直接产物的新合成脂肪酸 （FNS） 的分数（即棕榈酸酯、奇链脂肪酸和 mmBCFA）:
   
   其中ME是棕榈酸酯分子的平均摩尔富集量（步骤6.2.9），p是相应等离子体样品（步骤7.3.4）中氘富集量，N是棕榈酸酯上可交换的氢原子数，其中氘可以掺入。
2. 使用以下由 Lee 等人建立的公式确定 ^N31:
   
3. 通过以下方法确定新合成脂肪酸 （MNS） 的摩尔量:
   MNS = FNS x 总脂肪酸量（nmol/mg 组织）。
   注:例如，如果获得棕榈酸酯摩尔富集量（ME）为0.245，体内水中的氘富集量（p）为0.045，计算出的N数为22，则棕榈酸酯的合成分数为0.247。如果组织中存在的棕榈酸酯的量为 2 mmol/mg，则新合成的棕榈酸酯的 mmol为 0.494 mmol/mg（参见 补充文件）。

结果

基于步骤 1 中描述的 D 2 O 剂量，我们通常发现体内水分的富集范围为_2.5% 至 6%，并且体内水中氘富集的基线水平在 1 小时内迅速达到， 并通过 8% 浓缩饮用水维持研究期间（图 1）。连续稳态人体水分富集是步骤6中使用的计算的假设，因此我们建议在新的实验模型中对人体水分富集动力学进行实验验证。

我们发现，相对于BAT中热中性脂肪?...

讨论

了解复杂代谢途径之间的平衡和相互作用是理解代谢相关疾病生物学基础不可或缺的一步。在这里，我们展示了一种非侵入性且廉价的方法来确定从头脂肪酸合成的变化。该方法改编自先前发表的方法，这些方法开发了用于估计脂肪酸氘富集的从头合成通量的计算³¹ 和使用氘-丙酮交换来确定体内水中 D₂O 的相对百分比³⁹。近年来，我们采用...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 mL Glass Vials	Fisher Scientific	14-955-334
0.2 µm filter	Olympus Plastic	25-244
26G needeled syringes	BD	309597
Acetone	Merck	34850
Acetonitrile	Merck	900667
Blue GC screw cap with septa	Agilent	5190-1599
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Chloroform	Sigma	366927
Deuterium oxide	Sigma	151882
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) Select FAME Column	Merck	B1378
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) Select FAME Column	Agilent	CP7419
EDTA tube	Sarstedt	411395105
Ethanol	Merck	51976
Hexadecenoic-d31 Acid	Larodan	71-1631
Hexane	Merck	34859
Methanol	Merck	34860
Microcentrifuge tube	Olympus Plastic	24-282
Mouse environmental chamber	Caron	Caron 7001-33
Potasium Chloride	Fisher Bioreagents	BP366-500
Potasium Phosphate	MP Biomedicals	194727
SafeLock microcentrifuge tubes	Eppendorf	30120086
Screw top amber GC vial	Agilent	5182-0716
Sodium Chloride	Fisher Bioreagents	BP358-212
Sodium Hydroxide	Merck	S5881
Sodium Phosphate, dibasic	Fisher Bioreagents	BP332-500
Sodium Sulfate	Merck	239313
Sulfuric Acid	Merck	258105
Vial insert	Agilent	5183-2088