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요약

여기서 목표는 심혈관 질환에서 dysbiosis의 메커니즘을 조사하기 위한 프로토콜을 설명하는 것입니다. 이 논문은 쥐 분변 샘플을 무균적으로 수집 및 이식하고, 장을 분리하고, "Swiss-roll" 방법을 사용한 다음 면역염색 기술을 사용하여 위장관의 변화를 조사하는 방법에 대해 설명합니다.

초록

장내 미생물 dysbiosis는 심혈관 및 대사 장애의 병태생리학에서 중요한 역할을 하지만 그 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 분변 미생물군 이식(FMT)은 질병 병태생리학에서 전체 미생물군 또는 분리된 종의 직접적인 역할을 설명하는 귀중한 접근 방식입니다. 재발성 클로스트리디움 디피실 감염 환자에게 안전한 치료 옵션입니다. 전임상 연구에 따르면 장내 미생물군을 조작하는 것이 dysbiosis와 질병 사이의 기계적 연관성을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 분변 미생물군 이식은 심혈관 질환의 관리 및 치료를 위한 새로운 장내 미생물군 표적 치료제를 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 설치류의 높은 성공률에도 불구하고 이식과 관련된 번역 변화가 남아 있습니다. 여기서 목표는 실험적 심혈관 질환에서 장내 미생물군집의 영향을 연구하는 데 지침을 제공하는 것입니다. 이 연구에서는 쥐 연구에서 분변 미생물총의 수집, 취급, 처리 및 이식에 대한 자세한 프로토콜이 설명됩니다. 수집 및 처리 단계는 인간 및 설치류 기증자 모두에 대해 설명됩니다. 마지막으로, 우리는 심혈관 질환 및 관련 장내 미생물군 메커니즘의 장 특이적 형태 및 무결성 변화를 평가하기 위해 스위스 롤링 및 면역 염색 기술의 조합을 사용하여 설명합니다.

서문

심장병과 뇌졸중을 포함한 심장 대사 장애는 전 세계 주요 사망 원인입니다1. 신체 활동 부족, 영양 부족, 노화 및 유전학은 이러한 장애의 병태생리학을 조절합니다. 축적된 증거는 장내 미생물군이 제2형 당뇨병2, 비만3, 고혈압4을 포함한 심혈관 및 대사 장애에 영향을 미친다는 개념을 뒷받침하며, 이는 이러한 질병에 대한 새로운 치료법 개발의 열쇠가 될 수 있습니다.

미생물군이 질병을 일으키는 정확한 메커니즘은 아직 알려지지 않았으며, 부분적으로는 방법론적 차이로 인해 현재 연구는 매우 다양합니다. 분변 미생물군 이식(FMT)은 질병 병태생리학에서 전체 미생물군 또는 분리된 종의 직접적인 역할을 설명하는 귀중한 접근 방식입니다. FMT는 표현형을 유도하거나 억제하기 위해 동물 연구에서 널리 사용됩니다. 예를 들어, 칼로리 섭취 및 포도당 대사는 배설물을 아픈 기증자로부터 건강한 수혜자에게 전달함으로써 조절될 수 있다 5,6. 인간의 경우, FMT는 클로스트리디움 디피실 감염이 재발하는 환자에게 안전한 치료 옵션인 것으로 나타났다7. 심혈관 질환 관리에 대한 사용을 뒷받침하는 증거가 나타나고 있습니다. 예를 들어, 희박한 대사 증후군 환자에서 FMT는 인슐린 감수성을 개선한다8. 장내 dysbiosis는 또한 인간 및 설치류 연구모두에서 고혈압과 관련이 있습니다 9,10,11. 무균 생쥐에 고염식을 먹인 생쥐의 FMT는 수혜자가 염증과 고혈압에 걸리기 쉽다12.

