小鼠粪便分离和微生物群移植

摘要

这里的目标是概述一个方案，以研究心血管疾病中生态失调的机制。本文讨论了如何无菌收集和移植鼠粪便样本，分离肠道，并使用"Swiss-roll"方法，然后使用免疫染色技术来询问胃肠道的变化。

摘要

肠道微生物群失调在心血管和代谢紊乱的病理生理学中起作用，但其机制尚不清楚。粪便微生物群移植（FMT）是描述总微生物群或分离物种在疾病病理生理学中的直接作用的宝贵方法。对于复发性 艰难梭菌 感染患者来说，这是一种安全的治疗选择。临床前研究表明，操纵肠道微生物群是研究生态失调与疾病之间机制联系的有用工具。粪便微生物群移植可能有助于阐明用于管理和治疗心脏代谢疾病的新型肠道微生物群靶向疗法。尽管啮齿动物的成功率很高，但仍存在与移植相关的翻译变化。这里的目标是为研究肠道微生物组在实验性心血管疾病中的作用提供指导。在本研究中，描述了小鼠研究中粪便微生物群的收集、处理、处理和移植的详细方案。描述了人类和啮齿动物捐赠者的收集和处理步骤。最后，我们描述了使用瑞士滚动和免疫染色技术的组合来评估心血管疾病的肠道特异性形态和完整性变化以及相关的肠道微生物群机制。

引言

心脏代谢紊乱，包括心脏病和中风，是全球主要死亡原因¹。缺乏身体活动、营养不良、年龄增长和遗传因素调节这些疾病的病理生理学。越来越多的证据支持肠道微生物群影响心血管和代谢紊乱的概念，包括2型糖尿病²，肥胖³和高血压⁴，这可能是开发这些疾病新治疗方法的关键。

微生物群引起疾病的确切机制仍然未知，目前的研究差异很大，部分原因是方法学差异。粪便微生物群移植（FMT）是描述总微生物群或分离物种在疾病病理生理学中的直接作用的宝贵方法。FMT广泛用于动物研究以诱导或抑制表型。例如，热量摄入和葡萄糖代谢可以通过将粪便从生病的供体转移到^{健康的受体来}调节5^，6。在人类中，FMT 已被证明是复发性艰难梭菌感染患者的安全治疗选择⁷。支持其在心血管疾病管理中使用的证据正在出现;例如，从瘦到代谢综合征患者的FMT可提高胰岛素敏感性⁸。在人类和啮齿动物研究中，肠道生态失调也与高血压有关⁹，^10，11。从喂食高盐饮食的小鼠到无菌小鼠的FMT使受体容易发炎和高血压¹²。

尽管FMT在啮齿动物中的成功率很高，但翻译挑战仍然存在。使用FMT治疗肥胖和代谢综合征的临床试验表明，对这些疾病的影响很小或没有影响¹³，^14，15。因此，需要更多的研究来确定针对肠道微生物群治疗心脏代谢紊乱的其他治疗途径。大多数关于肠道微生物群和心血管疾病的现有证据都是相关的。所描述的协议讨论了如何利用FMT和瑞士滚动技术的组合来显示疾病与肠道微生物群之间的关联，并直接评估肠道所有部分的完整性¹⁶，^17，18。

该方法的总体目标是为研究肠道微生物组在实验性心血管疾病中的作用提供指导。该协议在实验设计中提供了更多细节和关键考虑因素，以促进生理翻译并提高研究结果的严谨性和可重复性。

研究方案

范德比尔特大学的机构动物护理和使用委员会批准了本手稿中描述的所有程序。从杰克逊实验室购买的3个月大的C57B1 / 6雄性小鼠根据实验动物护理和使用指南进行饲养和护理。

1. 人类粪便样本的收集、储存和处理

1. 收集粪便样本，如果受试者在诊所，请使用无菌容器。在收集后36小时内将粪便样品冷藏在4°C，直到准备好处理。或者，使用市售工具收集粪便样本，以便在环境温度下轻松延长DNA稳定性，特别是对于家庭使用。
2. 用 10% 的漂白剂溶液或其他环境保护局批准的消毒剂对生物安全级通风橱进行消毒。
3. 将粪便从冷藏库中取出并带入通风橱;使用一次性刮刀制成~1g等分试样，并储存在-80°C冰箱中，直到完全准备好进行处理。
4. 将所有一次性物品丢弃在生物危害垃圾箱中。对所有表面（机罩和处理器接触的任何表面）和从机罩中取出的物品进行消毒。

2.小鼠粪便样本的无菌收集

注意:使用无菌技术，包括灭菌器械。

1. 通过CO₂ 窒息对小鼠实施安乐死。用70%乙醇喷洒小鼠的胸部和侧面，并小心地打开皮肤和腹膜腔以暴露胃肠道。
2. 分离盲肠并使用无菌手术剪刀将其切成两半。简而言之，暴露盲肠，从回肠近端切开 0.5 cm，在与结肠的连接处远端切开 0.5 cm。将分离的盲肠转移到无菌培养皿上。
3. 使用无菌刮刀将盲肠内容物转移到无菌管中，并将等分试样储存在-80°C冰箱¹⁹中。
   注意:由于肠道中的大多数细菌都是厌氧菌，因此在室内气氛中的隔离过程中，暴露于氧气可能会损坏或杀死生物体。因此，粪便样本应在厌氧室中分离，以维持细菌的活力。

