Détermination quantitative de la synthèse d’acides gras de novo dans le tissu adipeux brun à l’aide d’oxyde de deutérium

Résumé

Nous présentons ici une méthode quantitative peu coûteuse utilisant l’oxyde de deutérium et la chromatographie en phase gazeuse par spectrométrie de masse (GCMS) pour l’analyse de la lipogenèse de novo des acides gras totaux dans le tissu adipeux brun in vivo.

Résumé

La synthèse des acides gras est une voie métabolique complexe et très énergivore qui joue un rôle fonctionnel important dans le contrôle de l’homéostasie métabolique du corps entier et d’autres processus physiologiques et pathologiques. Contrairement à d’autres voies métaboliques clés, telles que l’élimination du glucose, la synthèse des acides gras n’est pas systématiquement évaluée fonctionnellement, ce qui conduit à des interprétations incomplètes de l’état métabolique. De plus, il n’existe pas de protocoles détaillés accessibles au public et adaptés aux nouveaux arrivants dans le domaine. Nous décrivons ici une méthode quantitative peu coûteuse utilisant l’oxyde de deutérium et la chromatographie en phase gazeuse par spectrométrie de masse (GCMS) pour l’analyse de la synthèse de novo d’acides gras totaux dans le tissu adipeux brun in vivo. Cette méthode mesure la synthèse des produits de la synthase d’acide gras indépendamment d’une source de carbone, et elle est potentiellement utile pour pratiquement tous les tissus, dans n’importe quel modèle de souris, et sous n’importe quelle perturbation externe. Des détails sur la préparation de l’échantillon pour le SMGC et les calculs en aval sont fournis. Nous nous concentrons sur l’analyse de la graisse brune en raison de ses niveaux élevés de synthèse d’acides gras de novo et de son rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie métabolique.

Introduction

L’obésité et les maladies métaboliques associées sont une pandémie qui met en danger les générations actuelles et futures ^1,2. Communément simplifié comme la conséquence du déséquilibre entre l’apport et la dépense énergétique, le dérèglement métabolique associé à l’obésité affecte un grand nombre de voies métaboliques contrôlées par des facteurs environnementaux et^endogènes3. Cependant, seules quelques voies sont systématiquement testées dans des modèles animaux de dérégulation métabolique.

À titre d’exemple, l’élimination du glucose est régulièrement mesurée par des tests de tolérance au glucose et à l’insuline, probablement en raison de la simplicité d’utilisation des glucomètres portables⁴. Les taux relatifs d’oxydation du glucose et des lipides dans l’ensemble du corps sont également estimés de manière routinière sur la base du rapport d’échange respiratoire à partir d’essais calorimétriques indirects ^5,6. Cependant, la majorité de tous les autres aspects du métabolisme ne sont pas systématiquement évalués fonctionnellement. Cela conduit à des interprétations incomplètes de l’état métabolique et à des options thérapeutiques manquées. L’une de ces principales voies est la lipogenèse de novo.

La lipogenèse de novo (DNL) est le processus par lequel de nouveaux acides gras sont générés à partir de précurseurs. Le glucose est considéré comme le principal précurseur contribuant à la DNL⁷ du corps entier, mais d’autres précurseurs, tels que l’acétate, le fructose, le lactate et les acides aminés à chaîne ramifiée, se sont avérés être des sources de carbone pertinentes d’une manière dépendante de l’espace et de l’état 8,9,10,11,12. Le DNL est un contributeur clé à l’homéostasie métabolique et est essentiel au développement normal¹³. De plus, des altérations de la DNL ont été associées au cancer 14,15 et métabolique 16,17,18 et aux maladies cardiovasculaires ^19,20.

La voie DNL est composée des composants enzymatiques de base ATP citrate lyase (ACLY), acétyl-CoA carboxylase (ACC1/2) et acide gras synthase (FAS) qui produisent principalement du palmitate, un acide gras saturé à 16 carbones. Cependant, les acides gras à chaîne impaire et à chaîne ramifiée peuvent également être produits à des taux plus faibles⁹. Les élongases et les désaturases modifient davantage ces acides gras, créant une gamme diversifiée d’espèces d’acides gras utiles à diverses fonctions (par exemple, le stockage d’énergie à long terme et la manipulation de la fluidité membranaire).

