Isolamento Fecal Murino e Transplante de Microbiota

Resumo

O objetivo aqui é delinear um protocolo para investigar os mecanismos de disbiose na doença cardiovascular. Este artigo discute como coletar e transplantar amostras fecais murinas assepticamente, isolar intestinos e usar o método "Swiss-roll", seguido por técnicas de imunomarcação para interrogar alterações no trato gastrointestinal.

Resumo

A disbiose da microbiota intestinal desempenha um papel na fisiopatologia de distúrbios cardiovasculares e metabólicos, mas os mecanismos não são bem compreendidos. O transplante de microbiota fecal (FMT) é uma abordagem valiosa para delinear um papel direto da microbiota total ou de espécies isoladas na fisiopatologia da doença. É uma opção de tratamento segura para pacientes com infecção recorrente por Clostridium difficile . Estudos pré-clínicos demonstram que a manipulação da microbiota intestinal é uma ferramenta útil para estudar a ligação mecanicista entre disbiose e doença. O transplante de microbiota fecal pode ajudar a elucidar novas terapêuticas direcionadas à microbiota intestinal para o manejo e tratamento de doenças cardiometabólicas. Apesar de uma alta taxa de sucesso em roedores, ainda existem alterações translacionais associadas ao transplante. O objetivo aqui é fornecer orientação no estudo dos efeitos do microbioma intestinal em doenças cardiovasculares experimentais. Neste estudo, um protocolo detalhado para coleta, manuseio, processamento e transplante da microbiota fecal em estudos murinos é descrito. As etapas de coleta e processamento são descritas para doadores humanos e roedores. Finalmente, descrevemos o uso de uma combinação das técnicas de rolagem suíça e imunomarcação para avaliar alterações de morfologia e integridade específicas do intestino em doenças cardiovasculares e mecanismos relacionados da microbiota intestinal.

Introdução

Os distúrbios cardiometabólicos, incluindo doenças cardíacas e acidentes vasculares cerebrais, são as principais causas globais de morte¹. Inatividade física, má nutrição, avanço da idade e genética modulam a fisiopatologia desses distúrbios. Evidências acumuladas apoiam o conceito de que a microbiota intestinal afeta distúrbios cardiovasculares e metabólicos,^{incluindo diabetes tipo} 2 2, obesidade³ e hipertensão⁴, o que pode ser uma chave para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para essas doenças.

Os mecanismos exatos pelos quais a microbiota causa doenças ainda são desconhecidos, e os estudos atuais são altamente variáveis, em parte devido a diferenças metodológicas. O transplante de microbiota fecal (FMT) é uma abordagem valiosa para delinear um papel direto da microbiota total ou de espécies isoladas na fisiopatologia da doença. FMT é amplamente utilizado em estudos com animais para induzir ou suprimir um fenótipo. Por exemplo, a ingestão calórica e o metabolismo da glicose podem ser modulados pela transferência de matéria fecal de um doador doente para um receptor saudável ^5,6. Em humanos, o FMT tem se mostrado uma opção segura de tratamento para pacientes com infecção recorrente por Clostridium difficile ⁷. Evidências que apoiam seu uso no manejo de doenças cardiovasculares estão surgindo; por exemplo, o FMT de pacientes magros a com síndrome metabólica melhora a sensibilidade à insulina⁸. A disbiose intestinal também está associada à hipertensão arterial em estudos com humanos e roedores 9,10,11. FMT de camundongos alimentados com dieta rica em sal em camundongos livres de germes predispõe os receptores à inflamação e hipertensão¹².

Apesar da alta taxa de sucesso de FMT em roedores, os desafios translacionais permanecem. Ensaios clínicos utilizando o FMT no tratamento da obesidade e da síndrome metabólica indicam efeitos mínimos ou nulos sobre esses distúrbios^13,14,15. Assim, mais estudos são necessários para identificar vias terapêuticas adicionais visando a microbiota intestinal para o tratamento de distúrbios cardiometabólicos. A maioria das evidências disponíveis sobre a microbiota intestinal e doenças cardiovasculares é associativa. O protocolo descrito discute como utilizar uma combinação de FMT e a técnica de rolamento suíço para mostrar uma associação entre doença e microbiota intestinal e avaliar diretamente a integridade de todas as partes do intestino intestinal^16,17,18.

O objetivo geral deste método é fornecer orientação para o estudo dos efeitos do microbioma intestinal na doença cardiovascular experimental. Este protocolo fornece mais detalhes e considerações importantes no planejamento experimental para promover a tradução fisiológica e aumentar o rigor e a reprodutibilidade dos achados.