3.粪便移植

1. 将新鲜或先前冷冻的粪便颗粒以 1:20 （w:v） 的比例重悬于无菌盐水中，并涡旋直至均质化。
2. 使匀浆通过 30 μm 孔的尼龙过滤器以去除大颗粒物质。以79× g 离心5分钟，收集上清液用于移植。
3. 口服管饲法每只无菌受体小鼠100μL浆液连续3天，然后每3天管饲2周。使用常规小鼠研究肠道微生物群的机制，如果它们首先用抗生素治疗以消除受体自身的特有微生物群。例如，在粪便浆液管饲之前，通过口服强饲法连续5天向受体小鼠施用头孢曲松（400mg / kg）。
   注意:研究表明，至少需要 2 周的这种治疗才能引起心血管变化，包括血压²⁰。
4. 确保无菌受体小鼠单养在gnotobiotic薄膜分离器中，并喂食无菌食物和水。

4. 收缩压测量

注意:从常规饲养的3个月大的C57Bl / 6小鼠接受FMT的Gnotobiotic小鼠植入渗透微型泵（Alzet，型号2002）以输注低剂量血管紧张素II（140ng / kg / min）2周。 每周通过 尾袖监测血压。植入渗透微型泵的方案先前已报道²¹。尾铐的进行如下简要总结。测量血压的非侵入性方法，如尾袖，适用于gnotobiotic小鼠的FMT研究。有关如何执行尾铐的详细步骤已在前面描述过²².

1. 简而言之，从gnotobiotic分离器中取出小鼠并预热尾袖机平台和小鼠支架。
2. 将有意识的小鼠置于加热平台上的约束中，并使用尾袖体积描记法收集至少三轮收缩压测量值。在适当的测量日之前连续3天执行以下步骤，以训练小鼠被约束以减轻压力。
   1. 轻轻地将鼠标放在预热的支架中，然后将尾巴留在外面。小心地用胶带粘住顶部，不要捏住它，以免给鼠标带来压力。
   2. 让鼠标放在支架上;放在平台上3-5分钟，用床单覆盖以适应。
3. 平均每只动物的平均收缩压的所有回合的测量值。

5. FMT对心血管变化的评估

1. 血压测量后，对小鼠实施安乐死并无菌收集盲肠内容物，如第2节所述。
2. 收获肠道和其他组织，包括心脏、主动脉、肝脏、肠系膜动脉和肾脏，以检查肠道微生物群在心脏代谢健康中的作用。要收获组织，请在小鼠中找到组织并使用剪刀切除它们。
3. 对从供体和受体小鼠收集的粪便样本/盲肠内容物进行宏基因组测序分析，以确认FMT²³后肠道微生物群的植入。微生物群成功定植的第一个证据是确认供体和受体的微生物群相似。
4. 在收获的肠道组织上使用Swiss-roll技术（见第6节），结合免疫染色和组织学检查形态和细胞表达变化²⁴。

6. 制作肠肠瑞士卷

1. 第一天
   1. 在喷洒70%乙醇的适当安乐死小鼠中，从肛门侧（固定在腹膜后）到胃侧解剖小鼠肠道。将整个分离的胃肠道放入含有磷酸盐缓冲盐水（PBS）的培养皿中。轻轻握住胃端的近端，用手去除周围的脂肪和结缔组织。
   2. 分离小肠（阑尾的头孢）并用每个长度制作Z型锯齿形。然后，依次切割以获得十二指肠、空肠和回肠，如前所述²⁵。通过切开盲肠下方的肠道部分来分离结肠。
   3. 切开十二指肠、空肠、回肠和结肠。
   4. 使用PBS用注射器和带球尖的针头冲洗和清洗肠道，以免撕裂肠道。
   5. 将肠子放在滤纸上。用切片的名称（例如十二指肠）标记纸张，然后在右上角标记"P"表示近端，"D"表示右下角的远端。
   6. 用球尖剪刀纵向剪肠。打开滤纸上的肠子。根据需要用更多的PBS清洗。
   7. 将肠子夹在两张滤纸之间。将滤纸钉在肠道附近的四个点/角落。
   8. 浸泡在10%福尔马林中性缓冲溶液（4.0克磷酸钠，一元，6.5克磷酸钠，二碱，100毫升37%甲醛，900毫升蒸馏水）。使用平台摇臂在室温下以 5 rpm 的速度摇匀过夜。
2. 第二天
   1. 在蒸馏水中制备2%琼脂糖，并在覆盖有铝箔的烧杯中用搅拌棒加热。
   2. 取回组织;剥离上部滤纸。从近端滚动肠道，使近端首先进入，然后向内滚动，使腔也位于载玻片内侧。根据需要用一两根 30 G 针头固定。
   3. 使用一次性研究生移液器吸出 1 mL 琼脂糖，并将琼脂糖倒在平坦表面上的滚动肠道切片上，同时避免组织中出现气泡。
   4. 让琼脂糖冷却并凝固。使用剃须刀片修剪组织切片周围多余的琼脂糖。
   5. 将肠道切片放入组织处理/包埋盒中（比常规的更大，以适应由于琼脂糖而增加的高度）。在4°C浸泡在70%乙醇中。
   6. 准备石蜡包埋的组织载玻片并进行免疫染色，如下所述。

