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  • Protocolo
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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí, presentamos un método cuantitativo de bajo costo que utiliza óxido de deuterio y cromatografía de gases (GCMS) para el análisis de la lipogénesis total de novo de ácidos grasos en tejido adiposo marrón in vivo.

Resumen

La síntesis de ácidos grasos es una vía metabólica compleja y altamente exigente en energía con importantes funciones en el control de la homeostasis metabólica de todo el cuerpo y otros procesos fisiológicos y patológicos. A diferencia de otras vías metabólicas clave, como la eliminación de glucosa, la síntesis de ácidos grasos no se evalúa funcionalmente de forma rutinaria, lo que lleva a interpretaciones incompletas del estado metabólico. Además, hay una falta de protocolos detallados disponibles públicamente adecuados para los recién llegados al campo. Aquí, describimos un método cuantitativo de bajo costo que utiliza óxido de deuterio y cromatografía de gases y espectrometría de masas (GCMS) para el análisis de la síntesis total de novo de ácidos grasos en tejido adiposo marrón in vivo. Este método mide la síntesis de los productos de la sintasa de ácidos grasos independientemente de una fuente de carbono, y es potencialmente útil para prácticamente cualquier tejido, en cualquier modelo de ratón y bajo cualquier perturbación externa. Se proporcionan detalles sobre la preparación de la muestra para GCMS y los cálculos posteriores. Nos centramos en el análisis de la grasa parda debido a sus altos niveles de síntesis de ácidos grasos de novo y su papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis metabólica.

Introducción

La obesidad y las enfermedades metabólicas asociadas son una pandemia que pone en peligro a las generaciones presentes y futuras 1,2. Comúnmente simplificada como consecuencia del desequilibrio entre la ingesta y el gasto energético, la desregulación metabólica asociada a la obesidad afecta a un gran número de vías metabólicas controladas por factores ambientales y endógenos3. Sin embargo, solo unas pocas vías se prueban de forma rutinaria en modelos animales de desregulación metabólica.

A modo de ejemplo, la eliminación de glucosa se mide de forma rutinaria mediante pruebas de tolerancia a la glucosa y a la insulina, probablemente debido a la simplicidad del uso de monitores portátiles de glucosa4. Las tasas relativas de glucosa en el cuerpo entero y de oxidación de lípidos también se estiman de forma rutinaria en función de la relación de intercambio respiratorio de los ensayos de calorimetría indirecta 5,6. Sin embargo, la mayoría de todos los demás aspectos del metabolismo no se evalúan funcionalmente de forma rutinaria. Esto conduce a interpretaciones incompletas del estado metabólico y a la pérdida de opciones terapéuticas. Una de las principales vías de este tipo es la lipogénesis de novo.

La lipogénesis de novo (DNL) es el proceso mediante el cual se generan nuevos ácidos grasos a partir de precursores. Se considera que la glucosa es el principal precursor que contribuye a la DNL7 de todo el cuerpo, sin embargo, otros precursores, como el acetato, la fructosa, el lactato y los aminoácidos de cadena ramificada, han demostrado ser fuentes de carbono relevantes de manera espacial y dependiente de la condición 8,9,10,11,12. La DNL es un contribuyente clave a la homeostasis metabólica y es esencial para el desarrollo normal13. Además, las alteraciones en la DNL se han asociado con cáncer 14,15 y metabólico 16,17,18 y enfermedades cardiovasculares 19,20.

La vía DNL está compuesta por los componentes enzimáticos centrales ATP citrato liasa (ACLY), acetil-CoA carboxilasa (ACC1/2) y ácidos grasos sintasa (FAS) que producen principalmente palmitato, un ácido graso saturado de 16 carbonos. Sin embargo, los ácidos grasos de cadena impar y cadena ramificada también se pueden producir a tasas más bajas9. Las elongasas y desaturasas modifican aún más estos ácidos grasos, creando una amplia gama de especies de ácidos grasos útiles para una variedad de funciones (por ejemplo, almacenamiento de energía a largo plazo y manipulación de la fluidez de la membrana).

