בידוד צואה מורין והשתלת מיקרוביוטה

Summary

המטרה כאן היא להתוות פרוטוקול לחקר המנגנונים של דיסביוזיס במחלות לב וכלי דם. מאמר זה דן כיצד לאסוף ולהשתיל דגימות צואה של מורין, לבודד מעיים ולהשתמש בשיטת "סוויס-רול", ואחריה טכניקות של צביעת מערכת החיסון כדי לחקור שינויים במערכת העיכול.

Abstract

דיסביוזה של מיקרוביוטת המעי ממלאת תפקיד בפתופיזיולוגיה של הפרעות קרדיווסקולריות ומטבוליות, אך המנגנונים אינם מובנים היטב. השתלת מיקרוביוטה בצואה (FMT) היא גישה רבת ערך להגדרת תפקיד ישיר של המיקרוביוטה הכוללת או מינים מבודדים בפתופיזיולוגיה של מחלות. זוהי אפשרות טיפול בטוחה עבור חולים עם זיהום חוזר Clostridium difficile . מחקרים פרה-קליניים מראים כי מניפולציה של מיקרוביוטת המעי היא כלי שימושי לחקר הקשר המכניסטי בין דיסביוזה למחלות. השתלת מיקרוביוטה בצואה עשויה לעזור להבהיר טיפולים חדשניים הממוקדים במיקרוביוטה של המעי לניהול וטיפול במחלות לב-מטבוליות. למרות אחוזי הצלחה גבוהים במכרסמים, עדיין קיימים שינויים תרגומיים הקשורים להשתלה. המטרה כאן היא לספק הדרכה בחקר ההשפעות של מיקרוביום המעי במחלות לב וכלי דם ניסיוניות. במחקר זה מתואר פרוטוקול מפורט לאיסוף, טיפול, עיבוד והשתלה של מיקרוביוטה צואתית במחקרי מורין. שלבי האיסוף והעיבוד מתוארים הן עבור תורמים אנושיים והן עבור תורמי מכרסמים. לבסוף, אנו מתארים שימוש בשילוב של טכניקות גלגול וצביעת חיסון שוויצריות כדי להעריך מורפולוגיה ספציפית למעי ושינויים בשלמות במחלות לב וכלי דם ובמנגנוני מיקרוביוטה קשורים של המעי.

Introduction

הפרעות קרדיומטבוליות, כולל מחלות לב ושבץ, הן סיבות המוות המובילות בעולם¹. חוסר פעילות גופנית, תזונה לקויה, גיל מתקדם וגנטיקה מווסתים את הפתופיזיולוגיה של הפרעות אלה. עדויות מצטברות תומכות ברעיון שמיקרוביוטת המעי משפיעה על הפרעות לב וכלי דם והפרעות מטבוליות, כולל סוכרת מסוג², השמנת יתר³ ויתר לחץ דם⁴, מה שעשוי להיות המפתח לפיתוח גישות טיפוליות חדשות למחלות אלה.

המנגנונים המדויקים שבאמצעותם המיקרוביוטה גורמת למחלות עדיין אינם ידועים, והמחקרים הנוכחיים משתנים מאוד, בין היתר בשל הבדלים מתודולוגיים. השתלת מיקרוביוטה בצואה (FMT) היא גישה רבת ערך להגדרת תפקיד ישיר של המיקרוביוטה הכוללת או מינים מבודדים בפתופיזיולוגיה של מחלות. FMT נמצא בשימוש נרחב במחקרים בבעלי חיים כדי לגרום או לדכא פנוטיפ. לדוגמה, צריכת קלוריות ומטבוליזם גלוקוז ניתן לווסת על ידי העברת חומר צואתי מתורם חולה למקבל בריא ^5,6. בבני אדם, FMT הוכח כאפשרות טיפול בטוחה לחולים עם זיהום חוזר של Clostridium difficile ⁷. עדויות התומכות בשימוש בו בניהול מחלות לב וכלי דם מתגלות; לדוגמה, FMT מחולי תסמונת רזה לתסמונת מטבולית משפר את הרגישות לאינסולין⁸. דיסביוזיס של המעי נקשר גם ליתר לחץ דם הן במחקרים בבני אדם והן במחקרים^על מכרסמים 9,10,11. FMT מעכברים שניזונו מתזונה עשירה במלח בעכברים נטולי חיידקים גורם למושתלים לדלקת וליתר לחץ דם¹².