설치류에서 FMT 성공률이 높음에도 불구하고 번역 문제는 여전히 남아 있습니다. 비만과 대사증후군을 치료하기 위해 FMT를 사용한 임상 시험은 이러한 장애에 대한 영향이 미미하거나 전혀 없음을 나타냅니다13,14,15. 따라서 심장 대사 장애 치료를 위해 장내 미생물군을 표적으로 하는 추가 치료 방법을 식별하기 위해서는 더 많은 연구가 필요합니다. 장내 미생물군과 심혈관 질환에 대한 이용 가능한 증거의 대부분은 연관성이 있습니다. 설명된 프로토콜은 질병과 장내 미생물군 사이의 연관성을 보여주고 장내 모든 부분의 무결성을 직접 평가하기 위해 FMT와 스위스 롤링 기술의 조합을 활용하는 방법에 대해 논의합니다16,17,18.

이 방법의 전반적인 목표는 실험적 심혈관 질환에서 장내 미생물군집의 영향을 연구하기 위한 지침을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜은 생리학적 번역을 촉진하고 결과의 엄격함과 재현성을 높이기 위해 실험 설계에서 더 많은 세부 사항과 주요 고려 사항을 제공합니다.

프로토콜

밴더빌트 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회는 이 원고에 설명된 모든 절차를 승인했습니다. 생후 3개월의 C57B1/6 수컷 마우스를 잭슨 연구소(Jackson Laboratory)에서 구입하여 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 사육하고 관리했습니다.

1. 인간 배설물 샘플의 수집, 저장 및 처리

  1. 피험자가 클리닉에 있는 경우 멸균 용기를 사용하여 대변 샘플을 수집합니다. 처리 준비가 될 때까지 수집 후 36시간 이내에 4°C에서 대변 샘플을 냉장 보관합니다. 또는 시중에서 판매되는 도구를 사용하여 대변 샘플을 수집하여 주변 온도, 특히 가정에서 쉽게 DNA 안정성을 확보할 수 있습니다.
  2. 10% 표백제 용액 또는 기타 환경 보호국에서 승인한 소독제로 생물 안전 수준의 흄 후드를 소독하십시오.
  3. 서늘한 보관소에서 의자를 꺼내 흄 후드에 넣습니다. 일회용 주걱을 사용하여 ~1g 분취량을 만들고 완전히 처리할 준비가 될 때까지 -80°C 냉동고에 보관합니다.
  4. 모든 일회용품은 생물학적 위험 쓰레기통에 버리십시오. 모든 표면(후드 및 프로세서가 만지는 모든 표면)과 후드에서 제거할 품목을 소독합니다.

2. 쥐 배설물 샘플의 무균 수집

알림: 멸균된 기구를 포함한 무균 기술을 사용하십시오.

  1. 마우스를CO2 질식으로 안락사시킨다. 마우스의 가슴과 측면에 70% 에탄올을 뿌리고 피부와 복강을 조심스럽게 열어 위장관을 노출시킵니다.
  2. 맹장을 분리하고 멸균 수술용 가위를 사용하여 반으로 자릅니다. 간단히 말해서 맹장을 노출시키고 회장에서 근위부로 0.5cm, 결장과의 접합부에서 원위부로 0.5cm를 자릅니다. 분리된 맹장을 멸균된 페트리 접시에 옮깁니다.
  3. 멸균 주걱을 사용하여 맹장 내용물을 멸균 튜브로 옮기고 분취액을 -80°C 냉동고에 보관합니다19.
    알림: 장내 박테리아의 대부분은 혐기성 세균이기 때문에 산소에 노출되면 실내 대기에서 격리 절차를 진행하는 동안 유기체가 손상되거나 죽을 수 있습니다. 따라서 분변 샘플은 박테리아의 생존력을 유지하기 위해 혐기성 챔버에서 분리되어야 합니다.

3. 배설물 이식

  1. 신선하거나 이전에 냉동된 배설물 펠릿을 멸균 식염수에 1:20(w:v) 비율로 재현탁하고 균질화될 때까지 소용돌이칩니다.
  2. 균질액을 30μm 공극 나일론 필터에 통과시켜 큰 입자상 물질을 제거합니다. 79 × g 에서 5분 동안 원심분리하고 이식에 사용할 상층액을 수집합니다.
  3. 무균 수용자 마우스당 슬러리 100 μL를 연속 3일 동안 경구 위관영양하고, 2주 동안 3일마다 위관영양법을 투여하였다. 기존 마우스를 사용하여 항생제로 처음 치료받은 경우 장내 미생물총의 메커니즘을 연구하여 수혜자 자신의 고유 미생물군을 제거합니다. 예를 들어, 분변 슬러리의 위관영양법 전에 경구 위관영양법으로 연속 5일 동안 수용자 마우스에게 매일 세프트리악손(400mg/kg)을 투여합니다.
    참고: 연구에 따르면 혈압을 포함한 심혈관 변화를 유도하기 위해서는 최소 2주 이상의 치료가 필요하다고 한다20.
  4. 무균 수용자 마우스가 gnotobiotic film isolators에 단독으로 수용되고 멸균 식품과 물이 공급되는지 확인하십시오.