La expresión de la maquinaria enzimática de DNL está controlada por un número reducido de factores de transcripción. Las más descritas hasta la fecha incluyen la familia de proteínas de unión a elementos reguladores de esteroles (SREBP), la proteína de unión a elementos de respuesta a carbohidratos (ChREBP) y el receptor X hepático (LXR)21,22,23,24,25,26. A pesar de una aparente superposición en sus funciones, se han descrito regulaciones individuales basadas en la dominancia del tipo celular y en condiciones fisiológicas o patológicas21,22,27,28.

Sorprendentemente, una serie de inhibidores para pasos seleccionados de la vía DNL han sido aprobados para uso clínico o se encuentran en las etapas preclínicas o clínicas de desarrollo para una serie de enfermedades, incluida la obesidad, la enfermedad del hígado graso no alcohólico/esteatohepatitis no alcohólica (NAFLD/NASH) y las enfermedades cardiovasculares29. Estos esfuerzos ponen de relieve la importancia de la DNL en la salud y la enfermedad.

En los últimos años, el empleo de métodos para evaluar cuantitativamente la síntesis de novo de ácidos grasos ha aumentado30. El método más común para evaluar esto es el uso de agua marcada pesada (D2O), donde el hidrógeno marcado pesado se incorpora a las cadenas de acilo durante la síntesis, tanto directa como indirectamente, a través del intercambio de deuterio con los hidrógenos de los sustratos DNL NAPDH, acetil-CoA y malonil-CoA. Aunque este enfoque está ganando popularidad, hay una falta de protocolos detallados disponibles públicamente adecuados para los recién llegados al campo. En este trabajo se describe un método para evaluar cuantitativamente la síntesis de novo de productos de FAS utilizando D2O y espectrometría de masas por cromatografía de gases (GCMS), con cálculos desarrollados previamente por Lee et al.31. Este método mide la síntesis de ácidos grasos de novo independientemente de una fuente de carbono, y es potencialmente útil para prácticamente cualquier tejido, en cualquier modelo de ratón y bajo cualquier perturbación externa. Aquí, nos centramos en el análisis del tejido adiposo marrón (BAT) debido a sus altos niveles de DNL y su papel crítico en el mantenimiento de la homeostasis metabólica.

Protocolo

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico del Hospital Infantil de Cincinnati.

1. Preparación de D2O

NOTA: Para evitar la variación experimental, prepare suficiente solución/agua potable para todos los ratones durante la duración del experimento.

  1. Para inyección intraperitoneal: generar solución salina al 0,9% p/v D 2 O disolviendo 9 g de NaCl por litro de D 2 O. Filtrara través de un filtro no pirogénico de0,2μm para esterilizar.
  2. Para beber agua D2 O: generar un 8% v/v de agua enriquecida con D2O-O para ser utilizada como agua potable mezclando 80 mL deD2O por 920 mL de agua potable normal. Se puede obtener agua potable regular de la instalación de ratones. Filtrar a través de un filtro no pirogénico de 0,2 μm para esterilizar.

2. Modulación de la actividad MTD mediante la aclimatación a la temperatura

  1. Separe los ratones para que haya dos ratones por jaula 2 semanas antes del inicio de la aclimatación a la temperatura. Cambie el suministro de agua a botellas de agua para que los ratones se adapten y mantengan todas las jaulas a 22 °C.
  2. Prepare las cámaras ambientales del ratón 1 semana antes de comenzar la aclimatación a la temperatura ajustando las temperaturas adecuadas: 30 °C para la termoneutralidad, 22 °C para la temperatura ambiente y 18 °C para la exposición al frío.
  3. Al comienzo de la aclimatación a la temperatura, reemplace las jaulas por otras nuevas sin enriquecimiento ambiental (para evitar nidos). Mueva las jaulas a sus respectivas temperaturas.
    NOTA: Las jaulas asignadas a termoneutralidad permanecerán a 30 °C durante 4 semanas. Las jaulas asignadas a temperatura ambiente permanecerán a 22 °C durante 4 semanas. Las jaulas asignadas a la exposición al frío se enfriarán progresivamente en un horario semanal: 18 °C durante la primera semana, 14 °C durante la segunda semana, 10 °C durante la tercera semana y 6 °C durante la cuarta semana.
  4. Cambie las jaulas sucias semanalmente para todas las condiciones. Además, sustituya las botellas de comida y agua por otras nuevas preadaptadas a la temperatura adecuada durante al menos 24 h.
    NOTA: Tenga en cuenta las cantidades de comida que se agregan cada semana, especialmente para los ratones en el frío, ya que consumirán una cantidad significativamente mayor de comida en comparación con las condiciones normales. Proporcionar alimentos ad libitum.