למרות השיעור הגבוה של הצלחה FMT במכרסמים, עדיין נותרו אתגרים תרגומיים. ניסויים קליניים המשתמשים ב- FMT לטיפול בהשמנת יתר ובתסמונת מטבולית מצביעים על השפעות מינימליות או ללא השפעות כלל על הפרעות אלה^13,14,15. לפיכך, נדרשים מחקרים נוספים כדי לזהות דרכים טיפוליות נוספות המכוונות למיקרוביוטה של המעי לטיפול בהפרעות קרדיומטבוליות. רוב העדויות הזמינות על מיקרוביוטת המעי ומחלות לב וכלי דם הן אסוציאטיביות. הפרוטוקול המתואר דן כיצד להשתמש בשילוב של FMT וטכניקת גלגול שוויצרית כדי להראות קשר בין מחלות למיקרוביוטה של המעי ולהעריך ישירות את שלמות כל חלקי המעי^16,17,18.

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לספק הדרכה לחקר ההשפעות של מיקרוביום המעי במחלות לב וכלי דם ניסיוניות. פרוטוקול זה מספק פרטים נוספים ושיקולים מרכזיים בתכנון הניסוי כדי לקדם תרגום פיזיולוגי ולהגביר את הקשיחות והשחזור של הממצאים.

Protocol

הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ונדרבילט אישרה את כל ההליכים המתוארים בכתב יד זה. עכברים זכרים C57B1/6 בגיל 3 חודשים, שנרכשו ממעבדת ג'קסון, שוכנו וטופלו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. איסוף, אחסון ועיבוד של דגימות צואה אנושיות

1. איסוף דגימת צואה, באמצעות מיכל סטרילי אם הנושא נמצא במרפאה. יש לשמור בקירור את דגימות הצואה בטמפרטורה של 4°C תוך 36 שעות מהאיסוף עד שהן מוכנות לעיבוד. לחלופין, איסוף דגימות צואה באמצעות כלי זמין מסחרית ליציבות DNA קלה ומורחבת בטמפרטורת הסביבה, במיוחד לשימוש ביתי.
2. יש לחטא קולט אדים ברמת בטיחות ביולוגית בתמיסת אקונומיקה 10%, או חומר חיטוי אחר שאושר על ידי הסוכנות להגנת הסביבה.
3. הסר את השרפרף מאחסון קריר והכנס למכסה האדים; השתמש במרית חד פעמית כדי להכין ~ 1 גרם aliquots ואחסן במקפיא -80 ° C עד מוכן לחלוטין לעיבוד.
4. יש להשליך את כל הפריטים החד-פעמיים לאשפה מסוכנת ביולוגית. יש לחטא את כל המשטחים (מכסה המנוע וכל המשטחים שהמעבד נוגע בהם) והפריטים שהוצאו ממכסה המנוע.

2. אוסף אספטי של דגימות צואת עכבר

הערה: השתמש בטכניקות אספטיות, כולל מכשירים מעוקרים.

1. הרדימו את העכבר על ידי חנק CO₂ . רסס את החזה ואת הצדדים של העכבר עם אתנול 70% בזהירות לפתוח את העור ואת חלל הצפק כדי לחשוף את מערכת העיכול.
2. בודדו את הצקום והשתמשו במספריים כירורגיים סטריליים כדי לחתוך אותו לשניים. בקצרה, לחשוף את cecum לחתוך 0.5 ס"מ קרוב מן ileum ו 0.5 ס"מ distally בצומת שלה עם המעי הגס. מעבירים את הצקום המבודד לצלחת פטרי סטרילית.
3. השתמש במרית סטרילית כדי להעביר תוכן cecal לתוך צינורות סטריליים, ולאחסן aliquots במקפיא -80 ° C¹⁹.
   הערה: מאחר שרוב חיידקי המעי הם אנאירובים, חשיפה לחמצן עלולה להזיק או להרוג את האורגניזמים במהלך הליך הבידוד באטמוספירה בחדר. לכן, דגימות צואה צריך להיות מבודד בתאים אנאירוביים כדי לשמור על הכדאיות של החיידקים.