Protocolo

O Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Vanderbilt aprovou todos os procedimentos descritos neste manuscrito. Camundongos machos C57B1/6 aos 3 meses de idade, adquiridos do The Jackson Laboratory, foram alojados e cuidados de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. Coleta, armazenamento e processamento de amostras fecais humanas

1. Coletar uma amostra de fezes, usando um recipiente estéril se o sujeito estiver na clínica. Refrigerar as amostras de fezes a 4 °C no prazo de 36 h após a colheita até estarem prontas para o processamento. Alternativamente, colete amostras de fezes usando uma ferramenta disponível comercialmente para uma estabilidade fácil e estendida do DNA à temperatura ambiente, especialmente para uso doméstico.
2. Higienize um exaustor de nível de biossegurança com uma solução de água sanitária a 10% ou outro desinfetante aprovado pela Agência de Proteção Ambiental.
3. Retire as fezes do armazenamento refrigerado e leve para o exaustor; use uma espátula descartável para fazer alíquotas de ~1 g e armazene em um freezer de -80 °C até ficar completamente pronto para o processamento.
4. Descarte todos os itens descartáveis no lixo de risco biológico. Desinfete todas as superfícies (capuz e quaisquer superfícies tocadas pelo processador) e itens que estão sendo removidos do capô.

2. Coleta asséptica de amostras fecais de camundongos

NOTA: Use técnicas assépticas, incluindo instrumentos esterilizados.

1. Eutanásia do camundongo por asfixia por CO₂ . Borrife o peito e as laterais do rato com etanol a 70% e abra cuidadosamente a pele e a cavidade peritoneal para expor o trato gastrointestinal.
2. Isole o ceco e use tesoura cirúrgica estéril para cortá-lo ao meio. Resumidamente, expor o ceco e cortar 0,5 cm proximalmente do íleo e 0,5 cm distalmente em sua junção com o cólon. Transfira o ceco isolado para uma placa de Petri estéril.
3. Use uma espátula estéril para transferir o conteúdo cecal para tubos estéreis e armazene alíquotas em um freezer de -80 °C¹⁹.
   NOTA: Como a maioria das bactérias no intestino são anaeróbias, a exposição ao oxigênio pode danificar ou matar os organismos durante o procedimento de isolamento em uma atmosfera ambiente. Assim, amostras fecais devem ser isoladas em câmaras anaeróbias para manter a viabilidade da bactéria.

3. Transplante de matéria fecal

1. Ressuspender pellets fecais frescos ou previamente congelados em solução salina estéril na proporção de 1:20 (p:v) e vórtice até homogeneizar.
2. Passe o homogeneizado através de um filtro de nylon de poros de 30 μm para remover partículas grandes. Centrifugar a 79 × g por 5 min e coletar o sobrenadante a ser usado para transplante.
3. Gavagem oral de 100 μL do chorume por camundongo receptor livre de germes por 3 dias consecutivos, seguida de gavagem a cada 3 dias por 2 semanas. Use camundongos convencionais para estudar mecanismos da microbiota intestinal se eles tiverem sido tratados primeiro com antibióticos para eliminar a microbiota endêmica do próprio receptor. Por exemplo, administrar ceftriaxona (400 mg/kg) diariamente aos camundongos receptores por 5 dias consecutivos por gavagem oral antes da gavagem do chorume fecal.
   NOTA: Estudos sugerem que um mínimo de 2 semanas deste tratamento é necessário para provocar alterações cardiovasculares, incluindo a pressão arterial²⁰.
4. Certifique-se de que os camundongos receptores livres de germes sejam alojados em isoladores de filme gnotobióticos e alimentados com água e alimentos estéreis.

4. Medidas da pressão arterial sistólica

NOTA: Camundongos gnotobióticos que receberam FMT de camundongos C57Bl/6 com 3 meses de idade alojados convencionalmente foram implantados com minibombas osmóticas (Alzet, modelo 2002) para infusão de baixas doses de angiotensina II (140 ng/kg/min) por 2 semanas. A pressão arterial foi monitorada semanalmente através do manguito de cauda. O protocolo para implantação de minibombas osmóticas já foi relatado^{anteriormente21}. O manguito de cauda foi realizado como resumido a seguir. Um método não invasivo de medir a pressão arterial, como o manguito de cauda, é adequado para estudos de FMT em camundongos gnotobióticos. Os passos detalhados de como realizar o manguito de cauda foram descritos anteriormente²².