3. Administración de D2O

  1. Inyectar a cada animal con solución salina D2O al 0,9% p/v a 35 μL/g de peso corporal, 12 h-3 días antes de la recogida de tejido, mediante inyección intraperitoneal con una jeringa de 1 ml y una aguja de 26 G.
    NOTA: Consulte la sección de discusión para obtener más información sobre cómo seleccionar un tiempo de etiquetado adecuado.
  2. Cambie las botellas de agua por botellas que contengan un 8% v/v de agua potable enriquecida con D2O.

4. Recolección, procesamiento y almacenamiento de plasma y tejidos

  1. Al final del experimento, sacrifique a los ratones utilizando metodologías aprobadas (por ejemplo, sobredosis de dióxido de carbono seguida de dislocación cervical).
    1. Use almohadillas calientes/frías u otros métodos para evitar cambios bruscos de temperatura antes de la eutanasia que puedan afectar los resultados. Sacrificar a los ratones siguiendo metodologías aprobadas. Proceda inmediatamente a la extracción de sangre y tejidos.
  2. Recolectar sangre a través de una punción cardíaca con una aguja de 26 G y almacenarla en un tubo de extracción de sangre de ácido etilendiaminotetraacético. Mantenga la sangre en hielo hasta que se procese más.
  3. Corta la piel a lo largo de la línea media de la parte posterior del ratón desde la zona inferior de la cavidad torácica hasta la zona superior del cuello, mientras tiras de la piel hacia arriba para evitar afectar a los tejidos que se encuentran debajo de la piel. El BAT interescapular se encuentra entre los omóplatos bajo una fina capa de tejido adiposo blanco, y está compuesto por dos lóbulos de forma piramidal.
    1. Limpie el pañuelo lavándolo con solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada. Aplique una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido, péselo en una báscula analítica y recolóquelo en un microtubo.
    2. Congele inmediatamente el tejido con nitrógeno líquido. También se pueden recoger otros depósitos de MTD.
  4. Centrifugar las muestras de sangre a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C. Después de la centrifugación, recoja cuidadosamente el plasma sin alterar el gránulo de glóbulos rojos. Transfiéralo a un nuevo microtubo helado y congélelo rápidamente en nitrógeno líquido.
  5. Almacenar las muestras de grasa parda y plasma a -80 °C hasta su uso.