3. השתלת חומר צואתי

1. יש להשהות מחדש כדורי צואה טריים או קפואים בעבר במי מלח סטריליים ביחס של 1:20 (w:v) ולערבל עד לקבלת הומוגני.
2. מעבירים את ההומוגנט דרך מסנן ניילון נקבוביות בגודל 30 מיקרומטר כדי להסיר חומר חלקיקי גדול. צנטריפוגה ב 79 × גרם במשך 5 דקות ולאסוף את supernatant לשימוש להשתלה.
3. רווח אוראלי 100 μL של slurry לכל עכבר מושתל ללא חיידקים במשך 3 ימים רצופים, ואחריו gavage כל 3 ימים במשך שבועיים. השתמשו בעכברים רגילים כדי לחקור מנגנונים של מיקרוביוטת המעיים אם הם טופלו תחילה באנטיביוטיקה כדי לחסל את המיקרוביוטה האנדמית של המושתל עצמו. לדוגמה, יש לתת ceftriaxone (400 מ"ג / ק"ג) מדי יום לעכברים המקבלים במשך 5 ימים רצופים על ידי gavage דרך הפה לפני gavage של צואה slurry.
   הערה: מחקרים מראים כי מינימום של שבועיים של טיפול זה נחוץ כדי לעורר שינויים קרדיווסקולריים, כולל לחץ דם²⁰.
4. ודא שעכברים מושתלים ללא חיידקים שוכנים באופן יחיד במבודדי סרטים גנוטוביוטיים ומוזנים במזון ומים סטריליים.

4. מדידות לחץ דם סיסטולי

הערה: עכברים גנוטוביוטיים שקיבלו FMT מעכברי C57Bl/6 בני 3 חודשים הושתלו במיני-משאבות אוסמוטיות (Alzet, model 2002) לעירוי אנגיוטנסין II במינון נמוך (140 ננוגרם/ק"ג/דקה) למשך שבועיים. לחץ הדם נוטר מדי שבוע באמצעות שרוול זנב. פרוטוקול השתלת מיני-משאבות אוסמוטיות דווח בעבר²¹. שרוול הזנב בוצע כפי שסוכם בקצרה להלן. שיטה לא פולשנית למדידת לחץ דם, כגון שרוול זנב, מתאימה למחקרי FMT בעכברים גנוטוביוטיים. השלבים המפורטים כיצד לבצע שרוול זנב תוארו בעבר²².

1. בקצרה, שלפו את העכברים מהמבודדים הגנוטוביוטיים וחממו מראש את פלטפורמת מכונת שרוול הזנב ומחזיק העכבר.
2. הניחו את העכברים המודעים במעצורים על הפלטפורמה המחוממת ואספו לפחות שלושה סבבים של מדידות לחץ סיסטולי באמצעות פלטיסמוגרפיה של שרוול הזנב. בצעו את השלבים הבאים 3 ימים רצופים לפני ימי המדידה המתאימים, כדי לאמן עכברים להיות מרוסנים על מנת להפחית את הלחץ.
   1. מניחים בעדינות את העכבר במחזיק שחומם מראש ומשאירים את הזנב בחוץ. בזהירות קלטת למטה את החלק העליון מבלי לצבוט אותו, כדי לא להדגיש את העכבר.
   2. אפשר לעכבר לנוח במחזיק; מניחים על הרציף למשך 3-5 דקות מכוסה בסדין להתאקלמות.
3. ממוצע המדידות מכל הסבבים עבור לחץ סיסטולי ממוצע עבור כל חיה.

5. הערכת FMT לשינויים קרדיווסקולריים

1. לאחר מדידת לחץ הדם, יש להרדים את העכברים ולאסוף את תכולת הצק, כמתואר בסעיף 2.
2. קצרו את המעיים ורקמות אחרות, כולל הלב, אבי העורקים, הכבד, העורקים המזנטריים והכליות, כדי לבחון את תפקיד המיקרוביוטה של המעי בבריאות הלב והמטבוליזם. כדי לקצור רקמות, אתר את הרקמה בעכבר והשתמש במספריים כדי להסיר אותם.
3. הפעל ניתוח ריצוף מטאגנומי על דגימות צואה / תוכן צקלי שנאסף מהעכברים התורמים והמקבלים כדי לאשר קליטה של מיקרוביוטת המעי לאחר FMT²³. ההוכחה הראשונה להתיישבות מוצלחת של מיקרוביוטה היא אישור שהמיקרוביוטה של התורם והמקבל דומים.
4. השתמש בטכניקת סוויס-רול (ראה סעיף 6) על רקמת המעי שנקטפה, בשילוב עם אימונוסטיין והיסטולוגיה כדי לבחון שינויים מורפולוגיים ותאיים^{בביטוי 24}.