L’expression de la machinerie enzymatique DNL est contrôlée par un petit nombre de facteurs de transcription. Les plus bien décrites à ce jour comprennent la famille des protéines de liaison aux éléments régulateurs des stérols (SREBP), la protéine de liaison aux éléments de réponse glucidique (ChREBP) et le récepteur X du foie (LXR)21,22,23,24,25,26. Malgré un chevauchement apparent de leurs fonctions, des régulations individuelles basées sur la dominance du type cellulaire et les conditions physiologiques ou pathologiques ont été rapportées^21,22,27,28.

Fait remarquable, un certain nombre d’inhibiteurs de certaines étapes de la voie DNL ont été approuvés pour une utilisation clinique ou sont à des stades précliniques ou cliniques de développement pour un certain nombre de maladies, notamment l’obésité, la stéatose hépatique non alcoolique/stéatohépatite non alcoolique (NAFLD/NASH) et les maladies cardiovasculaires²⁹. Ces efforts mettent en évidence la pertinence de la DNL dans le domaine de la santé et de la maladie.

Au cours des dernières années, l’utilisation de méthodes d’évaluation quantitative de la synthèse des acides gras de novo a augmenté³⁰. La méthode la plus courante pour évaluer cela est l’utilisation d’eau lourde marquée (D₂O), où l’hydrogène lourd marqué est incorporé dans des chaînes acyle lors de la synthèse à la fois directement et indirectement, via l’échange de deutérium avec les hydrogènes des substrats DNL NAPDH, acétyl-CoA et malonyl-CoA. Bien que cette approche gagne en popularité, il y a un manque de protocoles détaillés accessibles au public et adaptés aux nouveaux arrivants dans le domaine. Nous décrivons ici une méthode d’évaluation quantitative de la synthèse de novo des produits du SAF à l’aide du D₂O et de la chromatographie en phase gazeuse par spectrométrie de masse (GCMS), avec des calculs précédemment développés par Lee et ^al.31. Cette méthode mesure la synthèse d’acides gras de novo indépendamment d’une source de carbone, et elle est potentiellement utile pour pratiquement tous les tissus, dans n’importe quel modèle murin et sous n’importe quelle perturbation externe. Ici, nous nous concentrons sur l’analyse du tissu adipeux brun (BAT) en raison de ses niveaux élevés de DNL et de son rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie métabolique.

Protocole

Toutes les expériences ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du centre médical de l’hôpital pour enfants de Cincinnati.

1. Préparation du D₂O

REMARQUE : Pour éviter les variations expérimentales, préparez suffisamment de solution / d’eau potable pour toutes les souris pendant toute la durée de l’expérience.

1. Pour l’injection intrapéritonéale : générer 0,9 % p/v de solution saline D 2 O en dissolvant 9 g de NaCl par litre deD 2 O. Filtrer à travers un filtre apyrogène de_0,2μm pour stériliser.
2. Pour boire de l’eau D 2 O : produire 8 % v/v d 2 d’eau enrichie en O à utiliser comme eau potable en mélangeant 80 mL deD₂O par 920 mL d’eau potable ordinaire. De l’eau potable ordinaire peut être obtenue auprès de l’installation de souris. Filtrer à travers un filtre apyrogène de 0,2 μm pour stériliser.

2. Modulation de l’activité des MTD par acclimatation à la température

1. Séparez les souris de manière à ce qu’il y ait deux souris par cage 2 semaines avant le début de l’acclimatation à la température. Changez l’alimentation en eau pour que les souris s’adaptent et maintiennent toutes les cages à 22 °C.
2. Préparez les chambres environnementales de la souris 1 semaine avant le début de l’acclimatation à la température en réglant les températures appropriées : 30 °C pour la thermoneutralité, 22 °C pour la température ambiante et 18 °C pour l’exposition au froid.
3. Au début de l’acclimatation à la température, remplacez les cages par des cages neuves sans enrichissement de l’environnement (pour éviter les nids). Déplacez les cages à leurs températures respectives.
   REMARQUE : Les cages affectées à la thermoneutralité resteront à 30 °C pendant 4 semaines. Les cages assignées à la température ambiante resteront à 22 °C pendant 4 semaines. Les cages affectées à l’exposition au froid deviendront progressivement plus froides selon un horaire hebdomadaire : 18 °C pour la première semaine, 14 °C pour la deuxième semaine, 10 °C pour la troisième semaine et 6 °C pour la quatrième semaine.
4. Changez les cages souillées chaque semaine pour toutes les conditions. De plus, remplacez les bouteilles de nourriture et d’eau par des bouteilles neuves préadaptées à la température appropriée pendant au moins 24 h.
   REMARQUE : Faites attention aux quantités de nourriture ajoutées chaque semaine, en particulier pour les souris froides, car elles consommeront une quantité de nourriture nettement plus importante par rapport aux conditions normales. Fournir de la nourriture ad libitum.