7. 肠道免疫染色

1. 脱蜡
   1. 在架子上用载玻片通过以下浴:二甲苯3分钟，再次新鲜二甲苯3分钟，二甲苯与100%乙醇（1:1）3分钟，95%乙醇3分钟，70%乙醇3分钟，50%乙醇3分钟。
   2. 用冷的自来水轻轻冲洗。储存在自来水中。
2. 抗原修复
   1. 脱蜡后，将载玻片在抗原修复缓冲液（pH 6和0.05%吐温-20的0.01M柠檬酸三钠二水合物）的架子中煮沸20分钟。
   2. 在冷自来水中运行。
3. 染色
   1. 从浴槽中取出载玻片，将纸巾面朝上放入载玻片盒中，底部有湿的实验室湿巾/纸巾。用疏水记号笔在组织周围画一个轮廓。
   2. 将Tris缓冲盐水（TBS）+ 0.025%Triton X-100滴到组织上并孵育5分钟。重复此步骤。
   3. 在室温下用TBS + 10%胎牛血清（FBS）+ 1%牛血清白蛋白（BSA）封闭2小时。将载玻片侧转，取出实验室擦拭布上的阻塞缓冲液。
   4. 加入一抗溶液并在4°C孵育至少2小时或过夜。用TBS + 0.025%Triton X-100轻轻洗涤，在切片上轻轻移液~200μL。
   5. 加入二抗溶液，在室温下孵育1小时。用移液管冲洗载玻片3 x 5分钟，如步骤7.3.4所示。
   6. 使用安装介质和盖玻片进行安装。

结果

图 1 总结了上述步骤。将小鼠盲肠内容物或人粪便重悬于无菌盐水中以制备浆液，通过管饲法给予无菌小鼠（100μL），首先连续3天，然后每3天一次。在协议结束时，通过尾袖法测量血压，对小鼠实施安乐死，并收获组织以评估肠道微生物群的变化以及心血管和代谢的变化。

选择微生物群的一个关键步骤是确保感兴趣的疾病表型存在于供体中并与生态失...

讨论

研究肠道微生物群在心血管和代谢疾病中的因果作用的一种有价值的方法是将总微生物群或选择感兴趣的物种转移到无菌小鼠中。在这里，我们描述了从人类和传统饲养的小鼠收集粪便样本到无菌小鼠中的方案，以研究肠道微生物群在高血压疾病中的作用。

在小鼠中，我们使用无菌收集的盲肠内容物在需氧室中处理，而在人类中，我们收集粪便。FMT可以在样品仍然新鲜或在?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost	ThermoFisher	B40932
Anaerobic chamber	COY	7150220
Apolipoprotein AI	Novus Biologicals	NBP2-52979
Artery Scissors - Ball Tip	Fine Science Tools	14086-09
Bleach solution	Fisher Scientific	14-412-53
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	B14
CD3 antibody	ThermoFisher	14-0032-82
CD68 monoclonal antibody	ThermoFisher	14-0681-82
Centrifuge	Fisher Scientific	75-004-221
CODA high throughput monitor	Kent Scientic Corporation	CODA-HT8
Cryogenic vials	Fisher Scientific	10-500-26
Disposable graduate transfer pipettes	Fisher Scientific	137119AM
Disposable syringes	Fisher Scientific	14-823-2A
Ethanol	Fisher Scientific	AA33361M1
Feeding Needle	Fine Science Tools	18061-38
Filter (30 µm)	Fisher Scientific	NC0922459
Filter paper sheet	Fisher Scientific	09-802
Formalin (10%)	Fisher Scientific	23-730-581
High salt diet	Teklad	TD.03142
OMNIgene.GUT	DNAgenotek	OM-200+ACP102
Osmotic mini-pumps	Alzet	MODEL 2002
PAP Pen	Millipore Sigma	Z377821-1EA
Petri dish	Fisher Scientific	AS4050
Pipette tips	Fisher Scientific	21-236-18C
Pipettes	Fisher Scientific	14-388-100
Serile Phosphate-buffered saline	Fisher Scientific	AAJ61196AP
Smart spatula	Fisher Scientific	NC0133733
Stool collection device	Fisher Scientific	50-203-7255
TBS Buffer	Fisher Scientific	R017R.0000
Triton X-100	Millipore Sigma	9036-19-5
Varimix platform rocker	Fisher Scientific	09047113Q
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-41
Xylene	Fisher Scientific	1330-20-7, 100-41-4