6. הכנת מעי המעי לחמניות שוויצריות

1. יום 1
   1. בעכבר שעבר המתת חסד כראוי מרוסס באתנול 70%, נתחו את מעי העכבר מהצד האנאלי (קבוע ברטרופריטונאום) לצד הקיבה. הניחו את כל מערכת העיכול המבודדת בצלחת פטרי המכילה מלח חוצץ פוספט (PBS). החזיקו בעדינות את הקצה הפרוקסימלי מקצה הקיבה והוציאו ביד את השומן שמסביב ואת רקמת החיבור.
   2. לבודד את המעי הדק (cephalad מן התוספתן) ולעשות זיגזג מסוג Z עם כל אורך. לאחר מכן, לחתוך כדי לקבל את התריסריון, jejunum, ו ileum ברצף, כפי שתואר קודם²⁵. בודד את המעי הגס על ידי חיתוך החלק של המעי מתחת cecum.
   3. חותכים את התריסריון, jejunum, ileum, ואת המעי הגס.
   4. לשטוף ולשטוף את המעיים בפנים באמצעות PBS עם מזרק ומחט עם קצה כדור, כדי לא לקרוע את המעי.
   5. שים את המעיים על נייר פילטר. תייג את הנייר בשם המקטע (לדוגמה, תריסריון) ולאחר מכן 'P' בפינה העליונה הימנית עבור פרוקסימלי או 'D' עבור דיסטלי בפינה התחתונה הימנית.
   6. חותכים את המעיים לאורכם עם מספריים בקצה הכדור. פתח את המעיים על נייר הסינון. יש לשטוף עם PBS נוסף לפי הצורך.
   7. סנדוויץ' את המעיים בין שני ניירות פילטר. הדקו את ניירות הסינון בארבע נקודות/פינות ליד המעיים.
   8. יש להשרות בתמיסת חיץ נייטרלית 10% פורמלין (4.0 גרם נתרן פוספט, מונובייסיק, 6.5 גרם נתרן פוספט, דיבייסיק, 100 מ"ל 37% פורמלדהיד, 900 מ"ל מים מזוקקים). נערו באמצעות נדנדת פלטפורמה ב-5 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
2. יום 2
   1. מכינים 2% אגרוז במים מזוקקים ומחממים עם מוט ערבוב בכוס מכוסה ברדיד אלומיניום.
   2. לאחזר את הרקמות; הפשיט את נייר הסינון העליון. גלגלו את המעיים מהצד הפרוקסימלי כך שהצד הפרוקסימלי ייכנס ראשון פנימה, וגלגלו פנימה כך שהלומן יהיה בפנים גם במגלשה. נעצו עם מחט 30 גרם או שתיים, לפי הצורך.
   3. יש לשאוף 1 מ"ל אגרוז באמצעות פיפטות חד פעמיות להעברת בוגרים, ולשפוך את האגרוז על חלק מעיים מגולגל על משטח שטוח תוך הימנעות מבועות אוויר ברקמות.
   4. מניחים לאגרוז להתקרר ולהתגבש. השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את האגרוז הנוסף סביב קטע הרקמה.
   5. הכניסו את חלקי המעיים לקלטות עיבוד / הטבעה של רקמות (גדולות יותר מהרגילות כדי להתאים לגובה המוגבר עקב אגרוז). יש להשרות 70% אתנול ב-4°C.
   6. הכינו שקופיות רקמה משובצות פרפין והמשיכו ל-immunostaining, כמתואר להלן.