3. Administration du D₂O

1. Injecter à chaque animal une solution saline à 0,9 % p/v-D₂O à 35 μL/g de poids corporel, 12 h à 3 jours avant le prélèvement tissulaire, par injection intrapéritonéale à l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une aiguille de 26 G.
   REMARQUE : Veuillez consulter la section de discussion pour plus d’informations sur le choix d’un moment d’étiquetage approprié.
2. Remplacez les bouteilles d’eau par des bouteilles contenant 8 % v/_{v d’eau}potable enrichie en O D2.

4. Prélèvement, traitement et stockage du plasma et des tissus

1. À la fin de l’expérience, sacrifiez les souris en utilisant des méthodologies approuvées (par exemple, surdosage de dioxyde de carbone suivi d’une luxation cervicale).
   1. Utilisez des coussinets chauffants ou froids ou d’autres méthodes pour éviter les changements brusques de température avant l’euthanasie qui pourraient affecter les résultats. Euthanasier les souris selon les méthodologies approuvées. Procéder immédiatement au prélèvement de sang et de tissus.
2. Prélever du sang par ponction cardiaque à l’aide d’une aiguille de 26 G et le conserver dans un tube de prélèvement sanguin à base d’acide éthylènediaminetétraacétique. Gardez le sang sur la glace jusqu’à ce que le traitement soit terminé.
3. Coupez la peau le long de la ligne médiane du dos de la souris, de la zone inférieure de la cavité thoracique jusqu’à la zone supérieure du cou, tout en tirant la peau vers le haut pour éviter d’affecter les tissus sous la peau. La MTD interscapulaire est située entre les omoplates sous une fine couche de tissu adipeux blanc, et elle est composée de deux lobes de forme pyramidale.
   1. Nettoyez le tissu en le lavant dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée. Tamponnez sur une serviette en papier pour éliminer l’excès de liquide, pesez sur une balance analytique et collectez dans un microtube.
   2. Congeler immédiatement les tissus à l’aide d’azote liquide. D’autres dépôts BAT peuvent également être collectés.
4. Centrifuger les échantillons de sang à 10 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Après la centrifugation, prélevez soigneusement le plasma sans perturber la pastille de globules rouges. Transférez-le dans un nouveau microtube glacé et congelez-le rapidement dans de l’azote liquide.
5. Conservez les échantillons de graisse brune et de plasma à -80 °C jusqu’à utilisation.