5. Extracción de lípidos del tejido adiposo

  1. Antes de comenzar la extracción
    1. Prepare una solución de 1 mM de ácido hexadecenoico-d31 en metanol en un vial de vidrio. Esto servirá como el estándar interno de ácidos grasos.
    2. Enfriar previamente la cantidad necesaria de cloroformo (CHCl 3) y metanol (CH3OH) en un congelador a -80 °C o en hielo seco.
      NOTA: El antioxidante di-terc-butil-4-metilfenol (BHT) puede añadirse al CHCl3 a una concentración de 0,01% p/v (2,5 mg/25 ml) para evitar la oxidación de los dobles enlaces en los ácidos grasos insaturados.
    3. Etiquete previamente los tubos de microcentrífuga para cada muestra de tejido y un tubo adicional que se utilizará para una extracción en blanco.
      PRECAUCIÓN: El CH 3OH y el CHCl3 son altamente volátiles y tóxicos si se inhalan. Úselo solo en campanas extractoras.
      NOTA: Las diferentes marcas de tubos de microcentrífuga tienen diferentes niveles de palmitato de fondo y capacidades en términos de prevención de fugas de solvente. Recomendamos que primero se analicen una variedad de tubos, para garantizar que se eviten fugas de solventes y que los tubos tengan niveles mínimos de palmitato contaminante. Véase Yao et al.32 para una discusión más detallada.
  2. Saque las muestras del congelador y colóquelas sobre hielo seco.
  3. Coloque el tubo de microcentrífuga preetiquetado en una balanza analítica y tara la balanza. Coloque unas pinzas y una hoja de afeitar de bisturí o acero sobre hielo seco durante 10-20 segundos para que se enfríe.
    1. Use las pinzas para sacar la muestra de tejido congelado del tubo y colocarla en un bote de pesaje de plástico. El bote de pesaje se puede colocar sobre un bloque plano de hielo seco u otra superficie preenfriada.
    2. Con el bisturí o la hoja de afeitar de acero, diseccione una pequeña porción del tejido, equivalente a 5-15 mg de peso. Coloque en el tubo de microcentrífuga y registre el peso exacto. Repita para cada espécimen. Las muestras se pueden almacenar en el congelador en este punto o se pueden avanzar a los pasos a continuación para la extracción de lípidos.
      NOTA: Asegúrese de que el bisturí se limpie adecuadamente con etanol al 70% entre las muestras y que se utilice un bote de pesaje nuevo entre cada muestra.
  4. Añadir 1 μL/mg de 10 mM de ácido hexadecenoico-d 31(C16:0-d31) a cada muestra.
    PRECAUCIÓN: Los siguientes pasos (5.4 a 5.8) deben llevarse a cabo bajo una campana extractora debido al riesgo de inhalación de los disolventes.
  5. Añadir 250 μL de CH 3 OH,250 μL deH2O y 500 μL deCHCl 3 a cada muestra con tres perlas de acero inoxidable de 5 mm. Coloque los tubos en un bloque preenfriado de un molino de molienda y mezcle las muestras a una frecuencia vibratoria de 25 Hz durante 5 minutos, o utilice las pautas recomendadas por el fabricante para las muestras de tejido. Retire las cuentas con un imán.
  6. Centrifugar las muestras a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C.
    NOTA: Después de la centrifugación, debe observarse una clara separación bifásica con la fase acuosa superior que contiene metabolitos polares y la fase orgánica inferior que contiene lípidos y ácidos grasos. Si no se observa ninguna separación, añadir 250 μL deH2O y repetir los pasos de vórtice y centrifugación.
  7. Con una micropipeta, tome un volumen fijo de la fase inferior de cada muestra en tubos de microcentrífuga marcados correspondientemente.
  8. Añadir 500 μL de CHCl3 a la muestra restante y repetir los pasos 5.6-5.7.
  9. Coloque las muestras bajo gas nitrógeno o en un vacío centrífugo refrigerado resistente a CHCl3 a 4 °C hasta que estén completamente secas. Las muestras secas pueden almacenarse a -20 °C hasta que estén listas para la derivatización.
    NOTA: La capa superior de cada muestra también puede recogerse en este punto y secarse como en el paso 5.9 para analizar los metabolitos polares.