1. Resumidamente, recupere os camundongos dos isoladores gnotobióticos e pré-aqueça a plataforma da máquina de manguito de cauda e o suporte do mouse.
2. Coloque os ratos conscientes em contenções na plataforma aquecida e colete pelo menos três rodadas de medidas de pressão sistólica usando pletismografia do manguito de cauda. Execute as etapas a seguir abaixo em 3 dias consecutivos antes dos dias de medição adequados, para treinar os ratos a serem contidos a fim de reduzir o estresse.
   1. Coloque suavemente o rato no suporte pré-aquecido e deixe a cauda para fora. Tape cuidadosamente a parte superior sem beliscar, para não estressar o mouse.
   2. Deixe o mouse descansar no suporte; Coloque na plataforma por 3-5 min coberto por um lençol para se aclimatar.
3. Média das medidas de todas as rodadas para uma pressão sistólica média para cada animal.

5. Avaliação do FMT para alterações cardiovasculares

1. Após a medição da pressão arterial, eutanásia dos ratinhos e recolha assepticamente o conteúdo cecal, conforme descrito na secção 2 .
2. Colher os intestinos e outros tecidos, incluindo o coração, aorta, fígado, artérias mesentéricas e rins, para examinar o papel da microbiota intestinal na saúde cardiometabólica. Para colher tecidos, localize o tecido no rato e use uma tesoura para excisá-los.
3. Executar uma análise de sequenciamento metagenômico em amostras fecais/conteúdo cecal coletadas dos camundongos doador e receptor para confirmar o enxerto da microbiota intestinal após o FMT²³. A primeira prova de colonização bem-sucedida da microbiota é confirmar que a microbiota do doador e do receptor são semelhantes.
4. Utilizar a técnica de rolo suíço (ver secção 6) no tecido intestinal colhido, juntamente com imunomarcação e histologia para examinar alterações morfológicas e de expressão celular²⁴.

6. Fazendo intestino intestino Swiss-rolls

1. Dia 1
   1. Em um camundongo devidamente eutanasiado pulverizado com etanol 70%, disseque o intestino do camundongo do lado anal (fixado no retroperitônio) para o lado do estômago. Coloque a totalidade do trato gastrointestinal isolado em uma placa de Petri contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS). Segure suavemente a extremidade proximal da extremidade do estômago e remova a gordura circundante e o tecido conjuntivo com a mão.
   2. Isole o intestino delgado (cefalia do apêndice) e faça um ziguezague tipo Z com cada comprimento. Em seguida, cortar-se para obtenção sucessiva do duodeno, jejuno e íleo, conforme descrito^{anteriormente25}. Isole o cólon cortando a seção do intestino abaixo do ceco.
   3. Corte o duodeno, jejuno, íleo e cólon.
   4. Lave e lave o intestino dentro usando PBS com uma seringa e uma agulha com uma ponta de bola, para não rasgar o intestino.
   5. Coloque o intestino em papel filtro. Rotule o papel com o nome da seção (por exemplo, duodeno) e, em seguida, 'P' no canto superior direito para proximal ou 'D' para distal no canto inferior direito.
   6. Corte o intestino longitudinalmente com uma tesoura de ponta de bola. Abra o intestino no papel de filtro. Lave com mais PBS conforme necessário.
   7. Sanduíche o intestino entre dois papéis de filtro. Grampeie os papéis de filtro em quatro pontos/cantos perto do intestino.
   8. Imersão em solução tampão neutra de formalina a 10% (4,0 g de fosfato de sódio, monobásico, 6,5 g de fosfato de sódio, dibásico, 100 mL de formaldeído a 37%, 900 mL de água destilada). Agite usando um balancim de plataforma a 5 rpm à temperatura ambiente durante a noite.
2. Dia 2
   1. Prepare a agarose a 2% em água destilada e aqueça com uma barra de agitação num copo coberto com papel alumínio.
   2. Recuperar os tecidos; Retire o papel de filtro superior. Enrole o intestino do lado proximal para que o lado proximal entre primeiro, e role para dentro para que o lúmen fique dentro da lâmina também. Fixe com uma ou duas agulhas de 30 G, conforme necessário.
   3. Aspirar 1 mL de agarose usando pipetas de transferência de graduação descartáveis e despeje a agarose em uma seção de intestino enrolado em uma superfície plana, evitando bolhas de ar nos tecidos.
   4. Deixe a agarose arrefecer e solidificar. Use uma lâmina de barbear para aparar a agarose extra ao redor da seção de tecido.
   5. Coloque as seções intestinais em de processamento/incorporação de tecidos (maiores que as normais para acomodar o aumento da altura devido à agarose). Mergulhe em etanol 70% a 4 °C.
   6. Prepare lâminas de tecido emblocadas em parafina e proceda à imunomarcação, conforme descrito abaixo.