5. Extraction des lipides du tissu adipeux

1. Avant de commencer l’extraction
   1. Préparer une solution de 1 mM d’acide hexadénoïque-d₃₁ dans du méthanol dans un flacon en verre. Cela servira d’étalon interne d’acides gras.
   2. Pré-refroidir la quantité requise de chloroforme (_CHCl 3) et de méthanol (CH₃OH) dans un congélateur à -80 °C ou sur de la glace carbonique.
      REMARQUE : Le di-tert-butyl-4-méthylphénol (BHT) antioxydant peut être ajouté au_{CHCl 3} à une concentration de 0,01 % p/v (2,5 mg/25 mL) pour prévenir l’oxydation des doubles liaisons dans les acides gras insaturés.
   3. Pré-étiqueter les tubes de microcentrifugation pour chaque échantillon de tissu et un tube supplémentaire à utiliser pour une extraction à blanc.
      ATTENTION : Le CH 3OH et le CHCl₃ sont très volatils et toxiques s’ils sont inhalés. Utiliser uniquement dans les hottes.
      REMARQUE : Différentes marques de tubes de microcentrifugation ont des niveaux différents de palmitate de fond et des capacités en termes de prévention des fuites de solvant. Nous recommandons qu’une variété de tubes soient d’abord testés, afin de s’assurer que les fuites de solvant sont évitées et que les tubes ont des niveaux minimaux de palmitate contaminant. Voir Yao et ^al.32 pour plus de détails.
2. Sortez les échantillons du congélateur et placez-les sur de la glace sèche.
3. Placez le tube de microcentrifugation pré-étiqueté sur une balance d’analyse et tarez la balance. Placez une pince à épiler et un scalpel/lame de rasoir en acier sur de la glace carbonique pendant 10 à 20 s pour refroidir.
   1. Utilisez la pince à épiler pour retirer l’échantillon de tissu congelé du tube et placez-le sur un bateau de pesée en plastique. Le bateau de pesée peut être placé sur un bloc plat de glace carbonique ou sur une autre surface pré-refroidie.
   2. À l’aide du scalpel ou de la lame de rasoir en acier, disséquez une petite partie du tissu, équivalant à 5 à 15 mg de poids. Placez-le dans le tube de la microcentrifugeuse et notez le poids exact. Répétez l’opération pour chaque échantillon. Les échantillons peuvent être conservés au congélateur à ce stade ou peuvent être avancés aux étapes ci-dessous pour l’extraction des lipides.
      REMARQUE : Assurez-vous que le scalpel est correctement nettoyé avec de l’éthanol à 70% entre les échantillons et qu’un nouveau bateau de pesée est utilisé entre chaque échantillon.
4. Ajouter 1 μL/mg d’acide hexadécénoïque-d 31(C16 :0-j₃₁) de 10 mM à chaque échantillon.
   ATTENTION : Les étapes suivantes (5.4 à 5.8) doivent être effectuées sous une hotte en raison du risque d’inhalation des solvants.
5. Ajouter 250 μL de_CH3OH, 250 μL de H₂O et 500 μL de CHCl₃ à chaque échantillon à l’aide de trois billes d’acier inoxydable de 5 mm. Placez les tubes dans un bloc pré-refroidi d’un broyeur et mélangez les échantillons à une fréquence de vibration de 25 Hz pendant 5 min, ou utilisez les directives recommandées par le fabricant pour les échantillons de tissus. Retirez les perles à l’aide d’un aimant.
6. Centrifuger les échantillons à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
   REMARQUE : Après centrifugation, une séparation biphasique claire doit être observée avec la phase aqueuse supérieure contenant des métabolites polaires et la phase organique inférieure contenant des lipides et des acides gras. Si aucune séparation n’est observée, ajouter 250 μL de H₂O et répéter les étapes de vortex et de centrifugation.
7. À l’aide d’une micropipette, prélevez un volume fixe de la phase inférieure de chaque échantillon dans des tubes de microcentrifugation étiquetés en conséquence.
8. Ajouter 500 μL de CHCl₃ au reste de l’échantillon et répéter les étapes 5.6 à 5.7.
9. Placez les échantillons sous azote gazeux ou dans un vide centrifuge réfrigéré résistant au CHCl₃ à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient complètement secs. Les échantillons séchés peuvent être conservés à -20 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être dérivés.
   REMARQUE : La couche supérieure de chaque échantillon peut également être prélevée à ce stade et séchée comme à l’étape 5.9 afin d’analyser les métabolites polaires.