4. 수축기 혈압 측정

참고: 기존 수용된 3개월 된 C57Bl/6 마우스에서 FMT를 받은 Gnotobiotic 마우스에 2주 동안 저용량 안지오텐신 II(140ng/kg/min)를 주입하기 위해 삼투성 미니 펌프(Alzet, 모델 2002)를 이식했습니다. 혈압은 꼬리 커프 를 통해 매주 모니터링되었습니다. 삼투압 미니펌프를 이식하기 위한 프로토콜은 이전에 보고된바 있다 21. 테일-커프는 아래에 간략하게 요약된 바와 같이 수행되었다. 꼬리 커프와 같은 혈압을 측정하는 비침습적 방법은 영지생물 생쥐의 FMT 연구에 적합합니다. 테일 커프를 수행하는 방법에 대한 자세한 단계는 이전에 설명되었습니다22.

  1. 간단히 말해서, gnotobiotic isolators에서 마우스를 회수하고 테일 커프 기계 플랫폼과 마우스 홀더를 예열합니다.
  2. 의식이 있는 마우스를 가열된 플랫폼에 구속하고 꼬리 커프 혈량 측정법을 사용하여 최소 3라운드의 수축기 압력 측정을 수집합니다. 적절한 측정일 3일 전에 연속 3일 동안 아래 단계를 수행하여 스트레스를 줄이기 위해 마우스를 제지하도록 훈련시킵니다.
    1. 예열 된 홀더에 마우스를 부드럽게 넣고 꼬리를 바깥쪽으로 둡니다. 마우스에 스트레스가 가해지지 않도록 윗부분을 꼬집지 않고 조심스럽게 테이프로 감습니다.
    2. 마우스를 홀더에 놓으십시오. 적응을 위해 시트로 덮인 3-5분 동안 플랫폼에 놓습니다.
  3. 각 동물의 평균 수축기 혈압에 대한 모든 라운드의 측정값을 평균화합니다.

5. 심혈관 변화에 대한 FMT 평가

  1. 혈압 측정 후, 마우스를 안락사시키고 섹션 2에 설명된 대로 맹장 내용물을 무균적으로 수집합니다.
  2. 심장, 대동맥, 간, 장간막 동맥 및 신장을 포함한 장 및 기타 조직을 채취하여 심장 대사 건강에서 장내 미생물총의 역할을 조사합니다. 조직을 채취하려면 마우스에서 조직을 찾아 가위를 사용하여 절제하십시오.
  3. FMT23 후 장내 미생물총의 생착을 확인하기 위해 기증자 및 수용자 마우스에서 수집한 분변 샘플/맹장 내용물에 대한 메타게놈 시퀀싱 분석을 실행합니다. 미생물총의 성공적인 식민지화에 대한 첫 번째 증거는 기증자와 수혜자의 미생물군이 유사하다는 것을 확인하는 것입니다.
  4. 채취한 장 조직에 Swiss-roll 기법(섹션 6 참조)을 사용하여 면역염색 및 조직학과 함께 형태학적 및 세포 발현 변화를 검사한다24.