6. Preparación de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) y análisis GCMS

  1. Esterificación y transesterificación catalizadas por ácido para preparar FAME
    PRECAUCIÓN: Los siguientes pasos deben llevarse a cabo bajo una campana extractora debido al riesgo de inhalación de los disolventes.
    1. Si las muestras se han almacenado en el congelador, séquelas con nitrógeno durante 5 minutos para asegurarse de que no haya agua.
    2. Con disolventes de grado MS, pipetee 98 ml de CH3OH anhidro en un frasco de vidrio para medios. Agregue lentamente 2 ml de ácido sulfúrico anhidro en la campana extractora para producir 2% H2SO4 en CH3OH. Mezcle girando la botella cerrada.
    3. Añadir 500 μL de solución de H 2 SO4 al2% en solución de CH3OH a cada muestra y vórtice brevemente.
    4. Incubar las muestras en un bloque térmico a 50 °C durante 2 h.
    5. Retire las muestras del bloque térmico y agregue 100 μL de solución saturada de NaCl y 500 μL de hexano a cada muestra.
    6. Agite vigorosamente las muestras a temperatura ambiente durante 1 min. Deje reposar las muestras durante 1 minuto; Dos fases deberían ser evidentes después de esto.
    7. Recoger la fase superior en un tubo de microcentrífuga nuevo (véase la nota de la sección 5.1.3 para la selección adecuada del tubo de microcentrífuga).
    8. Para maximizar el rendimiento, repita los pasos 6.1.5-6.1.7, recogiendo la segunda muestra en los mismos tubos etiquetados.
    9. Secar las muestras a temperatura ambiente bajo nitrógeno gaseoso.
    10. Vuelva a suspender las muestras en 20 μL/mg de hexano, en relación con el peso original del tejido, y transfiéralas inmediatamente a un vial de vidrio GC con un inserto de vidrio.
      NOTA: Trabaje rápidamente mientras transfiere muestras para minimizar la evaporación.
  2. Análisis GCMS
    1. Para determinar la abundancia de isótopos FAME, inyecte las muestras en un espectrómetro de masas de cromatografía de gases de un solo cuadrupolo (GCMS).
      NOTA: Si bien se pueden usar muchos tipos de columnas para detectar palmitato, se estableció el siguiente programa de temperatura para una columna GCMS que se ha desarrollado para la separación de isómeros cis/trans de ácidos grasos, como se detalla en la Tabla de materiales. Esta columna tiene una longitud de 50 m con un diámetro interior de 0,25 mm.
    2. Inyectar 1 μL de muestra en una entrada dividida/no dividida a una temperatura de entrada de 270 °C, utilizando helio como gas portador, fluyendo a 1 mL/min. Utilice una inyección sin división para ácidos grasos de baja abundancia con un flujo total de 19 ml/min, una purga septal de 3 ml/min y un flujo de purga a ventilación dividida de 15 ml/min a 0,75 min. Utilice una proporción dividida de 10:1-40:1 para ácidos grasos de alta abundancia como palmitato y oleato.
    3. Utilice los siguientes parámetros del horno: una temperatura inicial de 80 °C; incrementar en incrementos de 20 °C/min hasta 170 °C; aumentar en incrementos de 1 °C/min hasta 204 °C; aumentar en incrementos de 20 °C/min hasta 250 °C; y luego mantener a 250 °C durante 10 min.
    4. Utilice los siguientes parámetros del detector selectivo de masas (MSD): un modo de ionización por impacto de electrones de 70 eV y escanee en el rango de 50-400 m/z con una velocidad de escaneo de 1.562 (u/s) y una frecuencia de 4,1 escaneos/s. Utilice una línea de transferencia a 280 °C, una fuente de iones a 230 °C y un cuadrupolo a 150 °C.
      NOTA: Se pueden usar otras columnas, pero el programa de temperatura variará.
    5. Secuencia de la muestra: Aleatorice el orden de la muestra de inyección e inyecte al menos dos o tres blancos de hexano al principio de la secuencia, después de cada quinta muestra dentro de la secuencia, y dos o tres al final de la secuencia.
    6. Utilice un software específico del instrumento, o un software gratuito de acceso abierto como Metabolite-Detector33, para integrar los iones de la Tabla 1 para cada éster metílico de ácidos grasos.
      NOTA: Hemos descrito los iones que cubren los isótopos M1-M5 en la Tabla 1 que hemos encontrado que cubren la cantidad de incorporación de deuterio con esta ventana de etiquetado. Sin embargo, es posible que sea necesario ampliarlo si el flujo de novo es significativamente mayor y/o se utiliza un tiempo de etiquetado más largo.
    7. Utilice la abundancia de cada ion integrado para generar una distribución de isótopos de masa, donde las intensidades de iones se pueden convertir en abundancia fraccionaria de modo que la suma de la distribución de isótopos de masa sea igual a uno. Consulte la hoja de cálculo de ejemplo en el archivo complementario.
      NOTA: Para determinar con precisión la incorporación de deuterio, se debe emplear la corrección de la abundancia de isótopos naturales para tener en cuenta la presencia de isótopos naturales como 13C, 15N y 2H. Esto se realiza mediante la aplicación de una matriz de corrección como la descrita por Fernández et al.34,35, y no se puede realizar restando la MID de un metabolito medido no marcado de un metabolito marcado. En la práctica, recomendamos el uso de software de libre acceso como fluxfix36, polyMID37 o IsoCor38 para convertir los datos brutos en MID fraccionarios, y hemos proporcionado la fórmula para la corrección de isótopos para los productos de éster metílico de FAS en la Tabla 1.
    8. Para determinar la cantidad de palmitato presente, utilice la siguiente fórmula:
      figure-protocol-15354 
      donde el recuento de iones se refiere a la suma de todos los isótopos palmitatos integrados en la Tabla 1 y C16:0-d 31 se refiere al patrón interno hexadecenoico-d31. El patrón interno forma un pico separado al del palmitato endógeno. También se puede determinar la abundancia relativa de otros ácidos grasos, pero puede ser necesario emplear patrones internos de isótopos específicos de ácidos grasos (con desplazamientos de masa mayores que los observados a partir de la incorporación deD2O) o curvas estándar externas para una cuantificación completa. Utilice la muestra extraída en blanco para determinar la cantidad de palmitato de fondo y restarla del valor final del tejido.
    9. Calcule el enriquecimiento molar (EM) del palmitato mediante la siguiente ecuación:
      figure-protocol-16292
      donde Mi es la abundancia fraccionaria normalizada de un isótopo palmitado, y n es el número de posibles isótopos palmitados. Por ejemplo, la EM de una molécula de palmitato con la siguiente distribución fraccionaria, M1 = 0,25, M2 = 0,08, M3 = 0,02, es: (0,025*1) + (0,08*2) + (0,02*3) = 0,245 (Ver Archivo Suplementario).