6. Préparation des esters méthyliques d’acides gras (EMAG) et analyse du SMGC

1. Estérification et transestérification catalysées par l’acide pour préparer les EMAG
   ATTENTION : Les étapes suivantes doivent être effectuées sous une hotte en raison du risque d’inhalation des solvants.
   1. Si les échantillons ont été conservés au congélateur, séchez-les sous azote pendant 5 minutes pour vous assurer qu’il n’y a pas d’eau.
   2. À l’aide de solvants de qualité MS, pipeter 98 mL de CH₃OH anhydre dans un flacon en verre. Ajouter lentement 2 mL d’acide sulfurique anhydre dans la hotte pour obtenir 2 % H₂SO₄ dans CH₃OH. Mélangez en faisant tourner la bouteille fermée.
   3. Ajouter 500 μL de solution 2% H₂SO₄ dans CH₃OH à chaque échantillon et tourbillonner brièvement.
   4. Incuber les échantillons sur un bloc chauffant à 50 °C pendant 2 h.
   5. Retirez les échantillons du bloc chauffant et ajoutez 100 μL de solution saturée de NaCl et 500 μL d’hexane à chaque échantillon.
   6. Faire tourner les échantillons vigoureusement à température ambiante pendant 1 min. Laisser reposer les échantillons pendant 1 min ; Deux phases devraient être apparentes après cela.
   7. Recueillir la phase supérieure dans un nouveau tube de microcentrifugation (voir la note de la section 5.1.3 pour le choix approprié du tube de microcentrifugation).
   8. Pour maximiser le rendement, répétez les étapes 6.1.5 à 6.1.7, en prélevant le deuxième échantillon dans les mêmes tubes étiquetés.
   9. Séchez les échantillons à température ambiante sous azote gazeux.
   10. Remettre les échantillons en suspension dans 20 μL/mg d’hexane, par rapport au poids du tissu d’origine, et transférer immédiatement dans un flacon de GC en verre avec un insert en verre.
       REMARQUE : Travaillez rapidement lors du transfert des échantillons pour minimiser l’évaporation.
2. Analyse du SMGC
   1. Pour déterminer l’abondance des isotopologues de l’EMAG, injecter les échantillons sur un seul spectromètre de masse quadripolaire de chromatographie en phase gazeuse (GCMS).
      NOTA : Bien que de nombreux types de colonnes puissent être utilisés pour détecter le palmitate, le programme de température suivant a été établi pour une colonne GCMS qui a été développée pour la séparation des isomères cis/trans d’acides gras, comme indiqué dans le tableau des matériaux. Cette colonne a une longueur de 50 m avec un diamètre intérieur de 0,25 mm.
   2. Injecter 1 μL d’échantillon dans une entrée fendue/non fendue à une température d’entrée de 270 °C, en utilisant de l’hélium comme gaz porteur, s’écoulant à 1 mL/min. Utiliser une injection sans fente pour les acides gras peu abondants avec un débit total de 19 mL/min, une purge du septum de 3 mL/min et un débit de purge vers l’évent fendu de 15 mL/min à 0,75 min. Utilisez un rapport de répartition de 10 :1-40 :1 pour les acides gras très abondants tels que le palmitate et l’oléate.
   3. Utiliser les paramètres suivants du four : une température initiale de 80 °C ; augmenter par incréments de 20 °C/min jusqu’à 170 °C ; augmenter par incréments de 1 °C/min jusqu’à 204 °C ; augmenter par incréments de 20 °C/min jusqu’à 250 °C ; puis maintenir à 250 °C pendant 10 min.
   4. Utilisez les paramètres de détecteur sélectif de masse (MSD) suivants : un mode d’ionisation par impact d’électrons de 70 eV et balayez sur une plage de 50 à 400 m/z avec une vitesse de balayage de 1 562 (u/s) et une fréquence de 4,1 balayages/s. Utilisez une ligne de transfert à 280 °C, une source d’ions à 230 °C et un quadripôle à 150 °C.
      REMARQUE : D’autres colonnes peuvent être utilisées, mais le programme de température variera.
   5. Séquence d’échantillonnage : Randomiser l’ordre d’injection de l’échantillon et injecter au moins deux ou trois blancs d’hexane au début de la séquence, après chaque cinquième échantillon dans la séquence, et deux ou trois à la fin de la séquence.
   6. Utilisez un logiciel spécifique à l’instrument, ou un logiciel gratuit en libre accès tel que Metabolite-Detector³³, pour intégrer les ions du tableau 1 pour chaque ester méthylique d’acide gras.
      REMARQUE : Nous avons décrit les ions qui couvrent les isotopologues M1-M5 dans le tableau 1 qui, selon nous, couvre la quantité d’incorporation de deutérium avec cette fenêtre d’étiquetage. Cependant, il peut être nécessaire de l’étendre si le flux de novo est significativement plus élevé et/ou si un temps d’étiquetage plus long est utilisé.
   7. Utilisez l’abondance de chaque ion intégré pour générer une distribution isotopomère de masse, où les intensités ioniques peuvent être converties en abondance fractionnaire de sorte que la somme de la distribution isotopomère de masse soit égale à un. Veuillez consulter l’exemple de feuille de calcul dans le fichier supplémentaire.
      NOTA : Afin de déterminer avec précision l’incorporation du deutérium, il faut ensuite corriger l’abondance des isotopes naturels pour tenir compte de la présence d’isotopes naturels tels que ¹³C, ¹⁵N et ²H. Ceci est réalisé en appliquant une matrice de correction comme indiqué par Fernandez et al.34,35^, et ne peut pas être effectué en soustrayant le MID d’un métabolite mesuré non marqué d’un métabolite marqué. En pratique, nous recommandons l’utilisation de logiciels disponibles gratuitement tels que fluxfix 36, polyMID³⁷ ou IsoCor³⁸ pour transformer les données brutes en MID fractionnaires, et nous avons fourni la formule de correction isotopique pour les produits à base d’ester méthylique du SAF dans le tableau 1.
   8. Pour déterminer la quantité de palmitate présente, utilisez la formule suivante :
       