7. Imunomarcação do trato intestinal intestinal

1. Desparafinização
   1. Passe pelos seguintes banhos com lâminas em rack: xileno por 3 min, xileno fresco novamente por 3 min, xileno com etanol 100% (1:1) por 3 min, etanol 95% por 3 min, etanol 70% por 3 min e etanol 50% por 3 min.
   2. Enxágue suavemente com água corrente fria da torneira. Armazenar em um banho de água da torneira.
2. Recuperação de antígenos
   1. Após a desparafinização, ferver as lâminas em um rack em um banho de tampão de recuperação de antígeno (citrato trissódico 0,01M di-hidratado em pH 6 e 0,05% Tween-20) a 100 °C por 20 min.
   2. Corra sob água fria da torneira.
3. Mancha
   1. Retire as lâminas do banho e coloque o lenço virado para cima em uma caixa de slides com lenços umedecidos/toalhas de papel no fundo. Desenhe um contorno ao redor do tecido com uma caneta marcador hidrofóbica.
   2. Soltar solução salina tamponada com Tris (TBS) + Triton X-100 a 0,025% sobre o tecido e incubar por 5 min. Repita esta etapa.
   3. Bloqueio com TBS + 10% de soro fetal bovino (SFB) + 1% de albumina de soro bovino (BSA) por 2 h à temperatura ambiente. Vire as lâminas de lado e remova o buffer de bloqueio em um lenço de laboratório.
   4. Adicionar solução primária de anticorpos e incubar a 4 °C durante, pelo menos, 2 h ou durante a noite. Lave suavemente com TBS + 0,025% Triton X-100 pipetando suavemente ~200 μL sobre a seção.
   5. Adicionar solução de anticorpos secundários e incubar durante 1 h à temperatura ambiente. Enxaguar as lâminas 3 x 5 min com TBS enxaguando com uma pipeta, como no passo 7.3.4.
   6. Montagem com meio de montagem e uma lamínula.

Resultados

As etapas descritas acima estão resumidas na Figura 1. O conteúdo cecal de camundongos ou fezes humanas são ressuspensos em soro fisiológico estéril para preparar uma pasta para dar a camundongos livres de germes (100 μL) por gavagem, primeiro por 3 dias consecutivos, depois uma vez a cada 3 dias. Ao final do protocolo, a pressão arterial é medida pelo método do manguito de cauda, camundongos são eutanasiados e tecidos são colhidos para avaliação de mudanças na microbiota intes...

Discussão

Uma abordagem valiosa para estudar o papel causal da microbiota intestinal em doenças cardiovasculares e metabólicas é transferir a microbiota total ou selecionar espécies de interesse para camundongos livres de germes. Aqui, descrevemos protocolos para coletar amostras fecais de humanos e camundongos convencionalmente alojados em camundongos livres de germes para estudar o papel da microbiota intestinal em doenças hipertensivas.

Em camundongos, usamos conteúdo cecal coletado assepticame...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost	ThermoFisher	B40932
Anaerobic chamber	COY	7150220
Apolipoprotein AI	Novus Biologicals	NBP2-52979
Artery Scissors - Ball Tip	Fine Science Tools	14086-09
Bleach solution	Fisher Scientific	14-412-53
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	B14
CD3 antibody	ThermoFisher	14-0032-82
CD68 monoclonal antibody	ThermoFisher	14-0681-82
Centrifuge	Fisher Scientific	75-004-221
CODA high throughput monitor	Kent Scientic Corporation	CODA-HT8
Cryogenic vials	Fisher Scientific	10-500-26
Disposable graduate transfer pipettes	Fisher Scientific	137119AM
Disposable syringes	Fisher Scientific	14-823-2A
Ethanol	Fisher Scientific	AA33361M1
Feeding Needle	Fine Science Tools	18061-38
Filter (30 µm)	Fisher Scientific	NC0922459
Filter paper sheet	Fisher Scientific	09-802
Formalin (10%)	Fisher Scientific	23-730-581
High salt diet	Teklad	TD.03142
OMNIgene.GUT	DNAgenotek	OM-200+ACP102
Osmotic mini-pumps	Alzet	MODEL 2002
PAP Pen	Millipore Sigma	Z377821-1EA
Petri dish	Fisher Scientific	AS4050
Pipette tips	Fisher Scientific	21-236-18C
Pipettes	Fisher Scientific	14-388-100
Serile Phosphate-buffered saline	Fisher Scientific	AAJ61196AP
Smart spatula	Fisher Scientific	NC0133733
Stool collection device	Fisher Scientific	50-203-7255
TBS Buffer	Fisher Scientific	R017R.0000
Triton X-100	Millipore Sigma	9036-19-5
Varimix platform rocker	Fisher Scientific	09047113Q
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-41
Xylene	Fisher Scientific	1330-20-7, 100-41-4