7. Intercambio de acetona de deuterio de muestras de plasma para determinar el enriquecimiento de agua corporal

  1. Reacción
    1. Prepare 10 patrones de deuterio en agua, que van desde 0-9% v/v.
    2. Preparar una solución de acetona/acetonitrilo al 5 % v/v que permita 4 μl por muestra, incluidos los patrones del paso 5.1.1.
    3. En tubos de microcentrífuga marcados y con cierre seguro, combine 10 μl de cada muestra de plasma o patrón, 4 μl de NaOH 10 M y 4 μl de acetona/acetonitrilo al 5 %. Realice esto por triplicado para cada muestra.
    4. Mezcle las muestras suavemente pipeteando. Deje que las muestras se incuben a temperatura ambiente durante la noche.
  2. Extracción
    1. Después de la incubación, añadir 450-550 mg de Na2SO4 a cada muestra.
    2. En la campana extractora, añadir 600 μL de CHCl3 a cada tubo y vórtice vigorosamente durante 15 s.
    3. Centrifugar las muestras a 300 x g durante 2 min.
    4. Bajo una campana extractora, transfiera por triplicado 80 μL de alícuotas del sobrenadante de cada muestra a viales de vidrio GCMS etiquetados con insertos de vidrio y tapa hermética.
  3. Análisis GCMS
    1. Separe las muestras en una columna (30 m, 0,25 mm de diámetro interior, Agilent DB-35MS) y analícelas en el espectrómetro de masas adjunto.
      1. Inyectar 1 μL de muestra en una entrada dividida/no dividida, con una relación de división de 40:1, un flujo de helio de 1 mL/min y una temperatura de entrada de 270 °C.
      2. Utilice los siguientes parámetros del horno: una temperatura inicial de 60 °C, aumente en incrementos de 20 °C/min hasta 100 °C, aumente en incrementos de 50 °C/min hasta 220 °C y, a continuación, manténgalo a 220 °C durante 1 min.
      3. Utilice los siguientes parámetros del detector selectivo de masas (MSD): modo de ionización por impacto de electrones a 70 eV con monitoreo de iones seleccionados de 58 y 59 m/z. Utilice una línea de transferencia a 280 °C, una fuente de iones a 230 °C y un cuadrupolo a 150 °C.
        NOTA: Se pueden usar otras columnas de polaridad media, de bajo sangrado, adheridas, reticuladas, pero el programa de temperatura variará.
    2. Configure el método del muestreador de líquidos para que comience con un lavado CHCl 3 y luego una secuencia aleatoria de las muestras, incluidos pasos adicionales de lavado CHCl3 cada seis muestras.
      NOTA: Si se usa acetona como lavado con aguja para el muestreador automático, reemplácelo con CHCl 3 o hexano e inyecte varias muestras de CHCl3 en blanco hasta que ya no sea evidente ningún pico de acetona contaminante en el cromatograma.
    3. Con este método, un pico de acetona eluye alrededor de 1,25 min. Integre los datos y calcule la abundancia fraccionaria de enriquecimiento de acetona siguiendo los pasos 6.2.6-6.2.7, con un ajuste para analizar los picos que contienen una relación m/z de 58-60 como se indica en la Tabla 1.
    4. Utilice los patrones para generar una curva estándar para determinar el porcentaje de enriquecimiento de agua corporal (p) de las muestras de prueba, basado en el enriquecimiento fraccionado de acetona.