7. Immunostaining של מערכת העיכול

1. דה-פרפיניזציה
   1. עברו דרך האמבטיות הבאות עם שקופיות במתלה: קסילן למשך 3 דקות, קסילן טרי שוב למשך 3 דקות, קסילן עם 100% אתנול (1:1) למשך 3 דקות, 95% אתנול למשך 3 דקות, 70% אתנול למשך 3 דקות ואתנול 50% למשך 3 דקות.
   2. יש לשטוף בעדינות במי ברז קרים זורמים. יש לאחסן באמבט עם מי ברז.
2. שליפת אנטיגן
   1. לאחר דה-פראפיניזציה, יש להרתיח את המגלשות במדף באמבט של מאגר אחזור אנטיגן (0.01M trisodium citrate dihydrate ב-pH 6 ו-0.05% Tween-20) ב-100°C למשך 20 דקות.
   2. לרוץ תחת מי ברז קרים.
3. צביעה
   1. הסר את המגלשות מהאמבטיה והנח את הטישו עם הפנים כלפי מעלה בקופסת שקופיות עם מגבוני מעבדה לחים / מגבות נייר בתחתית. ציירו קו מתאר סביב הרקמה בעזרת עט טוש הידרופובי.
   2. יש לטפטף מי מלח חוצצים (TBS) + 0.025% Triton X-100 על הרקמה ולדגור במשך 5 דקות. חזור על שלב זה.
   3. יש לחסום עם TBS + סרום בקר עוברי 10% (FBS) + אלבומין 1% בסרום בקר (BSA) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. סובב את המגלשות על צדן והסר את מאגר החסימה במגבון מעבדה.
   4. יש להוסיף תמיסת נוגדנים ראשונית ולדגור בטמפרטורה של 4°C למשך שעתיים או לילה לפחות. יש לשטוף בעדינות עם TBS + 0.025% Triton X-100 על ידי פיפטוף עדין ~200 μL מעל הקטע.
   5. מוסיפים תמיסת נוגדנים משנית ודגרים במשך שעה בטמפרטורת החדר. שטפו את המגלשות 3 x 5 דקות עם TBS על ידי שטיפה עם פיפטה, כמו בשלב 7.3.4.
   6. הרכבה עם אמצעי הרכבה וכיסוי.

תוצאות

השלבים המתוארים לעיל מסוכמים באיור 1. תוכן cecal עכבר או צואת אדם הם resuspended במי מלח סטריליים כדי להכין slurry לתת לעכברים ללא חיידקים (100 μL) על ידי gavage, תחילה במשך 3 ימים רצופים, ולאחר מכן פעם כל 3 ימים. בסוף הפרוטוקול, לחץ הדם נמדד בשיטת שרוול הזנב, עכברים מומתים ורקמות נקצרות להערכת ...

Discussion

גישה חשובה לחקר התפקיד הסיבתי של מיקרוביוטת המעי במחלות לב וכלי דם ומחלות מטבוליות היא להעביר את המיקרוביוטה הכוללת או מינים נבחרים בעלי עניין לעכברים נטולי חיידקים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים לאיסוף דגימות צואה מבני אדם ומעכברים ששוכנו באופן קונבנציונלי בעכברים נטולי חיידקים כדי ל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost	ThermoFisher	B40932
Anaerobic chamber	COY	7150220
Apolipoprotein AI	Novus Biologicals	NBP2-52979
Artery Scissors - Ball Tip	Fine Science Tools	14086-09
Bleach solution	Fisher Scientific	14-412-53
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	B14
CD3 antibody	ThermoFisher	14-0032-82
CD68 monoclonal antibody	ThermoFisher	14-0681-82
Centrifuge	Fisher Scientific	75-004-221
CODA high throughput monitor	Kent Scientic Corporation	CODA-HT8
Cryogenic vials	Fisher Scientific	10-500-26
Disposable graduate transfer pipettes	Fisher Scientific	137119AM
Disposable syringes	Fisher Scientific	14-823-2A
Ethanol	Fisher Scientific	AA33361M1
Feeding Needle	Fine Science Tools	18061-38
Filter paper sheet	Fisher Scientific	09-802
Formalin (10%)	Fisher Scientific	23-730-581
High salt diet	Teklad	TD.03142
OMNIgene.GUT	DNAgenotek	OM-200+ACP102
Osmotic mini-pumps	Alzet	MODEL 2002
PAP Pen	Millipore Sigma	Z377821-1EA
Petri dish	Fisher Scientific	AS4050
Pipette tips	Fisher Scientific	21-236-18C
Pipettes	Fisher Scientific	14-388-100
Serile Phosphate-buffered saline	Fisher Scientific	AAJ61196AP
Smart spatula	Fisher Scientific	NC0133733
Stool collection device	Fisher Scientific	50-203-7255
TBS Buffer	Fisher Scientific	R017R.0000
Triton X-100	Millipore Sigma	9036-19-5
Varimix platform rocker	Fisher Scientific	09047113Q
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-41
Xylene	Fisher Scientific	1330-20-7, 100-41-4