      où le nombre d’ions fait référence à la somme de tous les isotopologues du palmitate intégrés dans le tableau 1 et C16 :0-d 31 fait référence à l’étalon interne hexadénoïque-d₃₁. L’étalon interne forme un pic distinct de celui du palmitate endogène. L’abondance relative d’autres acides gras peut également être déterminée, mais il peut être nécessaire d’utiliser des étalons internes d’isotopes spécifiques aux acides gras (avec des décalages de masse supérieurs à ceux observés lors de l’incorporation de D₂O) ou des courbes d’étalons externes pour une quantification complète. Utilisez l’échantillon vierge extrait pour déterminer la quantité de palmitate de fond et soustrayez-la de la valeur tissulaire finale.
   9. Calculer l’enrichissement molaire (EM) du palmitate par l’équation suivante :
      
      où M_i est l’abondance fractionnaire normalisée d’un isotopologue palmité, et n est le nombre d’isotopologues palmités possibles. Par exemple, l’EM d’une molécule de palmitate avec la distribution fractionnaire suivante, M1 = 0,25, M2 = 0,08, M3 = 0,02, est : (0,025*1) + (0,08*2) + (0,02*3) = 0,245 (voir le fichier supplémentaire).

7. Échange d’acétone de deutérium d’échantillons de plasma pour déterminer l’enrichissement en eau corporelle

1. Réaction
   1. Préparer 10 étalons de deutérium dans l’eau, allant de 0 à 9 % v/v.
   2. Préparer une solution d’acétone/acétonitrile à 5 % v/v en tenant compte de 4 μL par échantillon, y compris les étalons de l’étape 5.1.1.
   3. Dans des tubes de microcentrifugation étiquetés et sécurisés, mélanger 10 μL de chaque échantillon de plasma ou étalon, 4 μL de NaOH 10 M et 4 μL d’acétone/acétonitrile à 5 %. Effectuez cette opération en trois exemplaires pour chaque échantillon.
   4. Mélangez délicatement les échantillons par pipetage. Laissez les échantillons incuber à température ambiante pendant la nuit.
2. Extraction
   1. Après incubation, ajouter 450 à 550 mg de Na₂SO₄ à chaque échantillon.
   2. Dans la hotte, ajouter 600 μL de CHCl₃ dans chaque tube et faire tourbillonner vigoureusement pendant 15 s.
   3. Centrifuger les échantillons à 300 x g pendant 2 min.
   4. Sous une hotte, transférer en trois exemplaires des aliquotes de 80 μL du surnageant de chaque échantillon dans des flacons GCMS en verre étiquetés avec des inserts en verre et un bouchon hermétique.
3. Analyse du SMGC
   1. Séparez les échantillons sur une colonne (30 m, 0,25 mm de diamètre intérieur, Agilent DB-35MS) et analysez-les sur le spectromètre de masse attaché.
      1. Injecter 1 μL d’échantillon dans une entrée divisée/non divisée, avec un rapport de division de 40 :1, un débit d’hélium de 1 mL/min et une température d’entrée de 270 °C.
      2. Utilisez les paramètres suivants du four : une température initiale de 60 °C, augmenter par incréments de 20 °C/min jusqu’à 100 °C, augmenter de 50 °C/min jusqu’à 220 °C, puis maintenir à 220 °C pendant 1 min.
      3. Utilisez les paramètres de détecteur sélectif de masse (MSD) suivants : mode d’ionisation par impact d’électrons à 70 eV avec surveillance ionique sélective de 58 et 59 m/z. Utilisez une ligne de transfert à 280 °C, une source d’ions à 230 °C et un quadripôle à 150 °C.
         REMARQUE : D’autres colonnes à faible purge, collées, réticulées et à polarité moyenne peuvent être utilisées, mais le programme de température variera.
   2. Réglez la méthode de l’échantillonneur liquide pour commencer par un lavage CHCl 3, puis une séquence aléatoire des échantillons, y compris des étapes de lavage_{CHCl 3} supplémentaires tous les six échantillons.
      REMARQUE : Si l’acétone est utilisée comme lavage à l’aiguille pour l’échantillonneur automatique, remplacez-la par du CHCl 3 ou de l’hexane et injectez plusieurs échantillons blancs de_{CHCl 3} jusqu’à ce que tout pic d’acétone contaminant ne soit plus évident dans le chromatogramme.
   3. En utilisant cette méthode, un pic d’acétone élue à environ 1,25 min. Intégrer les données et calculer l’abondance fractionnaire de l’enrichissement en acétone en suivant les étapes 6.2.6 à 6.2.7, avec un ajustement pour analyser les pics contenant un rapport m/z de 58-60 comme indiqué dans le tableau 1.
   4. Utilisez les étalons pour générer une courbe standard afin de déterminer le pourcentage d’enrichissement en eau corporelle (p) des échantillons d’essai, en fonction de l’enrichissement fractionné de l’acétone.