6. 장 만들기 스위스 롤

  1. 1일차
    1. 70% 에탄올을 살포한 적절하게 안락사된 마우스에서 항문 쪽(후복막에 고정됨)에서 위 쪽으로 마우스 내장을 해부합니다. 분리된 위장관 전체를 인산염 완충 식염수(PBS)가 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다. 위 끝에서 근위 끝을 부드럽게 잡고 주변 지방과 결합 조직을 손으로 제거합니다.
    2. 소장 (맹장에서 두부)을 분리하고 각 길이로 Z 형 지그재그를 만듭니다. 이어서, 십이지장, 공장, 및 회장을 앞서 기술한 바와 같이 연속적으로 절단하여 얻었다25. 맹장 아래의 장 부분을 절단하여 결장을 분리하십시오.
    3. 십이지장, 공장, 회장 및 결장을 자릅니다.
    4. 장을 찢지 않도록 주사기와 볼 팁이 달린 바늘로 PBS를 사용하여 내부를 씻어 내고 씻으십시오.
    5. 내장을 여과지에 올려 놓으십시오. 단면 이름(예: 십이지장)으로 용지에 레이블을 지정한 다음 오른쪽 상단 모서리에 근위부에 'P'를, 오른쪽 하단 모서리에 원위부에 'D'를 표시합니다.
    6. 볼팁 가위로 내장을 세로로 자릅니다. 여과지의 내장을 엽니 다. 필요에 따라 더 많은 PBS로 세척하십시오.
    7. 두 개의 여과지 사이에 내장을 끼우십시오. 내장 근처의 4개 지점/모서리에 여과지를 스테이플링합니다.
    8. 10 % 포르말린 중성 완충액 (인산 나트륨 4.0g, 일 염기성, 인산 나트륨 6.5g, 2 염기성, 37 % 포름 알데히드 100mL, 증류수 900mL)에 담그십시오. 플랫폼 로커를 사용하여 실온에서 5rpm으로 밤새 흔듭니다.
  2. 2일차
    1. 증류수에 2% 아가로스를 준비하고 알루미늄 호일로 덮인 비커에서 교반 막대로 가열합니다.
    2. 조직을 회수하십시오. 상단 여과지를 벗겨냅니다. 근위부에서 내장을 굴려 근위부가 먼저 안쪽으로 들어가도록 하고 안쪽으로 굴려서 내강도 슬라이드 안쪽에 오도록 합니다. 필요에 따라 30G 바늘 또는 두 개로 고정합니다.
    3. 일회용 졸업 파이펫을 사용하여 1mL의 아가로스를 흡인하고 조직의 기포를 피하면서 평평한 표면의 롤링된 내장 섹션에 아가로스를 붓습니다.
    4. 용란증을 식히고 굳히십시오. 면도날을 사용하여 조직 부분 주변의 여분의 아가로스를 다듬습니다.
    5. 조직 처리/내장 카세트에 내장 섹션을 넣습니다(아가로스로 인해 증가된 높이를 수용하기 위해 일반 카세트보다 큼). 4 °C에서 70 % 에탄올에 담그십시오.
    6. 파라핀이 포매된 조직 슬라이드를 준비하고 아래에 설명된 대로 면역염색을 진행합니다.

7. 장의 면역 염색

  1. 탈파라핀화
    1. 랙에 슬라이드가있는 다음 욕조를 통과하십시오 : 3 분 동안 크실렌, 3 분 동안 다시 신선한 크실렌, 3 분 동안 100 % 에탄올 (1 : 1)이 함유 된 크실렌, 3 분 동안 95 % 에탄올, 3 분 동안 70 % 에탄올, 3 분 동안 50 % 에탄올.
    2. 흐르는 차가운 수돗물로 부드럽게 헹굽니다. 수돗물 욕조에 보관하십시오.
  2. 항원 검색
    1. 탈파라핀화 후, 항원 회수 완충액(pH 6에서 0.01M 시트르산삼나트륨 이수화물 및 0.05% 트윈-20)의 수조에서 20분 동안 슬라이드를 끓입니다.
    2. 차가운 수돗물 아래에서 실행하십시오.
  3. 얼룩
    1. 욕조에서 슬라이드를 꺼내고 젖은 실험실 물티슈/종이 타월이 바닥에 있는 슬라이드 상자에 티슈를 뒤집어 놓습니다. 소수성 마커 펜으로 조직 주위에 윤곽을 그립니다.
    2. 트리스 완충 식염수(TBS) + 0.025% 트리톤 X-100을 조직에 떨어뜨리고 5분 동안 배양합니다. 이 단계를 반복합니다.
    3. TBS + 10% 소 태아 혈청(FBS) + 1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 실온에서 2시간 동안 차단합니다. 슬라이드를 옆으로 돌리고 실험실 와이프에서 차단 버퍼를 제거합니다.
    4. 1차 항체 용액을 첨가하고 4°C에서 최소 2시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다. TBS + 0.025% Triton X-100으로 절편에 ~200μL를 부드럽게 피펫팅하여 부드럽게 세척합니다.
    5. 2차 항체 용액을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양한다. 7.3.4단계에서와 같이 피펫으로 헹구어 슬라이드를 TBS로 3 x 5분 동안 헹굽니다.
    6. 장착 매체와 커버슬립이 있는 장착.