8. Cálculos de lipogénesis in vivo de novo

  1. Calcule la fracción de ácidos grasos recién sintetizados (FNS) que son productos directos de FAS (es decir, palmitato, ácidos grasos de cadena impar y mmBCFA) en cada muestra con la siguiente ecuación:
    figure-protocol-20427
    donde ME es el enriquecimiento molar medio de una molécula de palmitato (paso 6.2.9), p es el enriquecimiento de deuterio en agua de la muestra de plasma correspondiente (paso 7.3.4) y N es el número de átomos de hidrógeno intercambiables en el palmitato en el que se puede incorporar un deuterio.
  2. Determine N utilizando la siguiente ecuación establecida por Lee et al.31:
    figure-protocol-20944
  3. Determinar la cantidad molar de ácidos grasos recién sintetizados (MNS) mediante:
    MNS = FNS x cantidad total de ácidos grasos (nmol/mg tisular).
    NOTA: Por ejemplo, si se obtiene un enriquecimiento molar de palmitato (EM) de 0,245, un enriquecimiento de deuterio en agua corporal (p) de 0,045 y un número N calculado de 22, la síntesis fraccional de palmitato es de 0,247. Si la cantidad de palmitato presente en el tejido es de 2 mmol/mg, entonces el mmol del palmitato recién sintetizado es de 0,494 mmol/mg (ver Ficha Suplementaria).

Resultados

Basándonos en la dosificación deD2O descrita en el paso 1, normalmente encontramos que el agua corporal está enriquecida en el rango del 2,5% al 6%, y que un nivel basal de enriquecimiento de deuterio en el agua corporal se alcanza rápidamente en 1 h y se mantiene durante la duración del estudio a través del agua potable enriquecida al 8% (Figura 1). El enriquecimiento continuo de agua corporal en estado estacionario es una suposición de los cálculos utilizados en...

Discusión

Comprender el equilibrio y la interacción entre vías metabólicas complejas es un paso indispensable hacia la comprensión de las bases biológicas de las enfermedades relacionadas con el metabolismo. Aquí, mostramos una metodología no invasiva y económica para determinar los cambios en la síntesis de novo de ácidos grasos. Este método es una adaptación de métodos publicados anteriormente que desarrollaron cálculos para estimar el flujo de síntesis de novo a partir del enriquecimiento de deuterio de ...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a los miembros del laboratorio Sanchez-Gurmaches y Wallace por sus valiosas discusiones. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Asociación Americana del Corazón (18CDA34080527 a JSG y 19POST34380545 a RM), los NIH (R21OD031907 a JSG), un Premio del Consejo de Administración del CCHMC, un Premio del Centro de Genómica Pediátrica del CCHMC y un Premio del Centro de Genómica y Terapéutica Mendeliana del CCHMC. Este trabajo fue financiado en parte por el DK078392 P30 de los NIH del Centro Central de Investigación de Enfermedades Digestivas en Cincinnati. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. RT y MW contaron con el apoyo de una beca UCD Ad Astra.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
4 mL Glass VialsFisher Scientific14-955-334
0.2 µm filterOlympus Plastic25-244
26G needeled syringesBD309597
AcetoneMerck34850
AcetonitrileMerck900667
Blue GC screw cap with septaAgilent5190-1599
CentrifugeEppendorf5424R
ChloroformSigma366927
Deuterium oxideSigma151882
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT)
Select FAME Column		MerckB1378
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT)
Select FAME Column		AgilentCP7419
EDTA tubeSarstedt411395105
EthanolMerck51976
Hexadecenoic-d31 AcidLarodan71-1631
HexaneMerck34859
MethanolMerck34860
Microcentrifuge tubeOlympus Plastic24-282
Mouse environmental chamberCaronCaron 7001-33
Potasium ChlorideFisher BioreagentsBP366-500
Potasium PhosphateMP Biomedicals194727
SafeLock microcentrifuge tubesEppendorf30120086
Screw top amber GC vialAgilent5182-0716
Sodium ChlorideFisher BioreagentsBP358-212
Sodium HydroxideMerckS5881
Sodium Phosphate, dibasicFisher BioreagentsBP332-500
Sodium SulfateMerck239313
Sulfuric AcidMerck258105
Vial insertAgilent5183-2088

Referencias

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