8. Calculs de lipogenèse in vivo de novo

1. Calculer la fraction d’acides gras nouvellement synthétisés (FNS) qui sont des produits directs du SAF (c.-à-d. palmitate, acides gras à chaîne impaire et mmBCFA) dans chaque échantillon à l’aide de l’équation suivante :
   
   où ME est l’enrichissement molaire moyen d’une molécule de palmitate (étape 6.2.9), p est l’enrichissement en deutérium dans l’eau à partir de l’échantillon de plasma correspondant (étape 7.3.4) et N est le nombre d’atomes d’hydrogène échangeables sur le palmitate où un deutérium peut être incorporé.
2. Déterminer N à l’aide de l’équation ci-dessous qui a été établie par Lee et ^al.31 :
   
3. Déterminer la quantité molaire d’acides gras nouvellement synthétisés (MNS) en :
   MNS = FNS x quantité totale d’acides gras (nmol/mg de tissu).
   REMARQUE : Par exemple, si l’on obtient un enrichissement molaire en palmitate (EM) de 0,245, un enrichissement en deutérium dans l’eau corporelle (p) de 0,045 et un nombre N calculé de 22, la synthèse fractionnée du palmitate est de 0,247. Si la quantité de palmitate présente dans le tissu est de 2 mmol/mg, alors la mmol du palmitate nouvellement synthétisé est de 0,494 mmol/mg (voir Fichier supplémentaire).

Résultats

Sur la base de la dose de D 2 O décrite à l’étape 1, nous constatons généralement que l’eau corporelle est enrichie de l’ordre de_2,5% à 6 % et qu’un niveau de base d’enrichissement en deutérium dans l’eau corporelle est rapidement atteint en 1 h et maintenu pendant toute la durée de l’étude via de l’eau potable enrichie à 8 % (Figure 1). L’enrichissement continu en eau corporelle à l’état d’équilibre est une hypothèse des calculs utilis...

Discussion

Comprendre l’équilibre et l’interaction entre des voies métaboliques complexes est une étape indispensable pour comprendre les bases biologiques des maladies métaboliques. Ici, nous montrons une méthodologie non invasive et peu coûteuse pour déterminer les changements dans la synthèse des acides gras de novo. Cette méthode est adaptée de méthodes publiées antérieurement qui ont mis au point des calculs pour estimer le flux de synthèse de novo à partir de l’enrichissement en deutéri...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 mL Glass Vials	Fisher Scientific	14-955-334
0.2 µm filter	Olympus Plastic	25-244
26G needeled syringes	BD	309597
Acetone	Merck	34850
Acetonitrile	Merck	900667
Blue GC screw cap with septa	Agilent	5190-1599
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Chloroform	Sigma	366927
Deuterium oxide	Sigma	151882
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) Select FAME Column	Merck	B1378
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) Select FAME Column	Agilent	CP7419
EDTA tube	Sarstedt	411395105
Ethanol	Merck	51976
Hexadecenoic-d31 Acid	Larodan	71-1631
Hexane	Merck	34859
Methanol	Merck	34860
Microcentrifuge tube	Olympus Plastic	24-282
Mouse environmental chamber	Caron	Caron 7001-33
Potasium Chloride	Fisher Bioreagents	BP366-500
Potasium Phosphate	MP Biomedicals	194727
SafeLock microcentrifuge tubes	Eppendorf	30120086
Screw top amber GC vial	Agilent	5182-0716
Sodium Chloride	Fisher Bioreagents	BP358-212
Sodium Hydroxide	Merck	S5881
Sodium Phosphate, dibasic	Fisher Bioreagents	BP332-500
Sodium Sulfate	Merck	239313
Sulfuric Acid	Merck	258105
Vial insert	Agilent	5183-2088