결과

위에서 설명한 단계는 그림 1에 요약되어 있습니다. 마우스 맹장 내용물 또는 인간 배설물을 멸균 식염수에 재현탁하여 먼저 연속 3일 동안, 그 다음 3일에 한 번씩 위관영양법으로 무균 마우스(100μL)에게 제공할 슬러리를 제조합니다. 프로토콜이 끝나면 꼬리 커프 방법으로 혈압을 측정하고 마우스를 안락사시키고 조직을 채취하여 장내 미생물총의 변화와 심혈관 및 대사 ?...

토론

심혈관 및 대사 질환에서 장내 미생물총의 인과적 역할을 연구하는 귀중한 접근 방식은 전체 미생물군 또는 선별된 관심 종을 무균 마우스로 옮기는 것입니다. 여기에서 우리는 고혈압 장애에서 장내 미생물총의 역할을 연구하기 위해 인간과 전통적으로 수용된 쥐의 배설물 샘플을 무균 생쥐로 수집하는 프로토콜을 설명합니다.

생쥐에서는 호기성실에서 처리 된 무균 수집 ?...

공개

금전적 또는 기타 이해 상충은 저자에 의해 선언되지 않습니다.

감사의 말

이 연구는 National Center for Advancing Translational Sciences의 Vanderbilt Clinical and Translational Science Award Grant UL1TR002243(to A.K.)의 지원을 받았습니다. 미국 심장 협회 보조금 POST903428 (JAI에); 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소는 K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941(AK로) 보조금을 부여하고 NIH는 1P01HL116263(VK로)을 부여합니다. 그림 1 은 Biorender를 사용하여 생성되었습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoostThermoFisherB40932
Anaerobic chamberCOY7150220
Apolipoprotein AINovus BiologicalsNBP2-52979
Artery Scissors - Ball TipFine Science Tools14086-09
Bleach solutionFisher Scientific14-412-53
Bovine Serum AlbuminFisher ScientificB14
CD3 antibodyThermoFisher 14-0032-82
CD68 monoclonal antibodyThermoFisher14-0681-82
CentrifugeFisher Scientific75-004-221
CODA high throughput monitorKent Scientic CorporationCODA-HT8
Cryogenic vialsFisher Scientific10-500-26
Disposable graduate transfer pipettesFisher Scientific137119AM
Disposable syringesFisher Scientific14-823-2A
EthanolFisher ScientificAA33361M1
Feeding NeedleFine Science Tools18061-38
Filter (30 µm)Fisher ScientificNC0922459
Filter paper sheetFisher Scientific09-802
Formalin (10%)Fisher Scientific23-730-581
High salt dietTekladTD.03142
OMNIgene.GUTDNAgenotekOM-200+ACP102
Osmotic mini-pumpsAlzet MODEL 2002
PAP PenMillipore SigmaZ377821-1EA
Petri dishFisher ScientificAS4050
Pipette tipsFisher Scientific21-236-18C
PipettesFisher Scientific14-388-100
Serile Phosphate-buffered salineFisher ScientificAAJ61196AP
Smart spatulaFisher ScientificNC0133733
Stool collection deviceFisher Scientific50-203-7255
TBS BufferFisher ScientificR017R.0000
Triton X-100Millipore Sigma
9036-19-5
Varimix platform rockerFisher Scientific09047113Q
Vortex mixerFisher Scientific02-215-41
XyleneFisher Scientific1330-20-7, 100-41-4

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